雷宇航，譚 婭，黃志洋，趙夢穎，齊 婧，甘麥鄰，沈林園*，朱 礪*

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點實驗室，成都 611130；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽生物組學(xué)重點實驗室，成都 611130；3. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽 550005）

中國不僅是世界上生豬飼養(yǎng)規(guī)模最大的國家，而且還是世界最大的豬肉消費(fèi)國，豬肉品質(zhì)在很大程度上決定了生豬行業(yè)經(jīng)濟(jì)效益及產(chǎn)業(yè)發(fā)展，因此提高豬肉質(zhì)量成為該行業(yè)重中之重亟需解決的問題[1]。一般意義上，豬肉品質(zhì)包含pH值、嫩度、系水力以及肌內(nèi)脂肪含量等指標(biāo)[2]。在影響豬肉品質(zhì)的諸多因素中，肌內(nèi)脂肪（intramuscular fat，IMF）含量是一項關(guān)鍵指標(biāo)，它與豬肉的嫩度、風(fēng)味、多汁性都具有明顯關(guān)聯(lián)[3]。肌內(nèi)脂肪組織又俗稱“大理石紋”，屬于肌肉脂肪中的一種，由散布在肌纖維束之間的脂肪細(xì)胞組成，是衡量肉類營養(yǎng)和風(fēng)味的重要指標(biāo)[4]。目前普遍認(rèn)為豬肉最佳肌內(nèi)脂肪含量在2%～3%之間，當(dāng)肌內(nèi)脂肪含量高于3%時，豬肉口感變得太過油膩會降低消費(fèi)者購買意愿；而肌內(nèi)脂肪含量太低則會導(dǎo)致豬肉品質(zhì)下降，因此合理控制肌內(nèi)脂肪含量成為了本行業(yè)的研究重點[5-6]。

有研究顯示豬肌內(nèi)脂肪包括肌纖維內(nèi)的脂滴沉積在肌纖維之間和肌纖維束之間的脂肪，其發(fā)育和代謝過程與身體其他部位的脂肪有明顯的差別[7]。肌肉中能分化為脂肪細(xì)胞的干細(xì)胞有兩種，即脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）和肌肉衛(wèi)星細(xì)胞（MSCs）。這兩種細(xì)胞之間存在密切聯(lián)系，其中ADSCs 能夠分泌一些調(diào)控因子，調(diào)控MSCs 增殖以及向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[8-10]。另外，在胰島素、地塞米松、3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤和羅格列酮等成脂誘導(dǎo)因子的作用下，體外培養(yǎng)的間充質(zhì)來源不同的細(xì)胞（包括衛(wèi)星細(xì)胞）同樣能夠向脂肪細(xì)胞分化[11-13]。這些研究表明肌內(nèi)脂肪既可由肌肉內(nèi)前體脂肪細(xì)胞發(fā)育而來，也可通過MSCs 轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞這一調(diào)控機(jī)制進(jìn)行，并且肌內(nèi)脂肪含量與MSCs的增殖和成脂轉(zhuǎn)分化過程息息相關(guān)[14-16]。

ACACA屬于羧化轉(zhuǎn)移家族的成員，是脂肪酸代謝過程中的關(guān)鍵因子，其序列753-818處有生物素/硫辛酸附著位點[17]。該酶在哺乳動物中以兩種方式存在，分別為ACACA基因編碼的ACC-1 以及ACACB基因編碼的ACC-2，兩者具有高度的相似性，互為同工酶。其中ACC2 主要存在于脂肪分化活躍的組織，其作用是催化脂肪酸的氧化；而ACC-1主要存在于哺乳動物肝臟和脂肪組織內(nèi)，能參與脂肪酸合成代謝，催化乙酰輔酶A羧化成不飽和脂肪酸合成起始產(chǎn)物，即丙二酰輔酶A[18]。丙二酰輔酶A 是線粒體內(nèi)β 氧化的重要調(diào)控因子，充當(dāng)不飽和脂肪酸合成的限速酶，可直接影響人類的脂類代謝[19-22]。在前期本研究團(tuán)隊已經(jīng)證實ACACA在高肌內(nèi)脂肪含量的豬群體中呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢[23]。另外據(jù)相關(guān)研究表明，ACACA基因在高肌內(nèi)脂肪含量的萊蕪豬肌肉中的表達(dá)量明顯高于肌內(nèi)脂肪含量低的DLY 豬，ACACA與肌內(nèi)脂肪含量呈現(xiàn)正相關(guān)[24]。D. Gallardo 等[25]研究也發(fā)現(xiàn)，在杜洛克豬中ACACA基因的兩個連鎖同義突變對肌肉中脂肪酸組成（包括多不飽和/飽和脂肪酸比值）有顯著影響，這些研究均提示ACACA與豬肌內(nèi)脂肪有相關(guān)性。

因此，本研究以豬MSCs為模型，通過體外培養(yǎng)誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)分化，模擬肌內(nèi)脂肪的生成，探究干擾ACACA基因后對豬MSCs 增殖凋亡及轉(zhuǎn)分化的影響，進(jìn)而揭示其成脂轉(zhuǎn)分化的分子機(jī)制，為研究豬肌內(nèi)脂肪生成分子調(diào)控機(jī)制和改善豬肉品質(zhì)提供有關(guān)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

胎牛血清（FBS）、DMEM/F12 培養(yǎng)基購于Gibco公司；油紅O 染液、胰島素（insulin）、地塞米松（DEX）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）和羅格列酮（Rosiglitazone）購于Sigma公司；甘油三酯（TG）檢測試劑購于南京建成生物工程研究所；Trizol（總RNA 抽提試劑）購于Invitrogen 公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒購于日本DOJINDO 公司；PI/Rnase Cell cycle staining Buffer 細(xì)胞周期試劑盒購于美國BD 公司；Lipofectamine?3000 轉(zhuǎn)染試劑購于ThermoFisher 公司；Prime Script Reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒和SYBR Permix Ex Taq Kit 購于TaKaRa 公司；qRT-PCR 引物合成于擎科生物公司（成都）；使用CFX96熒光定量儀（Bio-Rad，美國）、Cytoflex 流式細(xì)胞儀（Backman，美國）、酶標(biāo)儀（Thermo，美國）、Olympus IX53 熒光顯微鏡（Olympus，日本）。

1.2 試驗方法

1.2.1 豬原代肌衛(wèi)星細(xì)胞體外分離

無菌采取3 日齡的DLY 仔豬背最長肌組織，用含3%雙抗的PBS緩沖溶液清洗3～5次，剔除血管和結(jié)締組織，用手術(shù)剪剪成肉糜狀。經(jīng)Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶消化后，將消化液用100 μm 的細(xì)胞篩過濾，1 000 g/min轉(zhuǎn)速離心10 min后倒掉上清，收集底部細(xì)胞，加入20%培養(yǎng)基重懸，鋪瓶，將培養(yǎng)瓶置于含5% CO2，37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。由于原瓶中細(xì)胞種類較多，含有大量成纖維細(xì)胞、骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞、組織等，其中成纖維細(xì)胞具有較強(qiáng)的貼壁能力最強(qiáng)[26]，因此在3 h后將原瓶中上清液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，未貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)一次，最終采用差速貼壁法對豬MSCs進(jìn)行分離純化。

1.2.2 豬原代肌衛(wèi)星細(xì)胞傳代與誘導(dǎo)成脂轉(zhuǎn)分化

待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，經(jīng)胰蛋白酶消化后，按照1∶3 的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)到90%時，將完全培養(yǎng)基更換為成脂誘導(dǎo)A 液（DMEM+20% FBS+1%雙抗+1 μmol/L DEX+20 μg/mL Insulin+0.5 mmol/L IBMX+10 μmol/L Rosiglitazone），培養(yǎng)2 d 之后，更換為成脂誘導(dǎo)B 液（DMEM+20% FBS+1%雙抗+20 μg/mL Insulin），每2 d換液一次，并在顯微鏡下拍照記錄。

1.2.3 小干擾RNA（siRNA-ACACA）的合成

針對豬的ACACA基因的保守序列，由吉瑪基因（Gene Pharma）公司（上海）設(shè)計并合成3 條小干擾RNA，序列見表1。

表1 ACACA的siRNA序列Table 1 The siRNA sequence of ACACA

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

為了探究siRNA-ACACA對豬原代肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖凋亡以及轉(zhuǎn)分化的影響，將細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別在增殖期和轉(zhuǎn)分化期將3 種小干擾RNA（si-ACACA1、si-ACACA2、si-ACACA3）和一組對照組（NC）轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，每組處理設(shè)置3個重復(fù)。轉(zhuǎn)染液按照Lipofectamine? 3000說明書進(jìn)行配制。

1.2.5 CCK-8細(xì)胞增殖檢測

將細(xì)胞接種至96 孔板，每組處理6 個孔，每個孔100 μL 細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板置于含5% CO2，37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到30%時轉(zhuǎn)染細(xì)胞并換增殖培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，設(shè)定5 個時間點（0、12、24、48、72 h）向待檢測細(xì)胞孔中加入10 μL CCK-8檢測試劑，孵育1.5 h后利用酶標(biāo)儀檢測在450 nm 波長處的OD 值，確定細(xì)胞增殖活力。

1.2.6 流式細(xì)胞檢測

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，并以1 000 r/min離心5 min（收集約6×105個細(xì)胞）。加入4 ℃ 70%乙醇2 mL，于冰上處理30 min。加入2 mL 4 ℃的PBS 液，旋渦混勻300 g 離心5 min，重復(fù)此步驟。加入500 μL 的PI/Rnase staining Buffer，4 ℃孵育30 min，加入2 mL 的PBS 液洗滌一次，加入400μL的PBS液重懸細(xì)胞。使用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，采用Modfit軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.7 甘油三酯檢測

收集轉(zhuǎn)分化第8 天的細(xì)胞培養(yǎng)液上清，參考甘油三酯試劑盒說明書，利用酶標(biāo)儀操作比色法測定上清液中甘油三酯的相對含量。

1.2.8 油紅O染色

MSCs 在轉(zhuǎn)分化第8 天時用4%多聚甲醛固定1 h，PBS漂洗3 min，60%異丙醇沖洗15 s，促進(jìn)中性脂肪的染色。隨后在避光處用油紅O 染液浸染15 min，每個處理組隨機(jī)選取5 個點在倒置熒光顯微鏡下拍照，并用Image J軟件量化脂滴面積。

1.2.9 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

用Trizol 試劑裂解細(xì)胞，加入氯仿使溶液分為水相和有機(jī)相，吸取上層水相用異丙醇沉淀回收RNA。隨后使用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RTPCR 檢測增殖、分化相關(guān)基因表達(dá)水平。PCR 反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex Taq? 5 μL，DEPC 水3 μL，上下游引物各自0.5 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共計40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，使用2-△△Ct方法計算目的基因的相對表達(dá)含量[27]。qRT-PCR反應(yīng)的引物序列見表2。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 The primer sequence for qRT-PCR

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，使用獨立樣本t檢驗進(jìn)行差異顯著性檢驗。數(shù)據(jù)均以平均值（mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation，SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬MSCs分離培養(yǎng)結(jié)果

剛分離下來的豬原代肌衛(wèi)星細(xì)胞在明場下觀察呈現(xiàn)亮白小圓點，懸浮于培養(yǎng)液之中（圖1A）。培養(yǎng)6 h之后，轉(zhuǎn)移上清液至新培養(yǎng)瓶，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，此時上清液中少量原代肌衛(wèi)星細(xì)胞開始在培養(yǎng)瓶上貼壁，呈現(xiàn)細(xì)胞樣，向四周伸展；未貼壁細(xì)胞依舊呈現(xiàn)圓形白點狀（圖1B）。培養(yǎng)24 h 之后，絕大多數(shù)細(xì)胞貼壁（圖1C），此時更換培養(yǎng)液，去除仍未貼壁細(xì)胞。經(jīng)過48 h 后，細(xì)胞大量增殖，細(xì)胞形態(tài)逐漸呈現(xiàn)出纖維狀或梭形（圖1D）。

圖1 不同培養(yǎng)時間豬原代肌衛(wèi)星細(xì)胞形態(tài)Figure 1 The morphology of porcine primary muscle satellite cells at different culture time

2.2 siRNA-ACACA的干擾效率

qRT-PCR 檢測結(jié)果如圖所示（圖2），與NC 未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染si-ACACA之后ACACA的mRNA表 達(dá) 量 均 下 降，且si-ACACA1、si-ACACA2、si-ACACA3 的干擾效率分別為56.04%、88.43%、72.06%。其中si-ACACA2 干擾效率最好，較NC 組有極顯著差異（P＜0.000 1），從而篩選出si-ACACA2對豬MSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用于后續(xù)實驗。

圖2 siRNA-ACACA的篩選Figure 2 The screening result of siRNA-ACACA

2.3 干擾ACACA基因?qū)ωiMSCs增殖的影響

轉(zhuǎn)染24 h之后，通過CCK-8試劑盒測定細(xì)胞活力，結(jié)果顯示：當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到12 h 和24 h 時，NC 組與si-ACACA2 組在450 nm 處OD 值基本相同，細(xì)胞數(shù)目沒有明顯差異；當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到48 h 時，si-ACACA2 組OD 值顯著低于NC 組（P＜0.05）；當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到72 h 時，si-ACACA2 組OD 值極顯著低于NC組（P＜0.01）（圖3A）。

轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h 后，經(jīng)過流式檢測分析發(fā)現(xiàn)，si-ACACA2組相比于NC組，G0/G1期細(xì)胞比率由53.15%（55.3±2.66）上升到60.67%（60.32±0.36）（P＜0.05），G2/M 期變化差異不大，S 期細(xì)胞數(shù)量由35.47%（33.05±3.35）下降到27.47%（28.44±0.97）（P＜0.05）（圖3B和C）。

圖3 干擾siRNA-ACACA后對豬原代肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響Figure 3 Effect of interfering siRNA-ACACA on proliferation of porcine primary muscle satellite cells

實時熒光定量PCR 檢測細(xì)胞增殖相關(guān)基因（Cyclin D1、Cyclin E）的表達(dá)量，結(jié)果顯示：干擾ACACA能 夠 降 低Cyclin D1（P＜0.05）（圖3D）和Cyclin E（P＜0.000 1）的表達(dá)量（圖3E）。

以上結(jié)果表明：抑制ACACA基因之后，豬MSCs活性和新生細(xì)胞比率均極顯著低于對照組，細(xì)胞周期相關(guān)基因Cyclin D1和Cyclin E表達(dá)量顯著降低，G0/G1 期細(xì)胞比例顯著增多（P＜0.05），而S 期細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05）。說明干擾ACACA可抑制豬MSCs 從G1 期向S 期轉(zhuǎn)變，從而導(dǎo)致G0/G1 期阻滯，細(xì)胞增殖受到抑制。

2.4 干擾ACACA基因?qū)ωiMSCs凋亡的影響

轉(zhuǎn)染24 h后，利用qRT-PCR檢測凋亡標(biāo)志基因在細(xì)胞樣本中的表達(dá)量。結(jié)果顯示，si-ACACA2 組與NC組相比，BAX表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），BCL-2表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）（圖4A和B）。由此可以推測，干擾ACACA基因可以顯著促進(jìn)豬MSCs凋亡。

圖4 干擾siRNA-ACACA 24 h后對豬原代肌衛(wèi)星細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Effect of interfering siRNA-ACACA after 24 h on apoptosis of porcine primary muscle satellite cells

2.5 誘導(dǎo)豬MSCs轉(zhuǎn)分化結(jié)果

增殖期細(xì)胞融合度達(dá)100%時，更換成脂誘導(dǎo)液，繼續(xù)培養(yǎng)至8 d左右，細(xì)胞形態(tài)逐漸由纖維狀變?yōu)闄E圓形，并且伴隨有明顯脂滴出現(xiàn)，豬原代肌衛(wèi)星細(xì)胞成功轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞（圖5A）。通過實時熒光定量PCR 分別對轉(zhuǎn)分化不同時期的細(xì)胞進(jìn)行成脂和成肌相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)量的檢測，進(jìn)一步驗證脂肪細(xì)胞的形成，結(jié)果如下圖所示：成脂相關(guān)基因C/EBPα的表達(dá)量在轉(zhuǎn)分化時期顯著高于第0天，并且在第2 天左右表達(dá)量達(dá)到最高，隨后開始逐漸降低（圖5B）；成肌相關(guān)的基因MyoD和MyoG的表達(dá)量與轉(zhuǎn)分化第0 天相比均呈現(xiàn)極顯著下降的趨勢（P＜0.001），其中MyoD的表達(dá)量從第2 天開始逐漸升高，而MyoG的表達(dá)量逐漸遞減，到第8 天時表達(dá)量最低（圖5C 和D）。成肌基因與成脂基因的表達(dá)量變化在豬MSCs 轉(zhuǎn)分化時期呈現(xiàn)相反趨勢，成功誘導(dǎo)豬MSCs向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

圖5 誘導(dǎo)MSCs轉(zhuǎn)分化結(jié)果Figure 5 The result of induced transdifferentiation of MSCs

2.6 干擾ACACA 基因?qū)ωiMSCs 成脂轉(zhuǎn)分化的影響

轉(zhuǎn)染之后，對轉(zhuǎn)分化第8 天細(xì)胞進(jìn)行油紅O 染色發(fā)現(xiàn)，si-ACACA2 組中紅色脂滴產(chǎn)生量明顯少于NC 組，并且脂滴大小也明顯小于NC 組（圖6A 和B）。檢測甘油三酯含量同樣發(fā)現(xiàn)，si-ACACA2 組中甘油三酯的含量顯著低于NC 組（圖6C）。因此，干擾ACACA基因可以阻礙豬MSCs轉(zhuǎn)分化時期脂肪沉積作用。

圖6 干擾ACACA后對豬原代肌衛(wèi)星細(xì)胞轉(zhuǎn)分化時脂滴形成的影響Figure 6 The effect of ACACA interference on lipid droplet formation during transdifferentiation of porcine primary muscle satellite cells

3 討論

ACACA基因定位在豬的12號染色體，其編碼的乙酰輔酶A 羧化酶α 屬于羧化轉(zhuǎn)移家族成員，是脂肪酸從頭合成途徑中的關(guān)鍵酶，可促進(jìn)乙酰輔酶A轉(zhuǎn)變?yōu)楸釂熙］o酶A，能提供脂肪酸合成所需的二碳單位[28]。有研究表明ACACA轉(zhuǎn)錄水平含量決定細(xì)胞和/或個體脂肪酸合成，維持正常生存。如楊青[29]發(fā)現(xiàn)在谷氨酸棒桿菌中過表達(dá)ACACA可顯著促進(jìn)脂肪酸合成，提升效率接近2倍之多。相反，當(dāng)ACACA基因受到抑制后，脂肪酸的合成明顯受到阻礙，并且對多種細(xì)胞的增殖及個體生長發(fā)育會產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用。Liao T.等[30]通過抑制KMT5A的表達(dá)間接抑制了ACACA的表達(dá)，從而可使人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系（PTC）的增殖減弱，并促進(jìn)其凋亡。E. C. Jessica 等[31]通過雙轉(zhuǎn)染siRNA 直接抑制ACC1和ACC2 mRNA 水平的表達(dá)量，同樣發(fā)現(xiàn)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖受到抑制，并且其新生脂肪產(chǎn)生量也顯著降低。Zhang H.等[32]發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中ACACA的表達(dá)量非常高，與前列腺癌細(xì)胞增殖速度快有一定相關(guān)性，但是沉默ACACA的表達(dá)可以抑制前列腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，研究還揭示ACACA對前列腺癌細(xì)胞增殖調(diào)控的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其是通過影響NAD+/NADH、線粒體ATP 產(chǎn)量、mtDNA 和ROS 水平的平衡，干擾線粒體的正常功能，從而降低細(xì)胞的增殖能力。程婧等[33]在對腎透明細(xì)胞癌研究同樣發(fā)現(xiàn)下調(diào)腎透明細(xì)胞癌786-O和Caki-1細(xì)胞中ACACA的表達(dá)，能抑制細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1和CDK4表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞增殖。在活體實驗上，L. Abu-Elheiga等[34]發(fā)現(xiàn)雙敲除ACACA基因，對小鼠胚胎具有顯著致死效應(yīng)。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)通過在體外培養(yǎng)的豬MSCs中干擾ACACA基因可導(dǎo)致細(xì)胞增殖受阻，細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，并且伴隨細(xì)胞周期標(biāo)志基因（Cyclin D1、Cyclin E）的表達(dá)量顯著下降。細(xì)胞凋亡相關(guān)基因BAX顯著升高，BCL-2顯著下降，從而加速豬MSCs 凋亡。這些結(jié)果提示MSCs 干擾ACACA后增殖受阻與G0/G1期阻滯以及細(xì)胞凋亡增強(qiáng)密切相關(guān)。

豬肌內(nèi)脂肪的形成不僅與遺傳因素有關(guān)，而且更多受到營養(yǎng)條件的影響。動物骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞作為肌內(nèi)脂肪形成的細(xì)胞之一，可以通過體外添加胰島素、羅格列酮、地塞米松等進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，促進(jìn)向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化[16,26,35]。其中胰島素作為機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，可以促進(jìn)脂肪的合成[36]；羅格列酮則是PPARγ的激動劑，通過激活脂肪細(xì)胞標(biāo)志物脂蛋白脂酶（LPL）的表達(dá)以及下調(diào)絲裂原激活蛋白激酶激酶3（MAP2K3）的表達(dá)來誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的形成[37]；DEX 可以促進(jìn)C/EBPα的表達(dá)，而C/EBPα是脂肪形成過程中的關(guān)鍵因子[38]。因此無論成肌細(xì)胞是否有內(nèi)在成脂能力，均可通過PPARγ和C/EBPα這兩種成脂轉(zhuǎn)分化因子的異位表達(dá)來誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化為成熟脂肪細(xì)胞。閆研[12]研究表明通過上調(diào)延邊牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中PPARγ的表達(dá)，可以促進(jìn)肌肉衛(wèi)星細(xì)胞成脂轉(zhuǎn)分化。皇甫一凡[39]研究證明，在牛成肌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)C/EBPα同樣也可以誘導(dǎo)成肌細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。另外，C. Fux 等[40]研究證實，C2C12 成肌細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中，脂肪細(xì)胞的形成僅在C/EBPα表達(dá)最高時發(fā)生，這也說明C/EBPα的高表達(dá)對于成脂轉(zhuǎn)分化至關(guān)重要。因此，本研究通過體外添加胰島素、羅格列酮、地塞米松等，進(jìn)而上調(diào)MSCs 內(nèi)C/EBPα的表達(dá)，檢測了成脂相關(guān)基因C/EBPα和成肌相關(guān)的基因MyoD、MyoG在轉(zhuǎn)分化過程中表達(dá)量的變化，成功誘導(dǎo)MSCs 向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。其中C/EBPα基因作為脂肪細(xì)胞形成的標(biāo)志物，其表達(dá)量在轉(zhuǎn)分化時期極顯著高于轉(zhuǎn)分化開始。而生肌調(diào)節(jié)因子家族（myogenic regulatory factors， MRFs）中的生肌決定因子（MyoD）和肌生成素（MyoG）在肌肉的形成和分化起著重要作用，前者對于成肌細(xì)胞分化起決定性作用，而MyoG則是分化后期形成肌管和肌纖維所必需的。在轉(zhuǎn)分化過程中，猜測是由于肌衛(wèi)星細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，從而抑制肌管的形成，導(dǎo)致MyoD和MyoG的表達(dá)量則始終低于轉(zhuǎn)分化開始時，具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步驗證。在表觀層面，通過油紅O染色顯示干擾ACACA基因后會明顯阻礙轉(zhuǎn)分化時期脂滴的累積過程，抑制了脂肪沉積過程。

4 結(jié)論

本研究以豬MSCs 體外培養(yǎng)為模型，探究出干擾ACACA后抑制豬MSCs的增殖，促進(jìn)其凋亡，并且減少成脂轉(zhuǎn)分化時脂肪的沉積。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究ACACA在豬肌內(nèi)脂肪生成分子調(diào)控機(jī)制和改善豬肉品質(zhì)提供實驗參考和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。