張 祥，黃 瑜，蔡 佳，簡紀常，王 蓓

（廣東海洋大學水產(chǎn)學院/廣東省水產(chǎn)動物病害防控與健康養(yǎng)殖重點實驗室/水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制廣東省普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524088）

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactis）屬革蘭陽性菌，是一種人、畜及水產(chǎn)動物共患的致病菌，近年在羅非魚養(yǎng)殖中呈高暴發(fā)態(tài)勢，造成巨大的經(jīng)濟損失[1,2]。腦是無乳鏈球菌感染的一個重要靶器官[3]，感染機制是無乳鏈球菌通過黏附吞噬細胞逃避免疫，后隨巨噬細胞游走侵染其他組織，并透過血-腦屏障引發(fā)腦膜炎破壞腦-神經(jīng)系統(tǒng)，最終由于過度炎癥反應，魚體免疫系統(tǒng)崩潰[4]。

微小核糖核酸155（microRNA-155，miR-155）是由23 個核苷酸組成的一組單鏈小分子RNA，在基因表達的轉(zhuǎn)錄后水平上起著重要的調(diào)節(jié)作用[5]，其在炎癥反應的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-155通過與靶mRNA的3＇-非翻譯區(qū)（3＇-untranslated region，3＇-UTR）堿基互補配對，阻礙靶mRNA的翻譯或?qū)е缕浣到鈁6]，miR-155與炎癥反應等病理過程息息相關[7,8]。本課題組前期工作發(fā)現(xiàn)，感染無乳鏈球菌后包括miR-155 在內(nèi)的多個miRNA 在尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）腦及免疫器官中呈顯著的時間依賴性表達，這進一步說明miR-155 的表達水平與炎癥反應密切相關[9]。目前關于miR-155 與靶基因互作調(diào)控機體炎癥反應的報道多集中于哺乳動物中，如在小鼠的特應性皮炎和人體的潰瘍性結腸炎中均有miR-155參與并發(fā)揮作用[10,11]。細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子5（Suppressor of cytokine signaling 5，SOCS5）屬于免疫抑制分子家族，是一類調(diào)控細胞因子信號通路的負反饋調(diào)節(jié)劑，可以被多種細胞因子誘導而產(chǎn)生，又可反過來抑制眾多促炎癥因子[12,13]。如TNF-α、IL-6等是JAK/STAT 通路上重要的負性調(diào)節(jié)因素。目前關于SOCS5參與炎癥反應的相關報道主要集中在人、小鼠等哺乳動物中[14,15]，關于SOCS5與miRNA 互作參與炎癥反應的機制尚未見報道。

基于此，本研究通過生物信息學分析和qRTPCR、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒瑱z測無乳鏈球菌感染后尼羅羅非魚腦星形膠質(zhì)細胞中miR-155 和SOCS5基因表達模式，預測miR-155 和SOCS5的靶結合位點，構建尼羅羅非魚SOCS5基因野生型和突變型報告質(zhì)粒，驗證miR-155和SOCS5的靶向關系，通過進一步過表達和敲降miR-155，檢測miR-155對SOCS5基因表達的影響和調(diào)控模式，為后續(xù)深入研究miR-155靶向SOCS5在無乳鏈球菌誘導機體炎癥反應中的作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞及菌株 尼羅羅非魚星形膠質(zhì)細胞系TA-02 由本課題組分離并建系成功[16]。細胞在含體積分數(shù)10%的胎牛血清、體積分數(shù)1%青鏈霉素混合液的L15 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。HEK-293T 細胞系由廣東省水產(chǎn)動物病害防控與健康養(yǎng)殖重點實驗室保存。細胞在含體積分數(shù)10%胎牛血清、體積分數(shù)1%青鏈霉素混合液的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。無乳鏈球菌ZQ0910 株由廣東省水產(chǎn)動物病害防控與健康養(yǎng)殖重點實驗室保存[17]。

1.1.2 主要試劑 pGL3-Basic、PRL-TK 雙熒光素酶質(zhì)粒（本實驗室保存）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（碧云天生物技術公司）；RNA 提取（TransZol Up Plus RNA Kit）、cDNA合成（TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix）及熒光定量（TransStart Green qPCR Super Mix）試劑（北京全式金生物公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibico）；LipofectamineTM3000（賽默飛世爾科技）；Endo-free Plasmid Mini Kit I質(zhì)粒小提試劑盒、Universal DNA Purification Kit DNA 純化回收試劑盒（Omega Bio-Tek）；KpnI、SmaI 內(nèi)切酶（寶日生物技術（北京）有限公司）；所有引物和尼羅羅非魚miR-155 mimics、miR-155 inhibitor 及其mimics NC、inhibitor NC 均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2 方法

1.2.1 無乳鏈球菌感染TA-02 細胞實驗 將無乳鏈球菌ZQ0910 菌株和培養(yǎng)基按體積比1∶100 的比例接種到BHI 液體培養(yǎng)基中進行活化、擴大培養(yǎng)，37 ℃震蕩培養(yǎng)至飽和，離心收集菌體，用1×磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.3±0.1）沉淀菌體，重復兩次將培養(yǎng)液清洗干凈，用PBS重懸菌體至終濃度為1×107cfu/mL 備用。取生長狀態(tài)良好的TA-02 細胞，消化，計數(shù)，接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，細胞密度達80%時。每孔加入5 μL無乳鏈球菌菌懸液與TA-02細胞共孵育，分別在0、2、4、6 h收集細胞。吸去培養(yǎng)液，用PBS（pH 7.3 ± 0.1）洗滌2次，每孔加1 mL Trizol Reagent混勻，室溫放置5 min，轉(zhuǎn)移到無RNase 的EP 管中，-80 ℃凍存，待同一批各個時間點收集完畢后一并提取RNA。

1.2.2 TA-02 細胞RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)TransZol Up Plus RNA Kit 說明書提取羅非魚腦星形膠質(zhì)細胞RNA。取1 μL 的RNA 檢測其濃度，瓊脂凝膠電泳檢測RNA 的質(zhì)量。按照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix說明書將提取的羅非魚腦星形膠質(zhì)細胞總RNA 反轉(zhuǎn)成cDNA。

通過NCBI 設計尼羅羅非魚SOCS5定量引物，從miRNA Base 數(shù)據(jù)庫（http://www.mirbase.org）獲取尼羅羅非魚miR-155 成熟體序列，莖環(huán)法合成miR-155 莖環(huán)引物和定量引物。miRNA 須加入特異莖環(huán)引物進行逆轉(zhuǎn)錄為模板，miRNA 逆轉(zhuǎn)錄方法參考廖寧馨[18]的方法進行。

1.2.3 無乳鏈球菌誘導TA-02 細胞中miR-155、炎癥因子和SOCS5基因表達量檢測 通過羅氏LightCycler96實時熒光定量PCR 儀檢測感染無乳鏈球菌的TA-02中miR-155和SOCS5基因的相對表達量，觀察其隨時間變化而變化的規(guī)律。以TA-02 細胞cDNA為模板，qPCR 反應體系參考TransStart Green qPCR Super Mix 說明書進行，反應程序為：95 ℃預熱60 s；95 ℃10 s、60 ℃20 s、72 ℃20 s，40 個循環(huán)。檢測SOCS5基因和miR-155 的相對表達量，以β-actin 為內(nèi)參基因，每組設3 個重復，用2-ΔΔCT法計算結果。

1.2.4 生物信息學分析 從miRNA Base 數(shù)據(jù)庫（http://www.Mirbase.org）獲得尼羅羅非魚miR-155成熟體序列，對比在各個物種間的保守性，利用生物信息學方法（TargetScan、PicTar、miRanda）分析預測SOCS5與miR-155 的靶向關系及靶位點，NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取尼羅羅非魚SOCS5基因3＇UTR序列。

1.2.5 引物設計與PCR 擴增 根據(jù)NCBI 中查找的尼羅羅非魚SOCS5基因3＇UTR 序列設計PCR 擴增引物，在序列兩端添加KpnI、SmaI 酶切位點，克隆得到野生型序列（WT）。同時對SOCS5結合位點堿基進行突變，使用搭橋法（重疊PCR）設計SOCS5基因PCR 擴增引物，克隆得到突變型序列（mut）。并根據(jù)SOCS5基因3＇UTR 序列設計定量引物（包含結合位點），送生工生物工程（上海）有限公司合成，擴增片段大小為533 bp。以TA-02細胞cDNA為模板，擴增SOCS53＇UTR 序列，PCR 擴增體系：（總體積20 μL）Extaq 酶10 μL，上下游引物（33 μg/mL)添加各1 μL，模板1 μL，ddH2O 7 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共34個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR 擴增產(chǎn)物進行質(zhì)量分數(shù)1%瓊脂糖電泳分析。

1.2.6 產(chǎn)物純化與酶切 根據(jù)Universal DNA Purification Kit DNA 純化回收試劑盒說明書進行產(chǎn)物純化，用限制性內(nèi)切酶KpnI、SmaI分別對純化產(chǎn)物和pGL3-Basic 質(zhì)粒進行雙酶切，對酶切產(chǎn)物進行回收純化。酶切體系（50 μL）：載體和SOCS5純化產(chǎn)物各1 000 ng/μL，KpnI、SmaI 各2 μL，10×Buffer 5 μL，ddH2O 補足50 μL。37 ℃酶切30 min。酶切后的載體和SOCS5基因片段純化步驟同產(chǎn)物純化。

1.2.7 連接轉(zhuǎn)化和測序鑒定 根據(jù)T4 DNA Ligase說明書將酶切純化后的目的片段與pGL3-Basic載體進行連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α 感受態(tài)細胞，加入LB（無抗生素）培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min 震蕩培養(yǎng)1～2 h。離心后留100 μL 菌液混勻沉淀，涂于含100 μg/mL Amp 抗生素的LB 固體瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)12～16 h。挑取單菌落，進行菌落PCR。對陽性克隆進行測序，序列比對分析正確后，提取質(zhì)粒保存，質(zhì)粒提取根據(jù)Endo-free Plasmid Mini Kit I 質(zhì)粒小提試劑盒說明進行。

2011年，在立足博愛竹林資源現(xiàn)狀的基礎上提出的博愛竹林發(fā)展目標、總體布局和保護利用等重點工程，通過了我國首個國家級專家評審的縣級產(chǎn)業(yè)規(guī)劃——《博愛縣竹林資源保護利用總體規(guī)劃》，對于保護利用竹林稀缺資源、弘揚竹產(chǎn)業(yè)文化具有重要意義[29]。

1.2.8 細胞轉(zhuǎn)染與雙熒光素酶活性檢測 對數(shù)生長期的HEK-293T細胞在細胞密度達到80%左右時接種到24 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入500 μL 在37 ℃（含體積分數(shù)5% CO2）的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)（濃度為1×106mL-1）。細胞匯合度70%～90%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法和用量按照Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染說明書進行。實驗共分為6組：pGL3-Basic-NC+miR-155 mimics-NC 組、pGL3-Basic-NC+miR-155 mimics組、SOCS5-3＇UTR-WT+miR-155 mimics-NC 組、SOCS5-3＇UTR-WT+miR-155 mimics 組、SOCS5-3＇UTR-mut+miR-155 mimics-NC 組、SOCS5-3＇UTRmut+miR-155 mimics組，每組設3個復孔，每孔總體積50 μL。6 h 后，更換含血清的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后收集細胞培養(yǎng)物。轉(zhuǎn)染48 h 后吸出培養(yǎng)基，根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測各組熒光素酶活性。

1.2.9 miR-155 對SOCS5 表達量的影響 將miR-155 mimics、mimics NC、miR-155 inhibitor、inhibitor NC 分別轉(zhuǎn)染HEK-293T 細胞，48 h 后收集細胞樣本，進行RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR 檢測miR-155 的表達量，評估m(xù)imics 及inhibitor 的效果。將miR-155 mimics、mimics NC、miR-155 inhibitor、inhibitor NC 分別和SOCS5共轉(zhuǎn)染HEK-293T 細胞，48 h 后收集細胞樣本，進行RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄，利用熒光定量PCR 檢測SOCS5基因的相對表達量。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，每組設置3 個重復，用2-ΔΔCT方法計算結果。

1.2.10 質(zhì)粒和miR-155 inhibitor 共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞 將miR-155 mimics 和miR-155 inhibitor 以及SOCS5野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T 細胞。miR-155 mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染濃度為20 μmol/μL，每孔以體積比1:1 的比例將miR-155 mimics/inhibitor 與SOCS5-WT-3'UTR 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T 細胞，共轉(zhuǎn)染miR-155 mimics 和SOCS5-WT-3'UTR 質(zhì)粒做對照。分別在轉(zhuǎn)染后6 h 和12 h 收集細胞樣本，實時熒光定量PCR檢測miR-155和SOCS5表達量。

1.2.11 HEK-293T 細胞RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 吸去細胞培養(yǎng)液，PBS（pH 7.3±0.1）洗滌2 次，加入1 mLTrizol Reagent，充分混勻，室溫放置5 min，轉(zhuǎn)移到無RNase 的EP 管中，-80 ℃凍存，待同一批各個時間點樣品收集完畢后一并提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后cDNA放-20 ℃保存。

1.2.12 轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor 后尼羅羅非魚miR-155 和SOCS5 表達量檢測 通過羅氏LightCycler96實時熒光定量PCR 儀檢測共轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor后HEK-293T 細胞中miR-155 和SOCS5基因的相對表達量。以上述反轉(zhuǎn)錄的HEK-293T 細胞cDNA 為模板，檢測SOCS5和miR-155 的相對表達量，以GAPDH 為內(nèi)參，每組設置3 個重復，用2-ΔΔCT方法計算結果。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實驗進行3 次重復，數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 分析數(shù)據(jù)，結果用均值± 標準差表示。采用單因素方差分析進行多組間比較，采用t檢驗進行組間比較，以P＜0.05 作為差異顯著的標準，使用GraphPad Prism 8.0.1軟件作圖。

2 結果

2.1 無乳鏈球菌感染對TA-02 細胞中miR-155 和SOCS5基因表達的影響

圖1 無乳鏈球菌感染TA-02細胞中的miR-155和SOCS5表達Fig.1 Expression of miR-155 and SOCS5 in TA-02 cells infected with Streptococcus agalactiae

2.2 無乳鏈球菌感染對TA-02細胞中炎癥因子表達的影響

無乳鏈球菌ZQ0910感染TA-02細胞0、2、4、6 h，實時熒光定量PCR 檢測炎癥因子表達量如圖2 所示。隨著感染時間增長，促炎癥因子IL-1β和TNF-α表達量與對照組相比逐漸升高，IL-1β在2、4 和6 h分別升高0.74、0.62和0.39倍，TNF-α分別升高0.04、0.51 和0.42 倍。而抑炎癥因子TGF-β和IL-10與對照組相比逐漸降低，TGF-β在2、4 和6 h 分別降低0.06、0.10 和0.40 倍，IL-10在2、4 和6 h 分別降低0.22、0.30和0.52倍。

圖2 無乳鏈球菌感染TA-02細胞中的炎癥因子表達Fig.2 Expression of inflammatory cytokines in TA-02 cells infected with Streptococcus agalactiae

2.3 miR-155和SOCS5靶向結合位點預測

通過比對證明miR-155成熟體序列在包括人在內(nèi)的多個物種間具有高度保守性，通過TargetScan等數(shù)據(jù)庫查詢到miR-155與SOCS5存在堿基互補序列，具有一個潛在結合位點（圖3），這提示SOCS5可能是miR-155的靶基因。

圖3 miR-155-5p與SOCS5結合位點預測Fig.3 Prediction of binding sites between miR-155-5p and SOCS5

2.4 PCR擴增與酶切產(chǎn)物鑒定

PCR 擴增尼羅羅非魚SOCS5野生型和突變型目的片段長度應為533 bp，瓊脂糖凝膠電泳檢測表明經(jīng)酶切純化后的SOCS5野生型和突變型片段大小與預期片段長度一致，為533 bp，將目的片段構建至pGL3-Basic載體中，挑取單菌落進行菌落PCR 鑒定，將符合目標片段大小的樣品送生工進行測序分析，測序結果與預期片段一致（圖4）。

圖4 SOCS5基因3＇UTR區(qū)和pGL3-Basic載體酶切純化產(chǎn)物電泳條帶Fig.4 Electrophoretic map of the 3＇UTR region of SOCS5 gene and the purified product digested by pGL3-Basic vector

2.5 測序分析

對含有尼羅羅非魚SOCS5基因結合位點的野生型序列及缺失尼羅羅非魚SOCS5基因結合位點的突變型序列進行克隆測序，尼羅羅非魚SOCS5-WT 載體和SOCS5-mut 載體經(jīng)測序驗證均構建成功，成功將靶序列TGCATTA 突變?yōu)镃TAGCGC，可用于后續(xù)靶點驗證實驗（圖5）。

圖5 SOCS5野生型與突變型重組質(zhì)粒部分測序結果Fig.5 Partial sequencing of SOCS5 wild type and mutant recombinant plasmid

2.6 miR-155對SOCS5的調(diào)控作用

雙熒光素酶實驗結果表明（圖6），共轉(zhuǎn)染miR-155 模擬體和野生型報告質(zhì)粒后，與轉(zhuǎn)染的miRNA的陰性對照相比，miR-155 模擬物可極顯著（P＜0.000 1）抑制其活性，抑制效果達72.9%。miR-155模擬體在和突變型報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的情況下，miR-155模擬體抑制作用顯著（P＜0.000 1）減弱，與野生型組相比減弱53.7%。以上結果初步表明miR-155可以靶向調(diào)控尼羅羅非魚SOCS5基因。

圖6 各組轉(zhuǎn)染后細胞的熒光素酶表達Fig.6 Luciferase expression of cells after transfection in each group

2.7 miR-155對SOCS5表達量的影響

如圖7所示，與mimics NC 組相比，miR-155 mimics 極顯著（P＜0.000 1）的提高miR-155 表達量，升高5.24倍。與inhibitor相比，miR-155 inhibitor極顯著（P＜0.01）的抑制miR-155 的表達，降低2.05倍。

圖7 miR-155相對表達量Fig.7 Relative expression of miR-155

miR-155 mimics、mimics NC、miR-155 inhibitor、inhibitor NC 分別和SOCS5-WT-3＇UTR 共轉(zhuǎn)染HEK-293T 細胞，實時熒光定量PCR 檢測尼羅羅非魚SOCS5基因表達量，實驗結果如圖8 所示。與mimics NC組相比，miR-155 mimics組SOCS5的表達量極顯著（P＜0.001）下調(diào)，降低0.93 倍，表明miR-155 能顯著抑制尼羅羅非魚SOCS5基因的表達。而加入miR-155 inhibitor 后，SOCS5的表達量顯著（P＜0.05）上調(diào)，升高0.62倍，證明miR-155 inhibitor能抑制miR-155的表達，從而降低對SOCS5的調(diào)控作用。

圖8 SOCS5基因相對表達量Fig.8 Relative expression of SOCS5 gene

2.8 轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor 后尼羅羅非魚miR-155對SOCS5的調(diào)控作用

miR-155 mimics和miR-155 inhibitor以及SOCS5野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T 細胞，實時熒光定量PCR 結果表明，與對照組相比，實驗組在6、12 h 時極顯著降低了miR-155 的表達量（P＜0.01），分別降低0.43 和0.64 倍，表明轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor 后，能成功抑制miR-155 表達。而SOCS5表達量在6 h 時顯著上調(diào)（P＜0.05），12 h 時表達量極顯著上調(diào)（P＜0.000 1），分別升高0.42和2.47倍（圖9）。

圖9 轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor后尼羅羅非魚中miR-155和SOCS5基因相對表達量Fig.9 Relative expression of miR-155 and SOCS5 genes in Oreochromis niloticus after miR-155 inhibitor transfection

3 討論

無乳鏈球菌感染羅非魚可以誘導大量炎癥反應的發(fā)生，導致急性死亡從而增加致病性[19,20]，其中腦是無乳鏈球菌感染的一個重要靶器官，當無乳鏈球菌感染細胞后，細胞的模式識別受體與病原體相關分子模式結合，啟動固有免疫應答[21,22]。因此本實驗以TA-02 細胞為實驗模型，探究無乳鏈球菌感染尼羅羅非魚腦細胞誘發(fā)炎癥反應的炎癥水平變化及miR-155靶向SOCS5基因參與機體炎癥反應的調(diào)控機制。目前無乳鏈球菌感染羅非魚主要有兩種途徑：一種是通過在宿主血液中增殖后侵染其他組織引發(fā)病變；另一種是透過血-腦屏障，侵入羅非魚腦組織誘發(fā)腦膜炎，進而引發(fā)一系列生理和病理變化[23,24]。本研究通過無乳鏈球菌感染尼羅羅非魚腦星形膠質(zhì)細胞實驗發(fā)現(xiàn)，miR-155 在不同時間點的表達上調(diào)，證明在清除無乳鏈球菌病原菌的免疫反應中，miR-155 確實參與了尼羅羅非魚腦星形膠質(zhì)細胞的免疫反應。同時在無乳鏈球菌誘導的腦星形膠質(zhì)細胞中，檢測到炎癥因子IL-1β、TNF-α的釋放，并且這兩種炎癥因子的表達模式與miR-155一致，其表達量都是隨著時間增加。這說明在應對無乳鏈球菌入侵時，miR-155 是起到保護機體、對抗其入侵的作用。同時檢測到IL-10、TGF-β的表達量降低，這與陳秀慧等[25]關于子宮內(nèi)膜炎研究中對IL-10的表達水平檢測結論一致；另趙瑾[26]研究證明經(jīng)治療后的膝骨性關節(jié)炎患者體內(nèi)TGF-β表達水平下調(diào)，說明IL-10、TGF-β的下調(diào)可以適量減輕炎癥反應，使炎癥水平維持在一個適度范圍內(nèi)。

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA主要通過與靶基因mRNA的3＇-UTR堿基互補配對，來阻礙靶基因mRNA 翻譯成蛋白質(zhì)或?qū)е缕浣到?，即參與基因轉(zhuǎn)錄后的表達，實現(xiàn)對靶基因的調(diào)控作用[27,28]。已有研究證明miR-155 與炎癥反應密切相關，在機體先天性免疫和獲得性免疫中均發(fā)揮重要調(diào)控作用[29,30]，廣泛參與炎癥反應等多種生理活動，因此對靶基因預測和相互作用關系掌握是了解miR-155參與機體炎癥反應的前提[31]。目前關于miR-155與SOCS5靶向關系的研究報道較少，石瑜等[32]通過實驗證明miR-155-5p 靶向調(diào)控SOCS5促進大鼠（Rattus norvegicus）腦缺血-再灌注損傷。本研究通過生物信息學方法成功預測尼羅羅非魚miR-155與SOCS5之間存在一個靶位點，并利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C發(fā)現(xiàn)miR-155 能極顯著抑制SOCS5基因的表達，但突變結合位點后，miR-155 對SOCS5基因的抑制能力顯著減弱。這證明SOCS5是miR-155 的靶基因。將miR-155 mimics、mimics NC、miR-155 inhibitor、inhibitor NC 分別轉(zhuǎn)染HEK-293T 細胞過表達miR-155 后，檢測到SOCS5表達量與對照組相比下降0.93 倍，而敲降miR-155后，SOCS5表達量上調(diào)0.62倍，證明miR-155 能靶向調(diào)控SOCS5的表達，結合雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步說明miR-155可以通過與SOCS5基因3＇UTR特異性結合，從而抑制SOCS5基因表達。

SOCS5屬于免疫抑制分子家族（包括SOCS1-7和CIS），是由細胞因子誘導產(chǎn)生并反饋性調(diào)控細胞因子信號傳遞過程的負調(diào)節(jié)因子[33]。SOCS 家族基因的異常表達與機體炎性疾病及惡行腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[34,35]，已有研究證明SOCS5在機體癌癥等疾病中發(fā)揮重要作用[36,37]，而癌癥發(fā)展早期都伴有炎癥反應的發(fā)生，二者有潛在聯(lián)系，這提示未來SOCS5可能作為癌癥診斷和治療的切入點。陳景行等[15]發(fā)現(xiàn)SOCS5在小鼠氣道炎癥反應中發(fā)揮重要作用。本研究在無乳鏈球菌感染的TA-02細胞中檢測到SOCS5表達量升高，提示SOCS5參與了TA-02 細胞炎癥反應，有研究表明，SOCS5是一種對細胞因子調(diào)節(jié)通路有負性調(diào)節(jié)作用的因子，能有效抑制炎癥因子表達[38]。這說明在信號通路中可能存在某種抑制SOCS5過度激活的機制，正是這種機制的協(xié)同作用，才避免在病原菌感染后產(chǎn)生的炎癥反應初期，miR-155過度調(diào)控SOCS5表達，抑制抗炎因子的產(chǎn)生，從而導致免疫失衡。本研究與廖寧馨[18]關于新生隱球菌（Filobasidiella bacillispora）介導的巨噬細胞炎癥反應中SOCS1的表達模式相同。

本研究通過轉(zhuǎn)染miR-155 的inhibitor 抑制尼羅羅非魚腦細胞中miR-155 的表達，觀察miR-155 對靶基因SOCS5的調(diào)控作用，在轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor后，成功抑制了miR-155 的表達，相對應時間點SOCS5表達量升高，說明在敲降miR-155 表達后能部分解除對靶基因SOCS5的抑制作用。miRNA 調(diào)控靶基因參與機體生命活動是一個較為復雜的過程，研究表明[39,40]，SOCS5是JAK-STAT 通路中起關鍵作用的負調(diào)控因子，而JAK-STAT 通路參與了多種與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關的炎癥反應，因此推測miR-155 可能通過調(diào)控SOCS5來調(diào)節(jié)下游JAKSTAT 信號通路。張琴和張賀[39,40]研究中關于SOCS5參與機體炎癥反應的報道與本研究中SOCS5的研究結果一致，這說明在無乳鏈球菌介導的TA-02 細胞炎癥反應的早期階段，正是由于miR-155 對SOCS5的這種負向調(diào)控機制，才將炎癥水平控制在在一個合理范圍內(nèi)，從而避免過度抑制炎癥因子產(chǎn)生使免疫系統(tǒng)損傷，不能有效清除病原體。

綜上所述，本研究證實miR-155 與靶基因SOCS5在無乳鏈球菌誘導的TA-02細胞炎癥反應中發(fā)揮重要作用，且miR-155 負向調(diào)控SOCS5參與炎癥發(fā)應的發(fā)生發(fā)展。目前關于miRNA 與靶基因互作參與機體炎癥反應的研究多集中于哺乳動物中[41,42]，在魚類中的對其調(diào)控機制的研究處于初級階段。但miR-155靶向調(diào)控SOCS5的蛋白表達機制及miR-155靶向SOCS5與相關信號通路的關系還有待進一步研究。

4 結論

本研究證實miR-155和SOCS5參與了無乳鏈球菌介導的TA-02細胞炎癥反應。通過生物信息學方法獲得尼羅羅非魚miR-155和SOCS5基因的靶向結合位點，并成功構建尼羅羅非魚SOCS5基因3＇-UTR雙熒光素酶報告基因野生型和突變型載體，證明SOCS5基因是miR-155 直接作用的靶基因，且miR-155 結合于SOCS5基因的3＇-UTR 區(qū)域，在轉(zhuǎn)錄后水平對SOCS5有直接抑制作用。通過敲降尼羅羅非魚miR-155 表達，證明miR-155 可以靶向負調(diào)控SOCS5表達，從而影響炎癥變化的發(fā)生發(fā)展。