王思濃，張宿義，，鐘世榮，敖宗華，楊 艷，賈勇磊，賈俊杰，李壽富，薛瑞琪，張榆俊，劉芮荻

(1.四川輕化工大學(xué)，四川宜賓 644000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000；3.國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州 646000；4.瀘州老窖集團(tuán)有限責(zé)任公司，四川瀘州 646000)

白酒是我國(guó)傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵的蒸餾酒。瀘型酒是中國(guó)四大基本香型白酒之一，因其獨(dú)特的發(fā)酵工藝和典型的風(fēng)味特征而被廣泛消費(fèi)[1-2]。窖池是瀘型酒的主要發(fā)酵容器，集糖化、發(fā)酵、酯化等多種生化反應(yīng)為一體，與提升酒質(zhì)相關(guān)的厭氧功能菌群隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)在窖池中不斷得到馴化和富集。酒醅是瀘型酒釀造過(guò)程的重要載體，其豐富的營(yíng)養(yǎng)成分為微生物提供了生長(zhǎng)繁殖代謝所需的營(yíng)養(yǎng)。酒醅中的功能微生物與窖池的特殊微環(huán)境共同建立了適合釀造優(yōu)質(zhì)酒的微生態(tài)系統(tǒng)，故而有“窖齡老，酒才好”的說(shuō)法。研究發(fā)現(xiàn)不同窖齡的窖池在不同程度上影響酒醅發(fā)酵及微生物演替模式[3]。目前關(guān)于新、老窖池的酒醅研究多為采用高通量測(cè)序技術(shù)分析微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，有助于更好地理解酒醅微生物群落的多樣性和分類組成[4]，而對(duì)于其發(fā)酵過(guò)程中不同空間層次的酒醅缺少系統(tǒng)性的研究。本研究的目的在于探索不同窖齡窖池的不同空間層次酒醅的各項(xiàng)理化指標(biāo)的變化規(guī)律，揭示酒醅在整個(gè)發(fā)酵周期的變化規(guī)律，為生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒醅樣品：取自四川某酒廠。

試劑及耗材：酚酞、氫氧化鈉、鹽酸、葡萄糖、次甲基藍(lán)、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、丙三醇等，所有試劑均購(gòu)于瀘州市聚合化工有限公司，除標(biāo)注外，所用試劑均為分析純。

儀器設(shè)備：Anton Pear DMA5000M 酒類分析儀，奧地利安東帕（中國(guó)）有限公司；電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；MLS-375L 全自動(dòng)滅菌鍋，日本日立公司；DHG-9070(A)電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DL-1 電爐，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

對(duì)發(fā)酵過(guò)程中不同窖齡的不同空間層酒醅的理化指標(biāo)進(jìn)行分析，包括水分、淀粉、酸度、還原糖和乙醇含量。具體測(cè)定方法參考書目《瀘型酒技藝大全》[5]。

1.2.1 樣品處理

樣品采集：本實(shí)驗(yàn)的酒醅樣品采集自正常生產(chǎn)的3 年和30 年的窖池。分別取不同層次的入窖0 d、7 d、14 d、21 d、28 d、42 d、56 d 和出窖的酒醅樣品，新老窖池各選取三口窖池作為平行取樣，樣品檢測(cè)指標(biāo)取三口窖池的平均值。按窖池深度差異分為上、中、下三層，每層采用5 點(diǎn)取樣法取樣，放入無(wú)菌袋密封，并置于-20 ℃下保存，及時(shí)進(jìn)行理化指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

采用軟件excel 和origin 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程中酒醅淀粉含量變化

釀酒生產(chǎn)中原料的淀粉必須經(jīng)過(guò)糊化，生產(chǎn)中是通過(guò)蒸煮和潤(rùn)糧實(shí)現(xiàn)原料的糊化以提供給微生物，使其能完成正常生長(zhǎng)繁殖及代謝活動(dòng)。跟蹤發(fā)酵過(guò)程中新老窖池不同空間層次酒醅的淀粉變化趨勢(shì)，可以更清楚地了解不同空間層次淀粉的利用情況，以達(dá)到生產(chǎn)合理配料及減低成本提高原料利用率的目的。發(fā)酵過(guò)程中酒醅淀粉含量變化見(jiàn)圖1。

從圖1 可以看出，新窖池上、中、下層酒醅在入窖時(shí)的淀粉含量分別為19.69 %、19.65 %和19.01 %，發(fā)酵結(jié)束時(shí)降低至11.15 %、11.21 % 和10.65 %；老窖池在入窖時(shí)的淀粉含量分別是19.67 %、20.07 % 和21.39 %，發(fā)酵結(jié)束后降低至13.34%、12.11%和11.27%。新、老窖池的淀粉利用率都是下層＞中層＞上層，老窖池的下層淀粉利用率更高，可能是下層酒醅發(fā)酵的過(guò)程中有黃水存在，微生物代謝活動(dòng)更為活躍，淀粉液化、糖化速率更高，對(duì)淀粉的消耗作用更為顯著。結(jié)合圖4 分析可得，乙醇含量隨酒醅淀粉的不斷消耗而增長(zhǎng)，直至淀粉濃度達(dá)臨界值時(shí)結(jié)束，說(shuō)明乙醇主要是由淀粉轉(zhuǎn)化而生成的[6]。老窖池上層酒醅發(fā)酵后期殘余淀粉相對(duì)高于新窖池上層酒醅，新窖池上層酒醅在發(fā)酵后期乙醇含量高于老窖池上層酒醅乙醇含量，說(shuō)明了醇含量隨酒醅淀粉含量的減少而增長(zhǎng)。整體看來(lái)新、老窖池隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，不同空間層次的酒醅粗淀粉含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，這符合微生物生長(zhǎng)及繁殖代謝消耗淀粉的規(guī)律。在發(fā)酵初期，上層和中層的氧氣相對(duì)豐富，微生物特別是霉菌繁殖旺盛，產(chǎn)生大量糖化酶，可以快速地將淀粉質(zhì)原料等大分子物質(zhì)降解，粗淀粉下降較快，和張文學(xué)等[7]的研究一致。

圖1 新老窖池發(fā)酵過(guò)程中酒醅淀粉含量的變化

2.2 發(fā)酵過(guò)程中酒醅還原糖含量變化

酒醅中的還原糖作為微生物主要的能源及碳源物質(zhì)，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中逐漸被利用消耗殆盡。酒醅在發(fā)酵初期，淀粉含量較高，且細(xì)菌、芽孢桿菌、霉菌、酵母菌等迅速繁殖使得糖化酶活升高，導(dǎo)致還原糖含量增加。發(fā)酵過(guò)程中酒醅還原糖含量變化見(jiàn)圖2。

圖2 新老窖池發(fā)酵過(guò)程中酒醅還原糖含量的變化

從圖2 可以看出，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酒醅中還原糖含量呈現(xiàn)先上升后階段式下降的趨勢(shì)[8]。新窖池酒醅上層、中層和下層的還原糖含量在入窖時(shí)分別是1.06 %、1.04 %和0.92 %到發(fā)酵結(jié)束的0.64%、0.56%和0.37%；老窖池酒醅上、中、下層的還原糖含量分別是1.13%、1.68%和1.52%到發(fā)酵結(jié)束時(shí)的1.95%、0.65%和0.41%。還原糖前期很快達(dá)到最高值，中期還原糖快速降低，在發(fā)酵后期，微生物發(fā)酵減弱，乙醇生成量降低，酵母消耗還原糖速率減弱，下降幅度趨緩[9]。新窖池在發(fā)酵第7～25 天之間下層酒醅還原糖變化幅度明顯，還原糖含量高于上層、中層酒醅，上層、中層酒醅還原糖含量和變化趨勢(shì)在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中接近；老窖池在發(fā)酵42 d 之后，上層酒醅還原糖含量高于中、下層酒醅，中、下層酒醅還原糖含量和變化趨勢(shì)在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中接近。在發(fā)酵初期還原糖含量最高，隨發(fā)酵的進(jìn)行，中后期呈波動(dòng)式下降。由圖2 可知，發(fā)酵前7 d 由于酒醅中淀粉含量較高，酒醅中溶解氧含量高，霉菌等大量繁殖，淀粉糖化速率快，糖化作用旺盛，新老窖池不同空間層次酒醅中的還原糖含量迅速上升。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酒醅中的淀粉含量逐漸降低，淀粉轉(zhuǎn)化為還原糖的速率降低，此外，酵母菌等兼性厭氧微生物大量繁殖，使得窖池溫度升高，還原糖被大量消耗利用，即淀粉轉(zhuǎn)化為還原糖的速率不及還原糖消耗速率，所以還原糖含量逐漸下降[10]，和趙東等的研究趨于一致[11]。

2.3 發(fā)酵過(guò)程中酒醅水分變化

白酒發(fā)酵過(guò)程與微生物息息相關(guān)，淀粉的糊化、糖化及微生物生長(zhǎng)代謝活動(dòng)和維持正常生理狀態(tài)都需要適宜的水分，適宜的水含量可以調(diào)節(jié)窖內(nèi)溫度，有助于降低發(fā)酵酒醅的酸度。因此，水分的高低同窖內(nèi)發(fā)酵密切相關(guān)，并且影響整個(gè)周期的產(chǎn)量和質(zhì)量[12]，含量過(guò)高或過(guò)低對(duì)釀酒生產(chǎn)都有不利的影響。發(fā)酵過(guò)程中酒醅水分變化見(jiàn)圖3。

從圖3 可以看出，在新老窖池酒醅的發(fā)酵過(guò)程中，上、中、下層酒醅的水分都隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升。新、老窖池的水分上升幅度有所差異，老窖池不同空間層的水分差別較大。從數(shù)據(jù)對(duì)比來(lái)看，新窖池上、中、下層酒醅在發(fā)酵的過(guò)程中各個(gè)層次的水分大小較為接近，在發(fā)酵第56 天左右酒醅整體含水量開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。老窖池酒醅發(fā)酵7 d之后，上、中、下層含水量差異較大，變化規(guī)律更明顯，可能是老窖池中的酒醅整體發(fā)酵更為徹底所導(dǎo)致的。新窖池發(fā)酵初期上層水分急劇上升，高于中層、下層，這可能是由于新窖池在發(fā)酵初期上層酒醅的溶氧量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，微生物在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生大量水分。當(dāng)進(jìn)入主發(fā)酵期，產(chǎn)乙醇的同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生一部分的水，所以不同層次酒醅水分是持續(xù)上升的。老窖池上層變化不明顯，下層水分增長(zhǎng)較快，可能是在發(fā)酵后期，由于重力的作用會(huì)使上層、中層的水分向下沉降，所以老窖池下層的水分大于上層、中層[13]。

2.4 發(fā)酵過(guò)程中酒醅乙醇含量變化

母糟中的乙醇含量是判斷發(fā)酵正常與否的主要指標(biāo)之一。在瀘型酒固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌、細(xì)菌及根霉都能將葡萄糖發(fā)酵成酒精，只是發(fā)酵機(jī)理有所區(qū)別[14]。跟蹤發(fā)酵過(guò)程中新、老窖池酒醅的乙醇含量變化趨勢(shì)，可以清楚地了解乙醇的產(chǎn)生情況和不同空間層次酒醅的乙醇含量差別。發(fā)酵過(guò)程中酒醅乙醇含量變化見(jiàn)圖4。

如圖4 所示，新、老窖池上、中、下層酒醅中的乙醇含量均不斷上升，和李璇[15]、陳珊[16]等的研究相一致。發(fā)酵前期，酒醅中的主要反應(yīng)即為微生物將還原糖轉(zhuǎn)化為乙醇，乙醇含量迅速上升；在發(fā)酵后期，酒醅中主要反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)樯恪Ｐ陆殉鼐契?、中、下三層的乙醇含量?～7 d 無(wú)明顯變化，7～28 d 中層酒醅的乙醇含量明顯高于上、下層。老窖池酒醅在發(fā)酵的0～7 d，上、中層酒醅乙醇含量無(wú)明顯變化，下層酒醅乙醇含量大于上層和中層并保持上升狀態(tài)，發(fā)酵中期上層、中層、下層的乙醇含量持續(xù)上升。新窖池上層酒醅在第56 天乙醇含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，結(jié)合圖5A 新窖池酸度數(shù)據(jù)可以看出，該時(shí)期上層酒醅酸度低，說(shuō)明酸醇酯化反應(yīng)酒精消耗量少，酒精含量有所積累，呈上升趨勢(shì)；發(fā)酵56 d 后，乙醇含量達(dá)到頂峰，新窖池酒醅的乙醇含量在56 d 上層、中層、下層分別是4.568 %、4.168 %、4.244 %，發(fā)酵結(jié)束分別是4.716 %、3.745%、2.812%。老窖池酒醅乙醇含量在56 天上層、中層、下層分別是3.931%、4.127%、4.248%，發(fā)酵結(jié)束分別是3.593%、3.224%、3.433%。新、老窖池酒醅乙醇含量在發(fā)酵前期持續(xù)上升，第56 天以后隨即下降，這是由于乙醇參與酯化作用和作為碳源被微生物所消耗[17-18]。

圖4 新老窖池發(fā)酵過(guò)程中酒醅乙醇含量的變化

2.5 發(fā)酵過(guò)程中酒醅酸度變化

酒醅的酸度是衡量母糟發(fā)酵是否正常的依據(jù)之一。測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中酒醅的酸度，可判斷發(fā)酵是否正常，對(duì)生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，微生物的代謝必然會(huì)產(chǎn)生各種酸類，多伴隨乙醇生成，故在產(chǎn)酒發(fā)酵中酒醅酸度與酒精含量變化趨勢(shì)大致相同，均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加[19]。酸是酒體中重要的風(fēng)味物質(zhì)，酒醅中適當(dāng)?shù)乃岫瓤梢砸种撇糠钟泻﹄s菌的生長(zhǎng)繁殖并參與酯化過(guò)程，促進(jìn)呈香呈味物質(zhì)的形成。通過(guò)跟蹤酒醅的酸度變化可以反映有機(jī)酸含量的變化規(guī)律，反映微生物的代謝情況[20]。發(fā)酵過(guò)程中酒醅酸度變化見(jiàn)圖5。

由圖5 可知，新、老窖池在發(fā)酵過(guò)程中酒醅酸度都呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，和張霞等[21]的研究結(jié)果相一致。在發(fā)酵前期酒醅酸度緩慢增加，而在發(fā)酵時(shí)間達(dá)到28 d 之后，酒醅中的酸度急劇增加，這和唐賢華等[22]的研究相一致。可以看出，下層酒醅酸度大于中層大于上層，可能是由于發(fā)酵后期微生物代謝產(chǎn)酸導(dǎo)致酸度增大。老窖池酒醅的酸度明顯大于新窖池，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，新窖池上、中、下層的酸度分別為1.73 mmol/10 g、3.15 mmol/10 g 和3.56 mmol/10 g，老窖池上、中、下層的酸度分別為1.99 mmol/10 g、4.15 mmol/10 g 和4.55 mmol/10 g。不同窖齡、不同層次的微生物菌群結(jié)構(gòu)的不同，老窖池有更多代謝產(chǎn)酸的微生物。隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，中層及下層厭氧和兼性厭氧微生物代謝逐漸旺盛，是發(fā)酵中后期中層、下層酒醅酸度急劇升高的原因之一。新、老窖池酒醅酸度均增加明顯，這是因?yàn)檫吿腔叞l(fā)酵過(guò)程中多種微生物共同作用生成了有機(jī)酸類物質(zhì)[23]。老窖池在產(chǎn)酸階段產(chǎn)生大量有機(jī)酸，酸類物質(zhì)增多，主要有乙酸、丁酸、己酸和乳酸等，是細(xì)菌代謝作用的結(jié)果，并且酸度變化快慢與細(xì)菌、芽孢桿菌代謝強(qiáng)弱有較密切的聯(lián)系[24]。發(fā)酵后期老窖池中層和下層酸度顯著增加，也可能是酒醅接觸窖泥的面積較大，窖泥中的己酸還原菌和乳桿菌增多造成的[25]。

圖5 新老窖池發(fā)酵過(guò)程中酒醅酸度的變化

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)瀘型酒新、老窖池不同空間層次發(fā)酵過(guò)程中酒醅理化指標(biāo)變化規(guī)律的研究，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中新、老窖池酒醅水分和酸度隨發(fā)酵時(shí)間的增加逐漸升高，且老窖池各層次的酒醅酸度含量普遍高于新窖池。新窖池酒醅在發(fā)酵過(guò)程中水分大小較為接近，發(fā)酵后期酒醅整體含水量開(kāi)始下降，老窖池則呈現(xiàn)整體平穩(wěn)上升的趨勢(shì)，說(shuō)明老窖池酒醅發(fā)酵更穩(wěn)定。此外，發(fā)酵過(guò)程酒醅中淀粉被不斷消耗，在微生物作用下產(chǎn)生水分、酸類物質(zhì)和乙醇，老窖池在發(fā)酵時(shí)間達(dá)到56 d 后，乙醇含量出現(xiàn)峰值，新窖池上層酒醅乙醇含量持續(xù)緩慢增加，這說(shuō)明濃香型白酒發(fā)酵后期，主要進(jìn)行酸醇酯化反應(yīng)，新窖池上層酒醅因有機(jī)酸含量低，酯化反應(yīng)底物不足，酒精有積累現(xiàn)象；新窖池酒醅在發(fā)酵前期下層酒醅還原糖含量普遍高于中上層，老窖池在發(fā)酵后期上層酒醅還原糖含量高于中下層。數(shù)據(jù)說(shuō)明，老窖池酒醅發(fā)酵更穩(wěn)定，產(chǎn)酸生酯能力優(yōu)于新窖池。由此可見(jiàn)，不同窖齡、不同空間層次各理化指標(biāo)的變化幅度不同，會(huì)導(dǎo)致微生物的生產(chǎn)環(huán)境與繁殖水平出現(xiàn)差異。跟蹤監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中不同窖齡不同空間層次的酒醅理化指標(biāo)，可以更好的了解和判定酒醅的發(fā)酵情況，為實(shí)際生產(chǎn)控制提供數(shù)據(jù)參考和理論指導(dǎo)。