李鈺，葉恒振，李爭(zhēng)可，許悅，韋露，郭志強(qiáng)

（海南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228）

鉻是水體污染的有害重金屬之一，每年大約有7×106t 鉻廢水被排放到自然環(huán)境中[1]，嚴(yán)重危害水生生物的生理，如抗氧化酶活性、細(xì)胞代謝和細(xì)胞凋亡等[2-4]。Cr（Ⅵ）進(jìn)入生物體后還原成Cr（Ⅲ）并產(chǎn)生大量活性氧自由基（ROS），引起組織氧化損傷甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、突變等[4-7]。在水環(huán)境中，鉻最穩(wěn)定的兩種氧化態(tài)為三價(jià)鉻Cr（Ⅲ）和六價(jià)鉻Cr（Ⅵ），Cr（Ⅵ）是一種強(qiáng)氧化劑，對(duì)生物體的毒性是Cr（Ⅲ）的1 000 倍，致突變性為100 倍，且由于跨膜方式的不同，Cr（Ⅵ）比Cr（Ⅲ）更加容易被吸收并在組織內(nèi)累積[2,8,9]。盡管Cr（Ⅲ）的毒性要遠(yuǎn)低于Cr（Ⅵ），當(dāng)Cr（Ⅲ）在生物體內(nèi)累積過(guò)量，也會(huì)損傷DNA 并造成遺傳毒性[10-12]。

抗氧化防御系統(tǒng)作為生物體內(nèi)基本的生理功能和防御機(jī)制，抗氧化酶活指標(biāo)被廣泛應(yīng)用于研究重金屬對(duì)魚體抗氧化防御系統(tǒng)的影響[13-16]。在輕度脅迫下，刺激抗氧化酶活性升高以抵御外界脅迫，而在重度脅迫下，過(guò)度消耗抗氧化酶活性，超出機(jī)體抵御能力，抗氧化酶活性降低[17-19]。主要的抗氧化防御系統(tǒng)由抗氧化酶以及抗氧化劑共同作用?？寡趸赴ǔ趸锲缁福⊿OD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和過(guò)氧化物酶（POD）等，非酶抗氧化劑如谷胱甘肽（GSH）可與抗氧化酶協(xié)同作用以抑制活性氧（ROS）過(guò)量產(chǎn)生[19]。例如，抗氧化酶SOD 活性隨著Cr（Ⅵ）濃度的升高，草魚（Ctenopharyngodon idellus）鰓的ROS 含量先升高后降低[20]。盡管有關(guān)六價(jià)鉻對(duì)生物體的毒理效應(yīng)研究已較為充分，但有關(guān)三價(jià)鉻的毒性研較為稀少，且兩種不同價(jià)態(tài)鉻差異對(duì)比的研究則更為罕見(jiàn)[20,21]。

豹紋鰓棘鱸（Plectropomus leopardus）為一種高觀賞價(jià)值、高食用價(jià)值的經(jīng)濟(jì)魚類而被人類廣泛捕撈，導(dǎo)致種群數(shù)量逐年下降[23]而被列入《瀕危物種紅色名錄》[24]。目前，關(guān)于豹紋鰓棘鱸的研究大多集中在生態(tài)、體色、基因等方面[25-27]。未見(jiàn)有關(guān)三價(jià)鉻[Cr（Ⅲ）]和六價(jià)鉻[Cr（Ⅵ）]對(duì)豹紋鰓棘鱸，尤其是其肝臟抗氧化酶活性影響的對(duì)比研究。本實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度的水相三價(jià)鉻[Cr（Ⅲ）]和六價(jià)鉻[Cr（Ⅵ）]對(duì)豹紋鰓棘鱸幼魚超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）活性和谷胱甘肽（GSH）含量的影響，為準(zhǔn)確衡量水相三價(jià)鉻[Cr（Ⅲ）]和六價(jià)鉻[Cr（Ⅵ）]毒性對(duì)水生生物健康的影響提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料方法

1.1 主要儀器和試劑

酶標(biāo)分析儀（雷杜RT-6100 型，上海蔚霆商貿(mào)有限公司）；可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-5100 型，上海元析儀器有限公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（H2050R，湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；電子分析天平（PX85ZH，奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司）。

氯化鉻（CrCl3·6H2O，Cr（Ⅲ），純度≥99%）和重鉻酸鉀（K2Cr2O7，Cr（Ⅵ），純度≥99.5%），購(gòu)自中國(guó)上海Sigma-Aldrich 貿(mào)易有限公司（https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh）。蛋白定量（TP）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）和谷胱甘肽（GSH）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。商業(yè)魚飼料購(gòu)自中國(guó)山東省三通生物工程有限公司。

1.2 方法

體質(zhì)量（16.5±2.1）g 的豹紋鰓棘鱸幼魚（n=84）購(gòu)自中國(guó)海南省陵水市藍(lán)海水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，采用半靜態(tài)法對(duì)幼魚進(jìn)行了14 d 和21 d 的水相鉻暴露實(shí)驗(yàn)。首先將該魚馴養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室水族箱（0.8 m×0.6 m×0.6 m）中馴化15 d，每天投喂兩次（9:00 和17:00）[28]。實(shí)驗(yàn)室水質(zhì)條件：總鉻濃度<0.034 mg/L，溶解氧5.6～7.4 mg/L，pH 7.4～8.4，水溫28.3～29.7℃，光周期12 h（12 L∶12 D）。

幼魚適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分為7 組7 箱：對(duì)照組（Control）、Cr（Ⅲ）處理組（0.05 mg/L、0.1 mg/L 和0.2 mg/L）和Cr（Ⅵ）處理組（0.05 mg/L、0.1 mg/L 和0.2 mg/L）。每缸12 尾魚，每次取6 尾魚作為平行。實(shí)驗(yàn)期間，自然海水經(jīng)48 h 暗沉淀處理、二級(jí)砂濾，符合海水水質(zhì)I 類標(biāo)準(zhǔn)，每隔24 h 換一次水；每日8:00 am 和4:00 pm 記錄水溫，測(cè)定氨氮、溶氧含量和水中鉻濃度等。水中鉻濃度測(cè)定平均值分別為：（0.053±0.014）mg/L、（0.132±0.021）mg/L 和（0.216±0.029）mg/L。實(shí)驗(yàn)組Cr 質(zhì)量濃度未包括海水本底值。

飼養(yǎng)期間，分別在第14 d 和第21 d 取樣，在冰袋上快速分離肝臟并稱重，迅速裝入1.5 mL 無(wú)菌離心管中置于-80℃冰箱保存。

1.3 酶活性的測(cè)定

將肝臟組織按照體積（mL）加入9 倍體積的0.9%生理鹽水（4℃預(yù)冷），利用勻漿器機(jī)械破碎組織樣品（60 hz，30 sec），冰水浴制備10%勻漿（2 500 r/min 離心10 min），取上清勻漿液測(cè)定酶活性。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液蛋白濃度（TP 試劑盒），利用SOD、CAT、POD 和GSH 檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定幼年豹紋鰓棘鱸肝臟組織內(nèi)的三種酶活性以及GSH含量。

SOD 活力單位定義：每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD 抑制率達(dá)50 %時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD 量為一個(gè)酶活力單位（U）。CAT 單位定義：每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol 的H2O2量為一個(gè)酶活力單位（U）。POD 單位定義：37℃下，每毫克組織蛋白每分鐘催化1 μg 底物的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。因此，組織勻漿中總SOD、CAT、POD 活力單位為U/mg prot。GSH 單位定義：37℃條下，每毫克組織蛋白每分鐘催化1 nmol NDPH 氧化為一個(gè)酶活單位。即組織勻漿中GSH 活力單位為mgGSH/g prot。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，分別利用Excel 和GraphPad Prism 8.0（Comparative Graph-Pad Software Inc.,USA）處理、多元統(tǒng)計(jì)分析和作圖。通過(guò)單因素方差分析（One-Way ANOVA）與多重比較Tukey's Method 檢驗(yàn)處理組之間三種酶活性以及GSH 含量差異的顯著性。若P<0.05，則為顯著差異；P<0.01，則為極顯著差異；P>0.05，則差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 水相C r（Ⅲ）和C r（Ⅵ）對(duì)豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

14 d 時(shí)，Cr 處理組豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟SOD活性顯著低于對(duì)照組（P<0.05）（圖1-A）；且隨著處理濃度的增加而增加。0.05 mg/L 濃度Cr（Ⅲ）與Cr（Ⅵ）處理下SOD 活性都極顯著低于對(duì)照組（55.35±5.59 U/m gprot）（P<0.01），平均值分別為（28.56±3.28）U/mg prot 和（23.39±1.79）U/mg prot；0.1 mg/L 和0.2 mg/L 濃度Cr（Ⅲ）下SOD 活性顯著高于C（rⅥ）組（P<0.01）。

圖1 水相Cr 處理14 d（A）和21 d（B）下豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟超氧化物歧化酶（SOD）活性Fig.1 The activity of superoxide dismutase（SOD）in liver of juvenile coral trout（P.leopardus）exposed to aqueous phase Cr for 14 days（A）and 21 days（B）

21 d 時(shí)，Cr（Ⅲ）組處理組SOD 活性低于對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異（P>0.05）（圖1-B）；在Cr（Ⅵ）處理下，SOD 活性顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；Cr（Ⅲ）處理組的SOD 活性在0.05 mg/L 和0.2 mg/L 濃度下極顯著高于Cr（Ⅵ）處理組（P<0.01）。

2.2 水相Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）對(duì)豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的影響

14 d 時(shí)，Cr 處理組豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟的CAT活性都顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。Cr（Ⅲ）組0.1 mg/L 濃度下，CAT 活性最低，與對(duì)照組（16.87±3.95）U/mg prot 差異極顯著（P<0.01），且顯著低于同濃度的Cr（Ⅵ）處理組（5.64±1.60）U/mg prot（P<0.05）；Cr（Ⅵ）處理組的CAT 活性隨著Cr（Ⅵ）處理濃度的升高而升高，濃度為0.05 mg/L 時(shí)Cr（Ⅵ）處理組（7.15±1.73）U/mg prot 的CAT 活性最低（圖2-A）。

21 d 時(shí)，Cr（Ⅲ）處理組的CAT 活性與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P>0.05）；Cr（Ⅵ）處理組的CAT 活性都顯著低于對(duì)照組（P<0.05），且隨著Cr（Ⅵ）處理濃度的升高而下降，濃度為0.2 mg/L 時(shí)CAT 活性最低（12.68±2.95）U/mg prot；Cr（Ⅲ）處理組的CAT 活性在0.1 mg/L 和0.2 mg/L 濃度下極顯著高于同濃度Cr（Ⅵ處理組（P<0.01）（圖2-B）。

圖2 水相Cr 處理14 d（A）和21 d（B）時(shí)豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟過(guò)氧化氫酶（CAT）活性Fig.2 The activity of catalase（CAT）in liver of juvenile coral trout（P.leopardus）exposed to aqueous phase Cr for 14 days（A）and 21 days（B）

2.3 水相Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）對(duì)豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟過(guò)氧化物（POD）活性的影響

14 d 時(shí)，Cr（Ⅲ）處理組豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟的POD 活性在0.1 和0.2 mg/L 濃度時(shí)顯著高于對(duì)照組（4.76±0.64）U/mg prot（P<0.05），且極顯著高于Cr（Ⅵ）處理組（P<0.01），平均值分別為（7.42±2.83）U/mg prot 和（9.12±1.50）U/mg prot；Cr（Ⅵ）處理組的POD 活性在濃度為0.05 mg/和0.1 mg/L 時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P>0.05），在0.2 mg/L 濃度下Cr（Ⅵ）處理組（2.08±0.41）U/mg prot 顯著低于對(duì)照組（P<0.05）（圖3-A）。

圖3 水相Cr 處理14 d（A）和21 d（B）下豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟過(guò)氧化物酶（POD）活性Fig.3 The activity of peroxidase（POD）in liver of juvenile coral trout（P.leopardus）exposed to aqueous phase Cr for 14 days（A）and 21 days（B）

21 d 時(shí)，Cr（Ⅲ）處理組的POD 活性顯著高于對(duì)照組（7.22±1.32）U/mg prot（P<0.05），隨著濃度的升高而升高；Cr（Ⅵ）處理組的POD 活性在0.05 mg/L和0.1 mg/L 時(shí)顯著高于對(duì)照組（P<0.05），平均值分別為（9.66±0.91）U/mg prot 和（14.45±1.72）U/mg prot；在濃度為0.2 mg/L 時(shí)Cr（Ⅵ）處理組（4.56±1.58）U/mg prot 顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；Cr（Ⅲ）處理組的POD 活性極顯著高于Cr（Ⅵ）處理組（P<0.01）（圖3-B）。

2.4 水相Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）對(duì)豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟谷胱甘肽（GSH）含量的影響

14 d 時(shí)，Cr（Ⅲ）處理組豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟的的GSH 含量隨著Cr（Ⅲ）處理濃度的升高而升高，在0.1 mg/L 和0.2 mg/L 濃度時(shí)顯著高于對(duì)照組（13.71±1.53）mg GSH/g prot（P<0.05），且極顯著高于Cr（Ⅵ）組（P<0.01），平均值分別為（18.70±2.05）mgGSH/g prot 和（22.14±1.64）mg GSH/g prot；Cr（Ⅵ）處理組的GSH 含量隨著Cr（Ⅵ）處理濃度的升高而下降，在0.2 mg/L 濃度時(shí)Cr（Ⅵ）處理組GSH含量（10.34±2.20）mg GSH/g prot 顯著低于對(duì)照組（P<0.05）（圖4-A）。

21 d 時(shí)，Cr（Ⅲ）處理組的GSH 含量隨著Cr（Ⅲ）處理濃度的升高而升高，在0.2 mg/L 濃度下Cr（Ⅲ）處理（16.35±1.34）mg GSH/g prot 顯著高于對(duì)照組（12.02±0.73）mg GSH/g prot（P<0.05）；Cr（Ⅵ）處理組的GSH 含量隨著Cr（Ⅵ）濃度的升高而下降，在0.1 mg/L 和0.2 mg/L 濃度時(shí)Cr（Ⅵ）處理組顯著低于對(duì)照組（P<0.05），平均值分別為（10.20±0.90）mg GSH/g prot 和（6.17±0.94）mg GSH/g prot；Cr（Ⅲ）處理組的GSH 含量在0.05 mg/L 濃度下顯著低于Cr（Ⅵ）處理組（P<0.05），在0.1 mg/L 和0.2 mg/L 濃度下顯著高于Cr（Ⅵ）處理組（P<0.05）（圖4-B）。

圖4 水相Cr 處理14 d（A）和21 d（B）下豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟谷胱甘肽（GSH）含量Fig.4 The activity of glutathione（GSH）in liver of juvenile coral trout（P.leopardus）exposed to aqueous phase Cr for 14 days（A）and 21 days（B）

3 討論

3.1 Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）對(duì)豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟組織SOD 和CAT 活性的影響

SOD 可以催化ROS 的超氧陰離子（O2-·）產(chǎn)生H2O2，抑制ROS 以減少脅迫對(duì)機(jī)體的損傷。輕度脅迫下SOD 活性升高以抵御外界對(duì)機(jī)體的脅迫刺激，而在重度脅迫下，生物體內(nèi)受損嚴(yán)重導(dǎo)致過(guò)量ROS積累，SOD 活性被過(guò)度消耗而降低[29]。CAT 的主要作用是與細(xì)胞內(nèi)的H2O2反應(yīng)產(chǎn)生H2O[19,29-31]，以清除SOD 催化ROS 后所產(chǎn)生的H2O2廢物。本研究中，水相Cr（Ⅲ）暴露14 d 時(shí)顯著抑制豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟SOD 和CAT 活性（P<0.05），但此抑制作用隨時(shí)間的增長(zhǎng)而降低，并在21 d 時(shí)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05）（圖1、圖2），這可能是由于第21 d 水相Cr（Ⅲ）暴露已無(wú)法使豹紋鰓棘鱸幼魚產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，以產(chǎn)生ROS 消耗SOD 與CAT 的酶活力，即豹紋鰓棘鱸幼魚可能已逐漸適應(yīng)0.05 mg/kg、0.1 mg/kg 和0.2 mg/kg 的水相Cr（Ⅲ）暴露環(huán)境。在水相Cr（Ⅲ）對(duì)金魚（Carassius auratus）急性（96 h，10 mg/L）暴露實(shí)驗(yàn)中，處理組的SOD 和CAT活性在24 h 時(shí)與對(duì)照組差異顯著（P<0.05）；在48和96 h 時(shí)與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05），這與本研究結(jié)果相似[32]。

Cr（Ⅵ）處理組的豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟SOD 和CAT 活性在14 d 和21 d 都顯著低于對(duì)照組（P<0.05），表明2～3 周的Cr（Ⅵ）脅迫下豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟SOD 和CAT 活性被過(guò)度消耗，受到重度脅迫。Chen 等[33]在毒性研究中發(fā)現(xiàn)，在0.01 mg/L 的Cr（Ⅵ）對(duì)時(shí)斑馬魚（Danio rerio）發(fā)育畸形；魚體的抗氧化系統(tǒng)ROS、SOD 等抗氧化酶活性指標(biāo)都低于對(duì)照組，這與本研究結(jié)果相符。Cr（Ⅵ）處理組SOD和CAT 活性基本上都低于Cr（Ⅲ）處理組和對(duì)照組，表明Cr（Ⅵ）對(duì)豹紋鰓棘鱸幼魚的毒性要高于Cr（Ⅲ）。Kubrak 等[32]的Cr（Ⅲ）與Cr（Ⅵ）對(duì)金魚組織的急性（96 h，10 mg/L）暴露實(shí)驗(yàn)表明，兩種鉻離子都會(huì)在金魚肝臟和腎臟組織中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，且Cr（Ⅵ）處理下的SOD 和CAT 活性要低于Cr（Ⅲ）。本研究結(jié)果與Kubrak 等[32]描述的Cr（Ⅵ）與Cr（Ⅲ）對(duì)魚體的抗氧化酶活影響具有相似性。氧化應(yīng)激是緩解鉻毒性的關(guān)鍵機(jī)制。

3.2 Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）對(duì)豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟組織POD 活性和GSH 含量的影響

POD 存在于真核生物內(nèi)的H2O2酶體內(nèi)，能夠清除機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的過(guò)氧化物等有害物質(zhì)，避免過(guò)氧化物在生物體內(nèi)累積[19]。輕度脅迫下POD會(huì)升高以抵御外界脅迫，而在重度脅迫下超出機(jī)體抵御能力則表現(xiàn)為POD 降低[17-19]。而GSH 可以與抗氧化酶協(xié)同作用清除活性氧及防御膜脂過(guò)氧化[34-36]。Cr（Ⅲ）可以與配合物絡(luò)合增強(qiáng)清除自由基的能力，發(fā)揮較強(qiáng)的抗氧化作用，如槲皮素-Cr（Ⅲ）絡(luò)合物[37]。本研究的Cr（Ⅲ）處理組的豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟的POD 活性和GSH 含量都表現(xiàn)升高趨勢(shì)（圖3、圖4），這與低濃度下有毒物質(zhì)對(duì)抗氧化系統(tǒng)的增益作用有關(guān)[29]。本研究結(jié)果表明Cr（Ⅲ）的低毒性對(duì)豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟的抗氧化系統(tǒng)具有誘導(dǎo)作用，以增強(qiáng)豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟的抗氧化能力。

此外，Cr（Ⅵ）處理組POD 活性和GSH 含量基本上都低于Cr（Ⅲ）處理組和對(duì)照組，尤其是在0.1 mg/L 和0.2 mg/L 濃度時(shí)，Cr（Ⅵ）處理組與Cr（Ⅲ）處理組相比，POD 活性和GSH 含量差異極顯著（P<0.01），這與SOD 和CAT 活性結(jié)果一致。說(shuō)明Cr（Ⅵ）處理抑制了豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟的SOD、CAT、POD 活性和GSH 含量，而水相Cr（Ⅵ）的毒性顯然要高于對(duì)水相Cr（Ⅲ）。這與水相Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）暴露下對(duì)巴西本土魚（Piaractus mesopotamicus）的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似[2]，該研究還指出Cr（Ⅵ）具有更高的毒性還會(huì)引起不可逆的病變；而Cr（Ⅲ）在推薦水平內(nèi)施用時(shí)，可以安全地用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。

3.3 結(jié)論

本文研究了兩種價(jià)態(tài)的鉻（Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ））分別在三種濃度（0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L）下浸泡14 d 和21 d，對(duì)豹紋鰓棘鱸肝臟組織抗氧化酶活的影響。結(jié)果表明，暴露14 d 下Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）抑制肝臟抗氧化能力，但是暴露21 d 下Cr（Ⅲ）增強(qiáng)了肝臟抗氧化能力，Cr（Ⅵ）依舊為抑制作用且在較低的濃度下也會(huì)對(duì)豹紋鰓棘鱸幼魚肝臟抗氧化能力產(chǎn)生一定程度的抑制影響，毒性大于Cr（Ⅲ）。本研究為區(qū)分不同價(jià)態(tài)鉻在不同暴露時(shí)間段鉻下對(duì)抗氧化機(jī)制影響的差異提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。