賀剛，徐金根，何力，吳斌，方春林，喻亞麗，費(fèi)春平

（1.江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，江西 南昌 330039；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223；3.九江市水產(chǎn)科學(xué)研究所，江西 九江 332099；4.江西金龜王實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司，江西 上饒 334400）

中華草龜（Chinemys reevesii）隸屬龜鱉目（Testudinate）龜科（Emydidae）烏龜屬（Chinemys），俗稱烏龜、墨龜，泥龜，是常見的養(yǎng)殖龜種之一，在中國分布廣泛[1]。中華花龜（Ocadia sinensis）隸屬龜科花龜屬，俗稱花龜、珍珠龜，分布在中國南方地區(qū)[2]。兩者都具很高藥用、食用和觀賞價值。隨著龜類野生資源持續(xù)減少，而繁養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴(kuò)大，導(dǎo)致養(yǎng)殖過程中種質(zhì)退化、畸形率高、性成熟延遲、餌料系數(shù)高等現(xiàn)象頻繁發(fā)生。因此，開展新養(yǎng)殖品種的繁養(yǎng)殖是解決龜類種質(zhì)的有效途徑。近年來，已發(fā)現(xiàn)20多種雜交龜，新品種數(shù)量不斷增加，但報道甚少，僅見金石雜交龜[黃喉擬水龜（Mauremys mutica♀）與三線閉殼龜（Cuora trifasciata）][3]和烏花雜交龜[中華草龜（♀）與中華花龜（）][4]。迄今，已對龜鱉類形態(tài)習(xí)性[5]、生長繁育[6,7]和種群分化[8]等進(jìn)行了諸多研究。

為獲得適于養(yǎng)殖推廣的新品系，由中華草龜（♀）×中華花龜（）雜交后培育的品種稱為烏花雜龜，具有品相好、生長快、價值高等優(yōu)點(diǎn)[9]。近年生產(chǎn)實(shí)踐證明，雜種龜?shù)纳L和抗逆性明顯提高，現(xiàn)

已經(jīng)進(jìn)行了大規(guī)模養(yǎng)殖，具有良好的經(jīng)濟(jì)價值。雜種及其親本的形態(tài)、體色、花紋等具有一定相似性，從系統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定雜種龜更為直觀。聚類分析、判別分析及主成分分析是水生動物形態(tài)差異分析的

常用方法[10-12]。本實(shí)驗采用聚類分析、判別分析和主成分分析對中華草龜、中華花龜及其雜種的形態(tài)進(jìn)行綜合分析，探究雜交種與親本間的親緣關(guān)系，建立相應(yīng)的形態(tài)鑒別方法，為龜類雜交育種和生產(chǎn)實(shí)踐提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗用龜來自江西省烏龜良種場，隨機(jī)選擇6月齡的中華草龜、中華花龜及雜種F1代各60 只，共180 只，其背面和腹面見圖1，樣本體質(zhì)量、背甲長等信息詳見表1。

圖1 3 種龜?shù)男螒B(tài)性狀Fig.1 Morphological demonstration of three species of tortoises

表1 3 種龜?shù)臉颖拘畔ab.1 Samples date of three species of tortoises

1.2 測定方法

用精確度0.01 g 電子天平稱量體質(zhì)量（Y），用精確度0.01 cm 游標(biāo)卡尺測量背甲長（X1）、背甲寬（X2）、殼高（X3）、腹甲長（X4）、腹甲后半部長（X5）、腹甲前半部寬（X6）、腹甲后半部前寬（X7）、腹甲后半部后寬（X8）、甲橋長（X9）、喉盾寬（X10）、喉盾縫長（X11）、肱盾縫長（X12）、胸盾縫長（X13）、腹盾縫長（X14）、股盾縫長（X15）和肛盾縫長（X16）等17 項形態(tài)性狀。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所測可量性狀數(shù)據(jù)都除以背甲長進(jìn)行校正，以消除形態(tài)大小對測量結(jié)果的影響，所得參數(shù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換以除去異速生長產(chǎn)生的差異。采用Excel 和SPSS16.0 軟件處理數(shù)據(jù)，采用聚類分析、主成分分析、判別分析3 種多元分析方法對不同種龜及其雜交種進(jìn)行形態(tài)差異分析。

采用歐氏距離法進(jìn)行聚類分析。判別分析采用逐步判別法分析，選取對判別過程貢獻(xiàn)大的參數(shù)建立3 種龜?shù)娜后w性狀判別函數(shù)。主成分分析是將多個形態(tài)指標(biāo)綜合成少數(shù)或幾個因子，用以說明不同種簡單差異大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 可數(shù)性狀比較

校正后的中華草龜、中華花龜和雜種龜群體各形態(tài)性狀比例參數(shù)見表2，從形態(tài)上看，背甲寬/背甲長、殼高/背甲長、腹甲長/背甲長、腹甲后半部長/背甲長、腹甲前半部寬/背甲長、喉盾寬/背甲長、喉盾縫長/背甲長表現(xiàn)出中華草龜>雜種龜>中華花龜，在體型特征上存在差異。

表2 3 種龜可量比例性狀均值及標(biāo)準(zhǔn)差Tab.2 Overall mean and standard deviation of relative values of meristic characters of two species of tortoises and their hybrid

2.2 聚類分析

3 種龜群體可量比例性狀經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)化形態(tài)數(shù)據(jù)見表3，基于歐氏距離進(jìn)行聚類分析，建立親緣關(guān)系樹如圖2。中華草龜和雜種龜在形態(tài)上最為接近，聚為一組，而中華花龜與草龜、雜種龜形態(tài)差異較大。

表3 3 種龜群體的形態(tài)距離（歐氏距離）Tab.3 Morphological distances calculated by cluster analysis among three species of tortoises

圖2 3 種龜群體的形態(tài)聚類分析Fig.2 Morphological cluster plot of three species of tortoises

2.3 判別分析

采用逐步判別分析，從草龜、花龜及雜種龜?shù)?5 個比例參數(shù)篩選出有顯著性貢獻(xiàn)的10 個變量：背甲寬/背甲長（X1）、殼高/背甲長（X2）、腹甲前半部寬/背甲長（X3）、腹甲后半部前寬/背甲長（X4）、腹甲后半部后寬/背甲長（X5）、甲橋長/背甲長（X6）、喉盾寬/背甲長（X7）、喉盾縫長/背甲長（X8）、腹盾縫長/背甲長（X9）和肛盾縫長/背甲長（X10）。當(dāng)判別函數(shù)含有以上10 個變量時，建立的判別函數(shù)效果良好，所得判別公式如下：

中華草龜=783.936X1＋666.790X2＋117.351X3－108.260X4－185.567X5＋714.807X6＋593.752X7＋508.921X8＋71.984X9－14.342X10－665.829

中華花龜=857.281X1＋471.441X2＋59.295X3－132.825X4－64.874X5＋684.733X6＋440.335X7＋306.659X8＋172.282X9－19.938X10－575.971

雜種龜=825.599X1＋536.489X2＋119.892X3－170.109X4－113.135X5＋775.956X6＋480.404X7＋456.357X8＋149.029X9－60.558X10－635.052

將3 種龜?shù)?0 個比例性狀數(shù)值帶入各判別函數(shù)中，以所得最大函數(shù)值來判別該龜所屬類別。根據(jù)判別函數(shù)對所有觀測樣本進(jìn)行預(yù)測分類，綜合判別準(zhǔn)確率達(dá)到93.3%（表4）。60 只中華草龜代入判別函數(shù)回代分類，與實(shí)際相符的58 只，2 只錯判為雜種龜，判別準(zhǔn)確率為96.7%；60 只中華花龜回代分類，與實(shí)際相符的57 只，3 只錯判為雜種龜，判別準(zhǔn)確率為95.0%；60 只雜種龜回代分類，與實(shí)際相符的53 只，1 只錯判為中華草龜，6 只錯判為中華花龜，判別準(zhǔn)確率為88.3%。

表4 3 種龜判別分析后的結(jié)果Tab.4 The results of discrimination analysis of three species of tortoises

2.4 主成分分析

對草龜、花龜及雜種龜群體的可量比例參數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，共提取8 個主成分，累計貢獻(xiàn)率達(dá)85.05%。其中前4 個主成分的貢獻(xiàn)率分別為33.81%、11.01%、10.25%和8.13%，累計貢獻(xiàn)率達(dá)63.20%，這4 個主成分覆蓋群體總變異的絕大部分，說明幾個相互獨(dú)立因子可以分析3 種龜?shù)男螒B(tài)差異所隱含的信息。

3 種龜形態(tài)性狀的特征值、貢獻(xiàn)率和累計貢獻(xiàn)率見表5。對第一成分起主要作用的是：喉盾縫長/背甲長、喉盾寬/背甲長、殼高/背甲長、腹甲后半部前寬/背甲長、股盾縫長/背甲長、腹甲前半部寬/背甲長和腹甲長/背甲長，其中喉盾縫長、喉盾寬、殼高對主成分1 有主要貢獻(xiàn)（>0.700）；對第二成分起主要作用的是：腹甲后半部后寬/背甲長、肛盾縫長/背甲長、背甲寬/背甲長和腹甲后半部長/背甲長，其中腹甲后半部后寬對主成分2 有主要貢獻(xiàn)（>0.700）；對第三成分起主要作用的是：甲橋長/背甲長、腹盾縫長/背甲長和腹甲長/背甲長，其中甲橋長、腹甲縫長對主成分3 有主要貢獻(xiàn)。

從3 種龜?shù)纳Ⅻc(diǎn)圖分布情況（圖3）可以看出種間形態(tài)差異較大。雜種龜與中華草龜、中華花龜均有較大的重疊，在性狀特征上與親本均接近。中華草龜與中華花龜間沒有重疊。

圖3 3 種龜?shù)闹鞒煞址治鰣DFig.3 Scatter plots of principle components of two species of tortoises and their hybrid

3 討論

3.1 形態(tài)差異分析

雜交優(yōu)勢表現(xiàn)為雜種生存及繁殖能力的提高，這類在生物進(jìn)化學(xué)才有適應(yīng)意義。國內(nèi)外有很多龜鱉類雜交優(yōu)勢育種和利用的報道，并取得一定的成果。以洞庭湖鱉（♀）和黃河鱉（）雜交并經(jīng)過5 代群體選育的綠卡鱉，生長速度大于黃河鱉，而在稚幼階段明顯優(yōu)于其兩親本[13]。英明中華鱉是采用連續(xù)雜交技術(shù)對不同品系中華鱉進(jìn)行遺傳選育而得到的新品種，雜交后代優(yōu)勢明顯[14]。潘志等[15]對外來引進(jìn)的刺鱉（Apalone spinifera）和珍珠鱉（Apalone ferox）雜交子代的形態(tài)與生長進(jìn)行比較，結(jié)果表明，與親本相比，雜交子代攝食能力強(qiáng)，養(yǎng)殖成活率較高，具有較明顯的雜種優(yōu)勢。至今，發(fā)現(xiàn)龜類雜交已有30 多種[16]，但有關(guān)報道甚少。黃喉擬水龜（♀）與三線閉殼龜（）的雜種后代形態(tài)保留了雙親本獨(dú)有特征，但在形態(tài)特征上接近母本黃喉擬水龜，在背甲紋路、腹甲黑斑、四肢和尾腹面的皮膚顏色及起點(diǎn)位置等比例性狀存在差異[3]。

本研究表明，雜種龜在個體形狀、體色條紋、生長速度等方面遺傳了中華草龜和中華花龜雙親的特征，也有顯著的差異。主要表現(xiàn)在背甲顏色、棱突，皮膚條紋與親本對比差異強(qiáng)烈，在可數(shù)性狀方面，雜交龜與親本無顯著差異。在可量比例性狀上，部分指標(biāo)反映中華草龜>雜種龜>中華花龜，在體型特征上存在差異。聚類分析顯示，在整體形態(tài)上，雜交龜介于親本之間，但更接近母本中華草龜。判別分析可見，所得最大函數(shù)值來判別龜屬，綜合判別準(zhǔn)確率達(dá)到93.3%，可以較為準(zhǔn)確判別中華草龜、中華花龜及其雜種。由圖3 可知，3 種龜形態(tài)差異程度，雜種龜與親本重疊部分多，在形態(tài)特征上與親本均接近，而中華草龜與中華花龜間沒有重疊部分。本研究中，三種分析方法均得出了相同的結(jié)論。生物形態(tài)是物種對環(huán)境適應(yīng)的表現(xiàn)，也是物種多個性狀的集合，一般受遺傳因子和環(huán)境因素的共同作用[10,17]。

3.2 聚類分析、判別分析和主成分分析在龜類保護(hù)中的應(yīng)用

形態(tài)特征是物種間差異的直接體現(xiàn)，也是相似物種初步鑒別依據(jù)。不同物種的雜交后代通常表現(xiàn)兩個親本的中間態(tài)[18-20]，可數(shù)和可量性狀在形態(tài)學(xué)標(biāo)記中尤為重要。本實(shí)驗測量了雜交龜及其親本的形態(tài)特征，通過聚類分析、判別分析和主成分分析等統(tǒng)計學(xué)方法處理分析，結(jié)果顯示雜交龜保留親本雙方的性狀特征，對現(xiàn)有龜類雜交種資資源進(jìn)行評估，為龜類種質(zhì)資源保護(hù)和雜交選育提供理論依據(jù)。

在可量性狀比值方面，背甲寬/背甲長、殼高/背甲長、腹甲長/背甲長、腹甲后半部長/背甲長和腹甲前半部寬/背甲長等體型特征上存在差異，且雜種龜介于親本之間，在親本性狀表現(xiàn)具有偏向性。推測來自親本的遺傳因子在雜交子代性狀表達(dá)上具有喜好選擇性。

聚類分析從染色體、蛋白質(zhì)和DNA 分子等不同水平進(jìn)行龜鱉類的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析，得出不同的聚類分析結(jié)果。黃雪貞等[21]采用RAPD 技術(shù)分析了中華鱉日本群體（♀）×黃河群體（）的雜交子代的遺傳多樣性，顯示雜交子代遺傳多樣性優(yōu)于親代。賀剛等[22]利用線粒體DNA 的細(xì)胞色素b 基因分析表明，雜交龜與草龜遺傳距離最小，與花龜次之，與條頸龜（Cyclemys tcheponensis）和果龜（Notochelys platynota）最大。本實(shí)驗從形態(tài)學(xué)角度探究了雜交龜與親本間的遺傳變異關(guān)系，發(fā)現(xiàn)雜種龜與母本中華草龜形態(tài)距離更近，推測來自母本的遺傳因子在性狀表達(dá)調(diào)控方面更具優(yōu)勢。

判別分析是水生動物常用的鑒別方法。通過建立判別函數(shù)和相應(yīng)的測量指標(biāo)，使函數(shù)的形式較為簡便，且獲得更好的判別效果[23-25]。梁宏偉等[26]通過逐步判別法建立了淮河、黃河和日本3 個品系中華鱉的判別函數(shù)。結(jié)果顯示淮河品系中華鱉雌雄判別準(zhǔn)確率較高，綜合判別率為88.3%，判別效果最好；而日本品系中華鱉雌雄性別判別準(zhǔn)確率相對較低。楊貴強(qiáng)等[27]對安徽黃緣閉殼龜、臺灣黃緣閉殼龜和黃喉擬水龜3 種稚龜進(jìn)行了判別分析，得出貢獻(xiàn)較大的主要變量有腹甲寬／背甲長、甲橋長／背甲長、肱盾寬／背甲長、肱盾縫長／背甲長和胸盾縫長／背甲長5 個參數(shù)可作為鑒別上述3 種觀賞稚龜?shù)闹饕陀^依據(jù)。本實(shí)驗采用了逐步判別分析的方法，按照入選性狀的差異大小逐步進(jìn)行判別，最后選取了10 個變量，綜合判別準(zhǔn)確率達(dá)到93.3%，貢獻(xiàn)較大的變量主要集中在龜?shù)母共亢腕w寬，判別效果良好。構(gòu)建的判別公式提供了一種簡單易行的判別草龜、花龜及其雜種種質(zhì)的方法。

主成分分析是將多個觀察指標(biāo)簡化為少數(shù)方差貢獻(xiàn)率較大綜合因子（主成分）的方法，通過主成分分析圖概括不同群體間的形態(tài)差異[28]。本研究對3 種龜?shù)?5 個比例性狀進(jìn)行主成分分析，對第一成分起主要作用的是喉盾縫長、喉盾寬、殼高，對第二成分起主要作用的是腹甲后半部后寬，對第三成分起主要作用的是甲橋長、腹甲縫長。3 種龜?shù)男螒B(tài)差異主要體現(xiàn)在腹甲體型因子上。

綜上所述，龜類的外部形態(tài)測量為雜種鑒定提供了一個簡潔高效的途徑。但是，要全面評價雜交種及親本遺傳關(guān)系，還應(yīng)在生理生化、分子標(biāo)記等水平上深入研究。