摘 要：以CX-014雪茄茄衣晾制結(jié)束后的煙葉為材料，對(duì)其進(jìn)行微生物分離純化，從中篩選出了一株產(chǎn)酶豐富且酶活均處于中高水平的菌株H1，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定，并探究了在雪茄煙葉發(fā)酵過(guò)程中添加外源苯丙氨酸和葡萄糖對(duì)該菌株降解煙葉中大分子物質(zhì)、增加雪茄煙葉香氣成分的促進(jìn)作用。結(jié)果表明：H1菌株被鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）；在添加外源營(yíng)養(yǎng)物的條件下經(jīng)菌株H1發(fā)酵后的雪茄煙葉中果膠降解率達(dá)到34.93%，淀粉、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)和纖維素等大分子物質(zhì)的含量也明顯降低；當(dāng)接菌量為2.4×107 CFU/g，并添加0.25%苯丙氨酸和0.5%葡萄糖的外源物質(zhì)的情況下，雪茄煙葉在37℃下發(fā)酵6 d后，煙葉中新增了異佛爾酮和2，5-十八碳二炔酸甲酯等香氣物質(zhì)，且β-大馬酮、2-仲-丁基環(huán)戊酮等的含量明顯增多，香氣得到明顯改善。同時(shí)，菌株H1的產(chǎn)香發(fā)酵成本低，操作工藝簡(jiǎn)單，可以在工業(yè)生產(chǎn)中推廣，以提高煙葉品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌；雪茄煙葉；降解酶；品質(zhì)；增香

中圖分類號(hào)：TS444 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2023）04-0082-08

Abstract：With the cured wrapper of a cigar tobacco CX-014 as material， a strain H1 producing abundant hydrolases of good activities was" selectively obtained through microbial isolation and purification. Then the morphologic observation and molecular biology method were used for its identification. Whether it could facilitate the hydrolysis of macromolecules and the formation of aroma substances in cigar tobacco during the fermentation process in the presence of exogenous phenylalanine and glucose was further explored. The identification results showed that strain H1 was Bacillus velezensis. Relying on fermentation by strain H1 along with adding exogenous nutrients， the degradation rate of pectin in cigar leaves reached 34.93%， and the contents of macromolecules such as amylum， lignins， proteins and cellulose also decreased significantly. After 6-day fermentation at 37℃ under the conditions of an inoculation amount being 2.4×107 CFU/g and adding 0.25% phenylalanine and 0.5% glucose，" some new aromatic substances like isophorone and 2， 5-octadecadiynoic acid methyl ester appeared， meanwhile the contents of β-damascenone and 2-sec-butylcyclopentanone significantly increased， so that the aroma note of the cigar tobaccos was improved markedly. In conclusion， the flavoring fermentation cost of strain H1 is low and the operation process is simple， so it can be popularized in industrial production to improve the quality of tobacco leaves.

Key words： Bacillus velezensis; cigar tobacco leave; hydrolases; quality; flavoring

未經(jīng)醇化的雪茄煙葉雜氣較重，因此提高雪茄煙葉品質(zhì)必需進(jìn)行醇化，而在煙葉醇化過(guò)程中微生物的作用非常關(guān)鍵，雪茄煙葉經(jīng)微生物發(fā)酵后其香氣變得豐富、柔和[1]。目前研究人員認(rèn)為對(duì)雪茄煙葉進(jìn)行發(fā)酵和醇化是改善煙葉品質(zhì)的一個(gè)重要生化過(guò)程，其機(jī)理主要分為酶作用、微生物作用和化學(xué)作用3大類[2-3]。雪茄煙葉表面微生物能夠合成分泌多種胞外水解酶，這些酶可以加快淀粉、果膠、纖維素、蛋白質(zhì)和木質(zhì)素等大分子物質(zhì)的降解，將其轉(zhuǎn)化為一些小分子化合物，使化學(xué)成分協(xié)調(diào)，減輕辛辣和雜氣，增加香氣化合物含量，最終改善煙草品質(zhì)[4-6]。

煙草工作者在煙草發(fā)酵方面也進(jìn)行了大量研究，例如以提高雪茄煙葉品質(zhì)為最終目的，分離和鑒定發(fā)酵過(guò)程中雪茄煙葉表面的微生物。李志豪等[7]從雪茄外包皮煙葉上分離出蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）L-1，利用液態(tài)發(fā)酵方法研究了其產(chǎn)木聚糖酶的最佳發(fā)酵條件，分析比較該菌株對(duì)雪茄煙葉香氣物質(zhì)成分及含量的影響，得出該菌有降解煙葉中纖維素和半纖維素的功能，從而改善煙葉中香氣物質(zhì)的結(jié)論；薛磊等[8]從煙葉中篩選出可同時(shí)產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和果膠酶的微生物菌株YBG-5、YDP-23和YBM-6，將菌株組合形成復(fù)合微生物配方噴施到煙絲上發(fā)酵，與對(duì)照組相比，發(fā)酵樣的煙氣細(xì)膩度得到改善，大分子物質(zhì)含量下降明顯。

基于前人的研究，筆者以CX-014雪茄茄衣晾制結(jié)束后的煙葉為材料，對(duì)其進(jìn)行微生物分離純化，從中篩選出了一株產(chǎn)酶豐富且酶活均處于中高水平的菌株，探究了在雪茄煙葉中添加外源苯丙氨酸和葡萄糖對(duì)該菌株降解大分子物質(zhì)、增加雪茄煙葉香氣成分的促進(jìn)作用，以期為微生物在雪茄煙葉生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)酵所用雪茄煙葉為2021年湖北省恩施州CX-014雪茄茄衣晾制結(jié)束后的煙葉。

主要試劑有酪素（上海伯奧生物科技有限公司）、D-（+）-半乳糖醛酸（上海源葉生物科技有限公司）、木質(zhì)素（上海麥克林生化科技有限公司）、果膠（上海梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展公司），其他常規(guī)試劑（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，其中二氯甲烷為色譜純，其余試劑均為分析純）。

主要培養(yǎng)基及其配方如下。（1）淀粉篩選培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH值 7.0～7.2，115℃滅菌30 min。（2）淀粉酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g，蛋白胨10 g，酵母粉0.5 g，氯化鈉1 g，磷酸氫二鉀 2 g，硫酸鎂0.1 g，氯化鈣0.1 g，硫酸錳0.001 g，去離子水1 000 mL，pH值7.0～7.2，121℃滅菌20 min。（3）蛋白質(zhì)篩選培養(yǎng)基：脫脂奶粉5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母粉5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH值7.0～7.2，115℃滅菌30 min。（4）蛋白質(zhì)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨7. 0 g，酵母粉 5. 0 g，葡萄糖 10. 0 g，磷酸氫二鉀4. 0 g，去離子水1 000 mL，pH值 7. 0，121℃滅菌20 min。（5）果膠酶篩選培養(yǎng)基：果膠5 g，蛋白胨2 g，牛肉膏5 g，酵母粉5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH值7.0～7.2，121℃滅菌20 min。（6）果膠產(chǎn)酶培養(yǎng)基：果膠5.0 g，蛋白胨1.0 g，磷酸二氫鉀2.0 g，硫酸銨1.4 g，尿素0.3 g，七水硫酸鎂0.3g，氯化鈣0.3 g，七水硫酸鐵0.005 g，一水硫酸錳0.001 56 g，七水硫酸鋅0.001 4 g，六水氯化鈷0.002 g，吐溫–80 1 mL，去離子水1 000 mL，pH值 6.0，121℃滅菌20 min。（7）纖維素酶篩選培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母粉5 g，羧甲基纖維素鈉10 g，氯化鈉5 g，磷酸二氫鉀1 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH 值7.0～7.2，121℃滅菌20 min。（8）纖維素產(chǎn)酶配培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，羧甲基纖維素鈉5 g，pH值7.0～7.2，去離子水1 000 mL，121℃滅菌20 min。（9）木質(zhì)素篩選培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，苯胺藍(lán)2 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH 值7.0～7.2，121℃滅菌20 min。（10）木質(zhì)素產(chǎn)酶培養(yǎng)基：堿性木質(zhì)素2 g，葡萄糖 4 g，硫酸銨1.33 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸氫二鈉0.2 g，磷酸二氫鉀1 g，pH值 7.0，115℃滅菌30 min。（11）LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH值 7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雪茄煙葉中細(xì)菌的分離 稱取5 g發(fā)酵前的茄衣放入45 mL無(wú)菌水中，37℃、200 r/min搖床振蕩30 min，取0.5 mL液體，加到4.5 mL無(wú)菌水中，搖勻，反復(fù)稀釋得到10-4、10-5、10-6倍菌液。從10-4、10-5、10-6的稀釋液中分別吸取0.1 mL涂布于LB固態(tài)平板上，每個(gè)濃度下3個(gè)平行，于37℃培養(yǎng)48 h。長(zhǎng)出的單菌落用滅菌的竹簽挑取進(jìn)一步劃線分離，直到獲得純單一菌株。將不同形態(tài)特征的單菌落采用甘油保存方式，甘油管保藏于－80℃冰箱。

1.2.2 細(xì)菌降解能力檢測(cè) 將上述分離的細(xì)菌劃線于LB平板上培養(yǎng)出單菌落，再用滅菌后的竹簽挑取單菌落分別點(diǎn)接在淀粉、纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)及果膠篩選固體培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)48 h。淀粉平板用碘液染色，果膠和纖維素平板用剛果紅染色，蛋白質(zhì)平板和木質(zhì)素平板可以直接看到透明圈，無(wú)需染色。通過(guò)觀察菌落周圍是否有透明圈的產(chǎn)生來(lái)判斷細(xì)菌是否具有降解相應(yīng)大分子的能力。綜合上述結(jié)果篩選出可同時(shí)降解多種成分的細(xì)菌保存。

1.2.3 細(xì)菌酶活性測(cè)定 將初篩菌株在LB液態(tài)培養(yǎng)基中活化2次，再以起始OD 0.5/mL的接種量接入50 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)24 h。取產(chǎn)酶液在4℃、8 000 r/min離心10 min，吸取上清液作為粗酶液。采用DNS法[9]測(cè)定淀粉酶和果膠酶活性，參考姜心等[10]的方法測(cè)定纖維素酶活性，采用福林酚法[11]測(cè)定蛋白酶活性，漆酶（Lac）[12-14]、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（LiP）[15]和錳過(guò)氧化物酶（MnP）[16-17]活性均參考相應(yīng)文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)初篩菌株產(chǎn)酶活性高低進(jìn)行菌株復(fù)篩，選擇7種產(chǎn)酶活性均處于中高水平的菌株進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵效果研究。

1.2.4 菌種鑒定 將復(fù)篩菌株接種于LB固體培養(yǎng)基上，待菌落長(zhǎng)出后，對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征。采用試劑盒提取菌株DNA，以復(fù)篩菌株DNA為模板，使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）及1429R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴(kuò)增其16S rDNA片段。PCR反應(yīng)條件：94℃ 10 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物送昆泰銳生工生物工程（武漢）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，在NCBI基因庫(kù)中進(jìn)行菌株的同源性比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色結(jié)果及16S rDNA測(cè)序結(jié)果對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.5 復(fù)篩菌株發(fā)酵液對(duì)雪茄煙葉大分子化合物的降解效果研究 將復(fù)篩菌株用LB液態(tài)培養(yǎng)基活化2次后，發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min、4℃離心后棄去上清取下層菌體備用。稱取100 g雪茄煙葉，處理方式見(jiàn)表1。接菌量為2.4×107 CFU/g（煙葉重量），0.25%苯丙氨酸（煙葉重量），0.5%葡萄糖（煙葉重量），回潮后煙葉含水量為30%。將雪茄煙葉放在溫度37℃、相對(duì)濕度65%的恒溫恒濕箱中發(fā)酵7 d，發(fā)酵結(jié)束后將雪茄煙葉置于60℃烘箱中烘干粉碎，測(cè)定發(fā)酵前后雪茄煙葉中大分子化合物的含量。雪茄煙葉中淀粉含量采用酸解法測(cè)定[18]，纖維素含量采用纖維素含量試劑盒（索萊寶科技有限公司）測(cè)定，木質(zhì)素含量參考相關(guān)文獻(xiàn)[19]進(jìn)行測(cè)定，蛋白質(zhì)含量采用翟羽晨等[20]的方法測(cè)定，果膠含量采用果膠含量試劑盒（索萊寶科技有限公司）測(cè)定。

1.2.6 煙草常規(guī)化學(xué)成分測(cè)定 （1）煙草樣品制備：按YC/T 31—1996進(jìn)行。（2）水溶性總糖及還原糖測(cè)定：按YC/T 159—2002進(jìn)行。（3）總植物堿測(cè)定：按YC/T 160—2002進(jìn)行。（4）總氮測(cè)定：按YC/T 161—2002進(jìn)行。（5）鉀測(cè)定：按YCT 173—2003進(jìn)行。（6）氯測(cè)定：按YC/T 162—2011進(jìn)行。

1.2.7 雪茄煙葉中香氣成分測(cè)定 使用同時(shí)蒸餾萃取技術(shù)（SDE）處理煙葉樣品，再使用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析煙葉致香物質(zhì)成分及含量[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雪茄煙葉中產(chǎn)酶菌株的分離與篩選

將從雪茄煙葉樣品中分離出的16株細(xì)菌接種到不同種類的特定選擇性培養(yǎng)基中，測(cè)定其對(duì)淀粉、纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)和果膠的降解能力，以菌株可同時(shí)降解物質(zhì)種類的多少以及透明圈直徑和菌落直徑比（D/d）的大小作為篩選指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表2，共篩選出3株細(xì)菌，產(chǎn)酶豐富且透明圈直徑與菌落直徑比值較大，分別是H1、E7和F1。對(duì)3株細(xì)菌所產(chǎn)生的7種降解酶活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果（圖1）顯示，菌株H1的7種降解酶的酶活性均處于中高水平，所以選擇菌株H1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 篩選菌種的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 菌株H1在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落呈圓形，乳白色不透明，會(huì)粘連，表面有凸起褶皺、干燥、邊緣些許不規(guī)則（圖2A），鏡檢顯示菌體呈長(zhǎng)桿狀，經(jīng)革蘭氏染色確定為革蘭氏陽(yáng)性菌（圖2B）。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 提取菌株H1的基因組DNA，使用通用引物擴(kuò)增16S rDNA序列后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)，使用MEGA 7.0軟件建立菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）。菌株H1與Bacillus velezensis的同源性達(dá)到97%，初步鑒定菌株H1為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），并且在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，菌株H1也與Bacillus velezensis處于同一分支。

2.3 不同處理煙葉中大分子化合物的降解情況

從表3可以看出，雪茄煙葉經(jīng)H1菌株發(fā)酵后，5類大分子化合物相比于發(fā)酵前均有不同程度降低，且具有顯著性差異。發(fā)酵前雪茄煙葉中5類大分子物質(zhì)含量如下：淀粉9.42%、蛋白質(zhì)7.38%、果膠88.15 μmol/g、纖維素15.85%、木質(zhì)素7.63%。添加菌株H1發(fā)酵的2組（處理3和處理5）雪茄煙葉中果膠、纖維素降解效果最為明顯，與處理1相比，果膠含量分別降低了19.61%和34.93%，纖維素含量分別降低了13.88%和14.38%；與處理2相比，果膠含量分別降低了2.90%和21.40%，但纖維素含量差異未達(dá)顯著水平；對(duì)比處理2和處理3～處理5煙葉中大分子物質(zhì)含量，可知處理3～處理5均低于處理2，說(shuō)明菌株H1和外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的加入有利于大分子物質(zhì)的降解；外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的添加更有利于淀粉和纖維素的降解，可能是這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的加入促進(jìn)了雪茄煙葉上其他可分泌淀粉酶和纖維素酶菌株的生長(zhǎng)和代謝；處理5的大分子物質(zhì)含量是所有處理組中最低的，說(shuō)明添加外源苯丙氨酸和葡萄糖對(duì)菌株H1產(chǎn)生胞外酶降解大分子物質(zhì)有一定促進(jìn)作用。馬玲玲[22]從煙葉表面篩選分離出一株可以同時(shí)降解煙葉中淀粉和蛋白質(zhì)的枯草芽孢桿菌，將該菌株應(yīng)用于煙葉發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)煙葉的淀粉含量下降了33.87%，蛋白質(zhì)含量降低了20.00%；于少藤等[23]從煙葉表面分離鑒定出能有效降低煙葉中淀粉、纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)及果膠含量的假單胞菌yc10，優(yōu)化發(fā)酵條件后，發(fā)現(xiàn)煙葉中大分子物質(zhì)的降解效果均有提升，發(fā)酵后煙葉中果膠的降解效果較為顯著，降解率超過(guò)30%，纖維素的降解效果次之，淀粉的降解效果稍弱，而木質(zhì)素的降解效率最低（小于10%），這與筆者試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

2.4 不同處理煙葉常規(guī)化學(xué)成分分析

理化指標(biāo)的變化可在一定程度上表征或預(yù)測(cè)雪茄煙葉吸食品質(zhì)的變化，各指標(biāo)含量的均衡性直接影響雪茄煙葉的品質(zhì)[24]。其中，總糖和還原糖含量是衡量煙草品質(zhì)的重要指標(biāo)，與雪茄煙葉評(píng)吸質(zhì)量呈顯著正相關(guān)，但雪茄煙葉屬于晾曬煙，因?yàn)榱罆駸熣{(diào)制時(shí)間長(zhǎng)，糖類幾乎被呼吸作用消耗殆盡，所以調(diào)制后煙葉含糖極低[25]。由表4可知，發(fā)酵前雪茄煙葉還原糖和總糖含量最高，發(fā)酵后均有不同程度的降低，其中處理3的還原糖含量最低，可能是因?yàn)槲⑸锷L(zhǎng)過(guò)程中消耗了糖類物質(zhì)，處理5的還原糖和總糖含量高于處理3，可能是因?yàn)樘砑恿送庠雌咸烟?。發(fā)酵后煙葉的煙堿含量較發(fā)酵前均有明顯下降，其中處理5的煙堿含量最低，可能是菌株H1具有降解煙堿的能力。發(fā)酵后煙葉的總氮含量也有所下降，可能是煙葉中含氮化合物被降解所致。鉀氯比低于2的煙葉所制煙易熄火，鉀氯比在4以上的煙葉燃燒性較好[26]，各處理中除了處理3的鉀氯比小于4外，其余處理的鉀氯比均≥4，以處理4的鉀氯比最高，為4.76。理化指標(biāo)分析結(jié)果初步表明，經(jīng)過(guò)H1發(fā)酵處理后，雪茄煙葉的吸食品質(zhì)有所改善。

2.5 不同處理煙葉中香氣成分的分析

煙草香氣成分是評(píng)價(jià)雪茄煙質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，而煙草香氣是由致香物質(zhì)成分和組成比例來(lái)決定的[27]。雪茄煙葉香氣成分十分復(fù)雜，按不同的致香基團(tuán)可把雪茄煙葉香氣成分分為酸類、醇類、酮類、醛類、酯類、內(nèi)酯類、酚類、氮雜環(huán)類、呋喃類、酰胺類、醚類及烴類等[28]。為了分析外源添加苯丙氨酸、葡萄糖以及菌株H1對(duì)雪茄煙葉中揮發(fā)性物質(zhì)種類及含量的影響，通過(guò)GC-MS對(duì)發(fā)酵后雪茄煙葉進(jìn)行檢測(cè)分析，利用NIST 11譜庫(kù)進(jìn)行檢索，結(jié)果如表5所示，共鑒定出39種揮發(fā)性化合物，其中，醛類（10種）和醇類（13種）物質(zhì)數(shù)量最多，其次是酮類物質(zhì)（7種）、酸酯類物質(zhì)（3種）、烴類物質(zhì)（2種）、其他類（4種）。由表5可以看出，與發(fā)酵前的煙葉（處理1）相比，發(fā)酵后的煙葉香氣物質(zhì)的總含量都有明顯上升，其中處理3、4、5的雪茄煙葉香氣物質(zhì)總量與發(fā)酵前相比分別提高了1.62%、31.67%、33.83%；相較于處理2，處理3、4、5的雪茄煙葉香氣總量分別提高了0.95%、30.81%、32.95%，說(shuō)明單獨(dú)添加外源苯丙氨酸和葡萄糖或者菌株H1都能夠提升煙葉香氣物質(zhì)總含量，同時(shí)添加外源苯丙氨酸和葡萄糖以及H1菌株發(fā)酵則促進(jìn)效果更加顯著。

為了確定H1對(duì)煙葉香氣物質(zhì)形成的影響，分別了做了3組對(duì)照試驗(yàn)，分別是：無(wú)菌水處理、0.5%葡萄糖與0.25%苯丙氨酸、貝萊斯芽孢桿菌H1混合處理。處理4和處理5中苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物相較于處理1分別提高了327.62%和294.87%，相較于處理2分別提高了203.03%和179.82%。處理4和處理5中苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量遠(yuǎn)高于其余處理，可能是因?yàn)橥庠刺砑拥谋奖彼嵩诎l(fā)酵過(guò)程被土著微生物和貝萊斯芽孢桿菌代謝轉(zhuǎn)化而成。

添加H1菌株進(jìn)行發(fā)酵后，處理3和處理5的酮類化合物中新增了異佛爾酮、2，5-十八碳二炔酸甲酯，說(shuō)明添加菌株H1發(fā)酵能夠產(chǎn)生新的物質(zhì)，賦予煙葉新的特征香氣；添加外源苯丙氨基酸發(fā)酵后，處理4和處理5雪茄煙葉中苯乙醛、苯甲醛、苯乙醇、苯甲醇和異戊酸香葉酯含量較高，還新增了3-芐氧基-1-丙醇、鄰二甲苯。苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是煙葉中重要的致香成分，是花香和果香香味的代表物質(zhì)，可以豐富煙葉香氣，提高煙葉吸食品質(zhì)，說(shuō)明添加外源苯丙氨酸作為前體物質(zhì)能夠使煙葉中苯丙氨酸的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量得到提升，改善煙葉香氣。2-（4-甲基環(huán)己-3-烯-1-基）丙醛、2，5，8-三甲基-1-四醇、棕櫚油酸、7-十四碳烯等僅在處理5煙葉中出現(xiàn)，可能是菌株H1的代謝產(chǎn)物和苯丙氨酸在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)，催化煙葉的化學(xué)成分發(fā)生分解或轉(zhuǎn)化，使其轉(zhuǎn)變成為小分子的香氣物質(zhì)，這些小分子物質(zhì)可能是各種香味化合物前體物或中間產(chǎn)物。

圖4是雪茄煙葉中主要香氣物質(zhì)做成的熱圖，包含煙草中常見(jiàn)的致香成分，例如異佛爾酮、β-大馬酮、苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、異戊酸香葉酯等。其中，異佛爾酮具有涼爽的木質(zhì)氣味和類似樟腦和皮革的氣味；β-大馬酮具有濃烈的玫瑰芳香[29]，賦予雪茄煙氣花香；苯乙醇和苯甲醇具有花香、玫瑰香；異戊酸香葉酯具有玫瑰香氣及蘋果甜味[30]。4-乙烯基愈創(chuàng)木酚在添加外源苯丙氨酸和葡萄糖的處理中略微上升，處理4和處理5的煙葉中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚含量粉筆比處理2的增加了18.52%和20.54%，該物質(zhì)具有強(qiáng)烈的香辛料、丁香以及炒花生氣味[30]，是辛香味的代表物質(zhì)。由此可知，添加菌株H1和外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以改善雪茄煙葉的香吃味。

3 討論與結(jié)論

目前，改善雪茄煙葉質(zhì)量的主要措施是將對(duì)煙葉品質(zhì)有顯著影響的大分子物質(zhì)降解或通過(guò)發(fā)酵將它們轉(zhuǎn)化成小分子的香氣物質(zhì)。該研究從雪茄煙葉表面篩選出1株降解大分子物質(zhì)能力較強(qiáng)的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）H1，將其應(yīng)用在雪茄煙葉的發(fā)酵中，可減少煙草燃吸過(guò)程中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)和刺激性氣體，增加雪茄煙葉中的香氣物質(zhì)，改善雪茄煙葉品質(zhì)。

Li等[30]從雪茄煙葉中篩選出一株可以產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶的貝萊斯芽孢桿菌，通過(guò)單因素和響應(yīng)面法確定了雪茄煙葉發(fā)酵最佳工藝，發(fā)現(xiàn)在最佳工藝條件下雪茄煙葉中纖維素降解率最高可達(dá)31.69%，且雪茄的香氣物質(zhì)含量增加了26.1%，β-大馬士酮、巨豆三烯酮、法尼基丙酮和茄酮含量顯著高于發(fā)酵前處理，說(shuō)明功能性微生物的添加可以明顯改善煙葉的香氣質(zhì)量。曾婉俐等[31]通過(guò)煙葉浸提物培養(yǎng)基篩選出一株甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌HD-40，利用該菌株發(fā)酵煙葉，經(jīng)GC-MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)菌株處理的煙葉發(fā)酵液相比，其所含的酯類、醛類、酸類等對(duì)香氣有貢獻(xiàn)的成分明顯增加，其中特別是3-羥基-2-丁酮的比例高達(dá)60%以上，表明該菌株發(fā)酵煙葉可產(chǎn)生明顯奶香味。張鵬等[32]從煙葉中篩選得到一株產(chǎn)果香型菌株R59，經(jīng)鑒定其為產(chǎn)黑色素短梗霉，利用R59菌株發(fā)酵煙葉，經(jīng)GC-MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該菌株能夠產(chǎn)生11種香氣化學(xué)物質(zhì)，其中苯乙醇、苯乙醛和醋酸異戊酯等含量較高，使煙葉呈現(xiàn)果香；將R59菌株的發(fā)酵液噴灑至煙絲表面后進(jìn)行感官質(zhì)量評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)噴灑的發(fā)酵液可有效改善煙絲的協(xié)調(diào)性、香氣和余味等。

通過(guò)分析雪茄煙葉樣品的香氣成分發(fā)現(xiàn)，只添加H1菌株而不添加外源物質(zhì)發(fā)酵（處理3），雪茄煙葉中的醛類、醇類等香氣物質(zhì)的含量均有所增加；而添加外源苯丙氨酸和葡萄糖的處理4和處理5中，苯丙氨酸代謝產(chǎn)物增多。苯乙醇、苯甲醇、苯甲醛、苯乙醛等是雪茄煙葉中重要的致香物質(zhì)，與煙草的香氣特征密切相關(guān)。添加H1菌株的處理3和處理5中，酮類化合物中新增了異佛爾酮和2，5-十八碳二炔酸甲酯，可使煙葉具有獨(dú)特的香韻。

在添加外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的條件下經(jīng)菌株H1發(fā)酵后的雪茄煙葉中果膠降解率達(dá)到34.93%，淀粉、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)和纖維素等大分子物質(zhì)的含量也明顯降低。當(dāng)接菌量為2.4×107 CFU/g，并添加0.25%苯丙氨酸和0.5%葡萄糖的外源物質(zhì)的情況下，雪茄煙葉在37℃下發(fā)酵6 d后，煙葉中新增了異佛爾酮和2，5-十八碳二炔酸甲酯等香氣物質(zhì)，且β-大馬酮、2-仲-丁基環(huán)戊酮等的含量明顯增多，香氣得到明顯改善。同時(shí)，菌株H1的產(chǎn)香發(fā)酵成本低，操作工藝簡(jiǎn)單，可以在工業(yè)生產(chǎn)中推廣，以提高煙葉品質(zhì)。

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（責(zé)任編輯：張煥裕）