劉玉婷 唐志慧 賓瓊

關(guān)鍵詞：肝豆?fàn)詈俗冃? 高通量核苷酸序列分析; ATP7B基因

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金（2018JJB140029）;? 廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目

A case of hepatolenticular degeneration caused by ATP7B p.Ser1369Tyrfs*24 mutation

LIU Yuting， TANG Zhihui， BIN Qiong. （Department of Pediatrics， The Affiliated Hospital of Guilin Medical University， Guilin， Guangxi 541001， China）

Corresponding author：

BIN Qiong， binqiong1386@126.com （ORCID：0000-0002-0555-4219）

Key words：

Hepatolenticular Degeneration; High-Throughput Nucleotide Sequencing; ATP7B Gene

Research funding：

Natural Science Foundation of Guangxi Province （2018JJB140029）; Guangxi Medical and Health Key Disciplines

肝豆?fàn)詈俗冃杂址Q(chēng)Wilson?。╓ilsons disease， WD），是由一種銅代謝障礙所致的常染色體隱性遺傳病，其發(fā)病機(jī)制主要是位于第13號(hào)染色體長(zhǎng)臂（13q14.3～q21.1）上的ATP7B基因突變，導(dǎo)致ATP7B蛋白功能障礙引起銅排泄障礙，進(jìn)而造成銅大量沉積于組織器官，尤以肝臟、大腦多見(jiàn)［1］。目前WD全球患病率為1/5 000～1/30 000，ATP7B突變基因攜帶率為1/90［2-3］，該疾病主要通過(guò)血清銅藍(lán)蛋白、24 h尿銅、青霉胺負(fù)荷試驗(yàn)、肝細(xì)胞含銅測(cè)定及基因測(cè)序等檢查進(jìn)行輔助診斷［1］。WD是一種早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療可有效遏制疾病進(jìn)展、預(yù)后良好的遺傳性疾病，因此早期診斷和治療可大大減少該病的致殘率及死亡率。本文通過(guò)對(duì)先證者及其家系的基因檢測(cè)并結(jié)合相關(guān)輔助檢查，明確了患兒及其胞兄WD的診斷，進(jìn)一步豐富了ATP7B基因突變譜。

1 病例資料

先證者，患兒男性，5歲3月齡，1年前因體檢發(fā)現(xiàn)肝功能異常，未予處理。于2021年11月以“發(fā)現(xiàn)肝功能異常1年”為主訴至本院兒科住院。查體：肝肋下4 cm可觸及，質(zhì)韌，邊鈍，無(wú)壓痛，余無(wú)特殊。完善WD相關(guān)檢查：肝功能示總膽紅素4.95 μmol/L，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶180.59 U/L，天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)移酶119.6 U/L；銅藍(lán)蛋白5.9 mg/dL；24 h尿銅92.7 μg；頭顱MRI未見(jiàn)明顯異常；腹部MRI提示脂肪肝，肝肋下4 cm；眼部檢查提示雙眼上方角鞏膜緣見(jiàn)血管翳，下方角鞏膜緣見(jiàn)少量色素沉著，裂隙燈檢查未見(jiàn)明顯角膜色素環(huán)（K-F環(huán)）；其余檢查：凝血功能示纖維蛋白原1.71 g/L；凝血因子檢測(cè)示多種凝血因子活性降低，其中凝血因子Ⅱ活動(dòng)度54.5%，凝血因子Ⅸ活動(dòng)度60.3%，凝血因子Ⅹ活動(dòng)度65.1%，凝血因子Ⅺ活動(dòng)度62.9%；肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒核酸、自身免疫性肝病相關(guān)檢查均未見(jiàn)異常。追問(wèn)家族史，先證者胞兄亦有長(zhǎng)期肝功能異常病史，檢查銅藍(lán)蛋白5.0 mg/dL，父母否認(rèn)肝功能異常，因此建議該家族完善WD相關(guān)基因檢測(cè)。采集先證者、父母及兄長(zhǎng)外周血2～3 mL，根據(jù)核酸提取及純化試劑（博奧木華）操作說(shuō)明書(shū)要求，從外周血中提取基因組DNA。采用QIAseq FX DNA Library Kit試劑盒及定制的單基因病panel，制備包含ATP7B基因全部外顯子及剪切區(qū)域的文庫(kù)，采用AMPure XP beads純化體系進(jìn)行純化并采用Quant-iTTM 1X dsDNA HS Assay Kit和QubitTM熒光計(jì)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量檢測(cè)。采用NadPrep NanoBlockers（for Illumina）、NadPrep Hybrid Capture Reagents、KAPA Library Amplification、NovaSeq 6000 Reagent試劑盒，按照操作說(shuō)明書(shū)要求，對(duì)先證者文庫(kù)雜交捕獲并進(jìn)行捕獲后產(chǎn)物的擴(kuò)增、純化并在NovaSeq 6000測(cè)序儀上進(jìn)行高通量測(cè)序。與hg19的參考序列和基因組分析工具包進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行變異調(diào)用。使用ANNOVAR工具對(duì)變異進(jìn)行分析，該工具包含注釋數(shù)據(jù)庫(kù)，如1000基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)、ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)、多態(tài)性表型v2數(shù)據(jù)庫(kù)以及SIFT數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)先證者的可疑致病位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。擴(kuò)增區(qū)域1∶chr13∶52523855+52524461，對(duì)應(yīng)的引物序列正向?yàn)镃AACGTCAAAGTTGACATGATG，反向?yàn)門(mén)GGATGGGAAAGTCCTGG；擴(kuò)增區(qū)域2∶chr13∶52509545+52510015，對(duì)應(yīng)的引物序列正向?yàn)锳ATTGCCTGCTCATGGTG，反向?yàn)镃AGCTTTCTAGGAAGCCTCAC，擴(kuò)增長(zhǎng)度為500 bp。采用ABI9700 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件如下：95 ℃變性5 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物純化后用ABI3730基因分析儀進(jìn)行雙向測(cè)序，Sequencher軟件分析測(cè)序結(jié)果。

先證者家系遺傳圖及基因測(cè)序結(jié)果如圖1所示，先證者的ATP7B基因編碼區(qū)存在2個(gè)變異，其中遺傳自母親的c.2662A＞C（p.Thr888Pro）為ATP7B基因編碼區(qū)的錯(cuò)義變異（圖1a），該基因位點(diǎn)突變最近已有文獻(xiàn)［4-5］報(bào)道為WD的致病突變，且與現(xiàn)有文獻(xiàn)［6-8］報(bào)道的WD致病突變（p.Ile1148Thr；p.Pro992Leu）呈反式排列，故該變異確定為致病變異。另一變異遺傳自父親的c.4106delC（p.Ser1369Tyrfs*24）為ATP7B基因編碼區(qū)的移碼變異（圖1b），該變異目前未見(jiàn)ATP7B基因變異數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)報(bào)道，為新發(fā)突變。同時(shí)，先證者兄長(zhǎng)的ATP7B基因測(cè)序結(jié)果同先證者，突變位點(diǎn)詳見(jiàn)表1。通過(guò)基因分析可見(jiàn)，該家系中父親的ATP7B基因發(fā)生c.4106delC缺失突變，引起第1369位點(diǎn)發(fā)生移碼突變，由絲氨酸突變?yōu)槔野彼?，并繼續(xù)編碼23個(gè)氨基酸后終止。此突變理論上導(dǎo)致該基因編碼氨基酸序列的提前終止，該變異下游仍有多個(gè)無(wú)義變異致病的報(bào)道［9-11］，提示該變異所致氨基酸序列缺失部分對(duì)蛋白質(zhì)功能有重要作用。先證者和兄長(zhǎng)均有WD的表型，基因測(cè)序結(jié)果顯示二者基因型相同，根據(jù)遺傳圖譜分析（圖1c），父母分別攜帶1個(gè)突變，2個(gè)小孩均遺傳了2個(gè)突變，符合常染色體隱性遺傳模式中復(fù)合雜合突變致病的機(jī)制。根據(jù)以上證據(jù)，ATP7B c.4106delC（p.Ser1369Tyrfs*24）考慮為新發(fā)的致病突變。

2 討論

WD發(fā)病可見(jiàn)于任何年齡，但多起病于兒童及青少年期［12］，根據(jù)臨床癥狀可分為以下分型。（1）肝型：WD中最常見(jiàn)類(lèi)型，該型多見(jiàn)于兒童及青少年，以肝損傷為表現(xiàn)，可見(jiàn)進(jìn)行性轉(zhuǎn)氨酶升高、急性或慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化甚至急性肝衰竭，但也可以無(wú)癥狀表現(xiàn)。（2）腦型：以神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主，常較肝型發(fā)病晚10年，可出現(xiàn)智力倒退、構(gòu)音障礙、吞咽障礙、運(yùn)動(dòng)障礙、不自主運(yùn)動(dòng)、震顫、精神癥狀，該型癥狀輕時(shí)不易發(fā)現(xiàn)，察覺(jué)時(shí)已進(jìn)入中后期。（3）其他型：如出現(xiàn)腎臟疾病、骨病、肌肉疾病、皮膚色素沉著、K-F環(huán)及溶血性貧血等。（4）混合型：以上各型的組合［1，13］。WD的診斷金標(biāo)準(zhǔn)為肝穿刺活組織檢查肝細(xì)胞銅含量＞250 μg/g，但其為有創(chuàng)性檢查，故臨床應(yīng)用較少［14］。目前該病主要通過(guò)臨床表現(xiàn)結(jié)合輔助檢查如生化指標(biāo)、影像學(xué)及基因檢測(cè)進(jìn)行診斷，其中生化指標(biāo)主要包括血清銅藍(lán)蛋白＜200 mg/L、24 h尿銅＞100 μg，影像學(xué)例如腹部彩超、CT、MRI及頭顱MRI（最常見(jiàn)的是基底節(jié)區(qū)或橋腦的改變）等。結(jié)合本病例，先證者為學(xué)齡前兒童，以肝臟病變?yōu)槭装l(fā)癥狀，出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶升高、多種凝血因子活動(dòng)度降低、脂肪肝，肝大、血清銅藍(lán)蛋白明顯降低、尿銅升高等表現(xiàn)，因此考慮可能為肝型WD，為進(jìn)一步驗(yàn)證，建議家屬完善家系基因檢測(cè)。

隨著基因檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，加之ATP7B基因突變位點(diǎn)的報(bào)道增加，基因檢測(cè)成為WD的一線篩查方法。根據(jù)人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)記載，目前ATP7B基因發(fā)現(xiàn)有938個(gè)突變位點(diǎn)，種族、地域分布與突變的頻率和種類(lèi)顯著相關(guān)，其中歐洲WD以c.3207C＞A（His1069Gln）為最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)，基因頻率為13%～61%，亞洲WD以c.2333G＞T（Arg778Leu）為常見(jiàn)突變位點(diǎn)，基因頻率為34%～38%［13］。另外Cheng等［15］針對(duì)中國(guó)WD人群研究發(fā)現(xiàn)，肝型多見(jiàn)于p.Ser406Ala、p.Val456Leu突變，腦型多見(jiàn)于c.2755C＞G（p.Arg919Gly）、c.3443T＞C （p.I1e1148Thr）突變，而c.2804C＞T（p.Thr935Met）突變常表現(xiàn)為混合型。Li等［16］研究統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，WD先證者的直系兄弟姐妹患WD的概率為25%，而其子女患WD的概率為0.5%。在歐洲兒童WD診療指南［17］中也提出，一旦確診WD，先證者的一級(jí)親屬（兄弟姐妹、后代及父母）均應(yīng)完善肝功能、銅代謝指標(biāo)及基因檢測(cè)。

根據(jù)2001年德國(guó)萊比錫第8次WD國(guó)際會(huì)議上制訂的Leipzig評(píng)分［18］，并結(jié)合本病例已完善的相關(guān)檢查結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，先證者Leipzig評(píng)分為5分（24 h尿銅92.7 μg計(jì)1分，ATP7B基因外顯子測(cè)序?yàn)閺?fù)合雜合突變計(jì)4分），其兄長(zhǎng)Leipzig評(píng)分為4分（ATP7B基因外顯子測(cè)序?yàn)閺?fù)合雜合突變計(jì)4分），兩者總分均≥4分，故均診斷為WD。

綜上，通過(guò)本病例研究明確了c.2662A＞C（p.Thr888Pro）及c.4106delC（p.Ser1369Tyrfs*24）突變位點(diǎn)為該家系患有WD的遺傳因素，同時(shí)該家系的c.4106delC（p.Ser1369Tyrfs*24）移碼突變?yōu)锳TP7B基因新發(fā)突變位點(diǎn)，進(jìn)一步豐富了ATP7B基因突變譜。年齡＜10歲的患者若以肝臟疾病為首發(fā)癥狀起病時(shí)，需警惕WD可能。對(duì)高度疑似及確診的WD患者應(yīng)進(jìn)行直系親屬的WD篩查，以便于早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，進(jìn)而有效遏制疾病進(jìn)展，減少該病的致殘率及死亡率。

倫理學(xué)聲明：本例報(bào)告已獲得患者家屬知情同意。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：劉玉婷負(fù)責(zé)撰寫(xiě)論文；唐志慧負(fù)責(zé)收集資料；賓瓊負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫(xiě)文章，修改文章及最后定稿。

參考文獻(xiàn)：

［1］Inherited Metabolic Liver Disease Collaboration Group， Chinese Society of Hepatology， Chinese Medical Association. Guidelines for the diagnosis and treatment of hepatolenticular degeneration （2022 edition）［J］. Chin J Hepatol， 2022， 30（1）： 9-20. DOI： 10.3760/cma.j.cn501113-20211217-00603.

中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)遺傳代謝性肝病協(xié)作組. 肝豆?fàn)詈俗冃栽\療指南（2022年版）［J］. 中華肝臟病雜志， 2022， 30（1）： 9-20. DOI： 10.3760/cma.j.cn501113-20211217-00603.

［2］GITLIN JD. Wilson disease［J］. Gastroenterology， 2003， 125（6）： 1868-1877. DOI： 10.1053/j.gastro.2003.05.010.

［3］DONG Y， NI W， CHEN WJ， et al. Spectrum and classification of ATP7B variants in a large cohort of Chinese patients with Wilsons disease guides genetic diagnosis［J］. Theranostics， 2016， 6（5）： 638-649. DOI： 10.7150/thno.14596.

［4］LU ZK， CHENG J， LI SM， et al. Phenotypes and ATP7B gene variants in 316 children with Wilson disease［J］. Chin J Pediatr， 2022， 60（4）： 317-322. DOI： 10.3760/cma.j.cn112140-20210827-00708.

盧致琨， 程靜， 黎絲敏， 等. 肝豆?fàn)詈俗冃曰純?16例臨床表型和ATP7B基因變異特征［J］. 中華兒科雜志， 2022， 60（4）： 317-322. DOI： 10.3760/cma.j.cn112140-20210827-00708.

［5］ZHOU J， LIAO JM， LIAO L， et al. A rare ATP7B genotype identified in the siblings with hepatolenticular degeneration and their pedigree analysis［J］. J Clin Hepatol， 2022， 38（5）： 1122-1125. DOI： 10.3969/j.issn.1001-5256.2022.05.029.

周潔， 廖金卯， 廖玲， 等. 罕見(jiàn)基因型的肝豆?fàn)詈俗冃越忝眉捌浼蚁祱?bào)告［J］. 臨床肝膽病雜志， 2022， 38（5）： 1122-1125. DOI： 10.3969/j.issn.1001-5256.2022.05.029.

［6］SCHUSHAN M， BHATTACHARJEE A， BEN-TAL N， et al. A structural model of the copper ATPase ATP7B to facilitate analysis of Wilson disease-causing mutations and studies of the transport mechanism［J］. Metallomics， 2012， 4（7）： 669-678. DOI： 10.1039/c2mt20025b.

［7］XIAO H， DENG S， DENG X， et al. Mutation analysis of the ATP7B gene in seven Chinese families with Wilsons disease［J］. Digestion， 2019， 99（4）： 319-326. DOI： 10.1159/000493314.

［8］HUA R， HUA F， JIAO Y， et al. Mutational analysis of ATP7B in Chinese Wilson disease patients［J］. Am J Transl Res， 2016， 8（6）： 2851-2861.

［9］LEPORI MB， LOVICU M， DESSI V， et al. Twenty-four novel mutations in Wilson disease patients of predominantly Italian origin［J］. Genet Test， 2007， 11（3）： 328-332. DOI： 10.1089/gte.2007.0015.

［10］BALASHOVA MS， TULUZANOVSKAYA IG， GLOTOV OS， et al. The spectrum of pathogenic variants of the ATP7B gene in Wilson disease in the Russian Federation［J］. J Trace Elem Med Biol， 2020， 59： 126420. DOI： 10.1016/j.jtemb.2019.126420.

［11］ABDELGHAFFAR TY， ELSAYED SM， ELSOBKY E， et al. Mutational analysis of ATP7B gene in Egyptian children with Wilson disease： 12 novel mutations［J］. J Hum Genet， 2008， 53（8）： 681. DOI： 10.1007/s10038-008-0298-7.

［12］XIONG F， KUAI Y， XIE SY， et al. The necessity for hepatolenticular degeneration screening among children based on the different results of two cases［J/CD］. Chin J Liver Dis （Electronic Version）， 2021， 13（2）： 69-72. DOI： 10.3969/j.issn.1674-7380.2021.02.012.

熊復(fù)， 蒯鈺， 謝雙宇， 等. 從2例患兒的不同結(jié)局探討兒童肝豆?fàn)詈俗冃院Y查的必要性［J/CD］. 中國(guó)肝臟病雜志（電子版）， 2021， 13（2）： 69-72. DOI： 10.3969/j.issn.1674-7380.2021.02.012.

［13］LIANG C， BAI L， ZHENG SJ. Research advances in the genotype-phenotype correlation， diagnosis， treatment， and screening of Wilsons disease［J］. J Clin Hepatol， 2019， 35（9）： 2116-2119. DOI： 10.3969/j.issn.1001-5256.2019.09.052.

梁晨， 白麗， 鄭素軍. Wilson病基因型-表型關(guān)系、診斷、治療及篩查研究進(jìn)展［J］. 臨床肝膽病雜志， 2019， 35（9）： 2116-2119. DOI： 10.3969/j.issn.1001-5256.2019.09.052.

［14］OE S， HONMA Y， YABUKI K， et al. Importance of a liver biopsy in the management of Wilson disease［J］. Intern Med， 2020， 59（1）： 77-81. DOI： 10.2169/internalmedicine.3440-19.

［15］CHENG N， WANG H， WU W， et al. Spectrum of ATP7B mutations and genotype-phenotype correlation in large-scale Chinese patients with Wilson Disease［J］. Clin Genet， 2017， 92（1）： 69-79. DOI： 10.1111/cge.12951.

［16］LI H， LIU L， LI Y， et al. Familial screening of children with Wilson disease： Necessity of screening in previous generation and screening methods［J］. Medicine （Baltimore）， 2018， 97（27）： e11405. DOI： 10.1097/MD.0000000000011405.

［17］SOCHA P， JANCZYK W， DHAWAN A， et al. Wilsons disease in children： A Position Paper by the Hepatology Committee of the European Society for Paediatric Gastroenterology， Hepatology and Nutrition［J］. J Pediatr Gastroenterol Nutr， 2018， 66（2）： 334-344. DOI： 10.1097/MPG.0000000000001787.

［18］BANDMANN O， WEISS KH， KALER SG. Wilsons disease and other neurological copper disorders［J］. Lancet Neurol， 2015， 14（1）： 103-113. DOI： 10.1016/S1474-4422（14）70190-5.

收稿日期：

2022-08-04；錄用日期：2022-09-05

本文編輯：葛俊