康 溥，趙夢坡，黃育浩，呂宗吉，王曉虎

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所，廣東 廣州 510640；3.東莞市動物疫病預(yù)防控制中心，廣東 東莞 523128）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由PRRSV 引起的一種高度接觸性傳染病，主要表現(xiàn)為妊娠母豬流產(chǎn)以及各年齡豬只患呼吸道疾病。PRRS 于1987 年首次在美國北卡羅萊納州發(fā)現(xiàn)，1992 年成功分離出歐洲型毒株LV 和美洲型毒株VR-2332，這兩種毒株核苷酸同源性約60%，抗原性差異大，免疫學(xué)上無交叉保護［1］。PRRS 一直廣泛流行于歐洲、亞洲、北美等地的養(yǎng)豬國家，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前，我國流行的美洲型毒株可分為4 個譜系［2］，分別為譜系1（NADC30、JL580 等中等毒力毒株）、譜系3（QYYZ、GM2 等低致病毒株）、譜系5（VR2332-like 毒 株）、譜 系8（JXA1、TJ、TA-12 等高致病毒株以及CH-1a 為代表的經(jīng)典毒株）。其中處于譜系8.7 的HP-PRRSV 和譜系1的NADC30-like 毒株是我國流行的優(yōu)勢毒株［3］。歐洲型毒株在我國較為少見。ORF5基因編碼GP5 蛋白。Stadejek 等［4］使用鄰接法構(gòu)建ORF5系統(tǒng)發(fā)育樹，將歐洲型PRRSV 分為4 個亞型。近年來，在黑龍江、遼寧、河北、山東等地部分豬場已檢測出歐洲型PRRS［5］。

不同PRRSV 毒株的全基因組存在遺傳變異，以NSP2和ORFS為主［6］。因此，GP5 經(jīng)常作為分子流行病學(xué)的研究對象。作為PRRSV 一種重要的囊膜蛋白，GP5 被證明與病毒感染、毒力、中和相關(guān)。近年來一些生物信息學(xué)分析也聚焦于GP5。通過對GP5 的結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，GP5 包含1個N 端信號肽、2 個高變區(qū)、3 個跨膜區(qū)和11 個表位［7］。其中表位包括誘餌表位、初級中和表位（Primary Neutralizing Epitopes，PNE）、T 細(xì)胞表位和 B 細(xì)胞表位。這些表位由特定的氨基酸序列決定，一些氨基酸的突變和替換會導(dǎo)致不同亞系或者同一亞系的不同個體之間產(chǎn)生抗原差異。由于GP5 含有多個中和表位，因此基于GP5 的基因工程疫苗一直以來是PRRSV 疫苗研究的熱點。與傳統(tǒng)的滅活苗或者減毒活疫苗相比，基因工程疫苗在免疫效果與安全性等方面具有一定優(yōu)勢。近年來，研究者構(gòu)建了DNA 疫苗、亞單位疫苗、活載體疫苗等新型疫苗。但這些疫苗距離商品化應(yīng)用還有一段距離。

1 GP5 生物信息學(xué)分析

1.1 GP5 外域結(jié)構(gòu)預(yù)測

由于缺乏PRRSV 包膜蛋白的晶體結(jié)構(gòu)信息，使得這些蛋白對病毒感染、復(fù)制、中和的影響機制尚不明確。對于GP5 和M 蛋白，一般認(rèn)為GP5/M 二聚體在PRRSV 復(fù)制和逃逸免疫中起重要作用，但目前并沒有GP5/M 二聚體三維結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確預(yù)測。原因是PRRSV 病毒顆粒的多形性，導(dǎo)致目前無法使用高分辨率冷凍電鏡重建其結(jié)構(gòu)；此外，GP5 和M 蛋白的疏水特性，導(dǎo)致其難以純化和結(jié)晶，因此目前成熟的X 射線晶體學(xué)方法也不適用。這使得生物信息學(xué)預(yù)測GP5/M 結(jié)構(gòu)成為當(dāng)前的主要手段。Veit 等［8］使用alphafold2（基于人工智能的系統(tǒng)）預(yù)測GP5/M 的可靠結(jié)構(gòu)，描述了二聚體的各個結(jié)構(gòu)域，并將氨基酸殘基的變化與結(jié)構(gòu)特征的改變聯(lián)系起來。

對于單體M 蛋白的模型，其一級結(jié)構(gòu)已有相對準(zhǔn)確的預(yù)測［9］。M 蛋白由1 個短的外域、3 個假定的跨膜區(qū)域和1 個長的親水性細(xì)胞質(zhì)尾（Long hydrophilic cytoplasmic tail）組成。M 蛋白沒有信號肽，少數(shù)PRRSV 毒株的M 蛋白含有N-連接聚糖（N-linked glycans）的共識序列，但并未起作用。對于單體GP5 蛋白的模型，Veit 等［8］將其劃分為外域結(jié)構(gòu)、內(nèi)域結(jié)構(gòu)和跨膜區(qū)域結(jié)構(gòu)3部分。由于中和表位在GP5/M 蛋白的外域結(jié)構(gòu)中，因此本文主要介紹該部分。

在GP5/M 的外域結(jié)構(gòu)中，GP5 的中和表位包括殘基5～12（圖1），它們位于N 端螺旋的C 端部分（殘基編號從成熟蛋白的第1個氨基酸算起）。預(yù)測結(jié)果表明，GP5 只有3 個殘基（7、8、10）在毒株之間可變，其他殘基（5、6、9、11、12）幾乎完全保守。許多保守的表位殘基（紅色球體）暴露在螺旋的上側(cè)，而可變殘基（青色球體）位于其下側(cè)。GP5 外域序列的中心部位完全保守，包括兩個N-糖基化位點。GP5外域有兩個高變區(qū)，一個由殘基26～28 構(gòu)成（目前尚未有該區(qū)域功能的報道），另一個由殘基1～4 構(gòu)成。病毒在進化過程中，殘基1～4 的突變可以減少或增加額外的碳水化合物附著到GP5 上。在α 螺旋開端，碳水化合物的附著可能會阻止抗體進入中和表位（殘基5-12）［8］。

圖1 GP5/M 二聚體外域結(jié)構(gòu)［8］Fig.1 External domain structure of GP5/M dimer［8］

在GP5/M 的較長外域結(jié)構(gòu)中，只有當(dāng)信號肽切割發(fā)生在殘基31、32 之間時，VR-2332 的成熟GP5 中才存在非中和誘餌表位。誘餌表位包括Val、Leu、Ala、Asn，并且表面暴露。其序列在美洲型PRRSV 菌株之間變化很大，且主要疏水氨基酸存在于這些位置。

Veit 等［8］預(yù)測了4 個美洲型PRRSV 譜系毒株的GP5/M 二聚體結(jié)構(gòu)。GP5 和M 的外域均為螺旋形，但螺旋的方向相對于跨膜區(qū)域不同。可見，alphafold2 可正確預(yù)測外域的二級結(jié)構(gòu)，但3 級結(jié)構(gòu)的空間排列不一定準(zhǔn)確。外域的方向由 GP5 的跨膜螺旋1 和α 螺旋之間的角度決定。由于該預(yù)測的不確定性，因此無法從這些模型中推斷病毒進化過程中發(fā)生的GP5 抗原漂移是否會導(dǎo)致外域的構(gòu)象變化。

1.2 基于ORF5 的分型

PRRSV 目前主要的分型方法仍然基于高度可變的ORF5［10］。對于美洲型PRRSV，分型多參照Shi 等［2］的分類系統(tǒng)。丟棄10%老化（burnin）樣本后按以下程序進行分類：第一，手動確定拓?fù)渖喜煌膯蜗荡兀ê篁灨怕剩?0%為標(biāo)準(zhǔn)）作為初始分類；第二，將整個數(shù)據(jù)集按照初始分類劃分為子數(shù)據(jù)集；第三，計算每個子數(shù)據(jù)集的集內(nèi)多樣性（即平均成對遺傳距離），對多樣性水平＞11%的子數(shù)據(jù)集進一步分為較小的單系簇；最后，將9 個單系譜系（通常譜系內(nèi)多樣性＜11%）建立為最終分類。使用相同的程序鑒定譜系中的亞譜系，臨界值為7%。通過這種方式，整個數(shù)據(jù)集被劃分為9 個譜系和37 個亞譜系。

近年來，Lambert 等［11］構(gòu)建了一種基于最大似然樹與最大成對遺傳距離的自動分類系統(tǒng)。該方法被證明可用于大型ORF5數(shù)據(jù)集。在研究中，3 661 個序列被分為29（第1 次運算）和33（第2 次運算）個集群。但該系統(tǒng)旨在對大型數(shù)據(jù)集內(nèi)的遺傳多樣性進行初步評估，應(yīng)被視為系統(tǒng)發(fā)育分析的第一步。事實上，應(yīng)該進行進一步的貝葉斯分析，以更好地確定特定集群隨時間推移的進化速率。

盡管ORF5是PRRSV 分型和系統(tǒng)發(fā)育分析最常見的靶標(biāo)，但ORF5序列僅占整個PRRSV 基因組的5%。因此，基于完整基因組或多個蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的分型可以更全面地了解PRRSV 毒株的遺傳相關(guān)性。Stadejek 等［4］認(rèn)為ORF7可作為歐洲型PRRSV 分型的替代標(biāo)記，但并無確切的分型方法。

1.3 GP5 遺傳變異分析

GP5 是變異最大的結(jié)構(gòu)蛋白之一，在同一基因型中具有最高的遺傳多樣性。一些GP5 中已知的功能域，如中和表位和誘餌表位，一直以來是GP5 遺傳變異分析的重點。近年來，研究者更傾向于揭示特定地區(qū)流行毒株的特征性氨基酸突變［12-15］。

Xie 等［16］調(diào)查了我 國2017—2018 年 流行的PRRSV 美洲株的遺傳特征。結(jié)果表明，PRRSV 毒株之間的核苷酸序列同源性范圍為61.6%～100%，氨基酸序列同源性范圍為51.8%～100%。與經(jīng)典PRRSV 毒株、NADC30-like 毒株和GM2-like 毒株相比，HP-PRRSV 毒株的GP5 蛋白在氨基酸位點9（G →C）、24（C →Y）、47（L →I）和161（L →V）處有突變；與HPPRRSV 毒 株、NADC30-like 毒株和GM2-like 毒株相比，經(jīng)典PRRSV 毒株的GP5 蛋白在氨基酸位點11（V →A）和185（A →V）處有突變；與經(jīng)典PRRSV 毒株、HP-PRRSV 毒株和GM2-like 毒株相比，NADC30-like 毒株的GP5 蛋白在氨基酸位點10（C →Y）和168（E →D）處有突變；與GM2 毒株的GP5 蛋白相比，經(jīng)典PRRSV 株、HP-PRRSV 毒株和NADC30-like 株 的GP5 蛋 白在氨基酸位點6（L →S）處有突變。Guo 等［17］調(diào)查了我國流行的PRRSV 歐洲株的遺傳特征，結(jié)果表明，檢測到的PRRSV 毒株與Lelystad 毒株的全基因組核苷酸同源性范圍為85.9%～92.7%，GP5 核苷酸同源性范圍為83.5%～94.6%；氨基酸比對發(fā)現(xiàn)，氨基酸位點8、60、63、106 高度可變，且具有3～7 種不同的氨基酸突變。與Lelystad 毒株相比，中國毒株在氨基酸氨基酸位點37(D →N)、100(T →V)、101(A →T)、112(C → S)、123(F → L)、155(V → I)、173(D →G)、175(N →D)處有非常保守的突變。綜合來說，GP5 蛋白的氨基酸極少見刪除和添加，但經(jīng)常發(fā)生替換［12］。替換位點常見于GP5 蛋白的信號肽編碼區(qū)（氨基酸位點1～26）、非中和表位（氨基酸位點27～30）、中和表位（氨基酸位點37～45）和跨膜區(qū)（氨基酸位點66～83，氨基酸位點95～104，氨基酸位點112～128），這些變化可能是導(dǎo)致病毒加速進化的原因［18］。

2 GP5 對PRRSV 感染復(fù)制的影響

2.1 GP5 與細(xì)胞嗜性的關(guān)系

PRRSV 具有嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性，僅在PAM、MA-104 和MARC-145 細(xì)胞中增殖。一般認(rèn)為，PRRSV 對PAM 細(xì)胞的嗜性是病毒感染的先決條件。一些包膜蛋白上的氨基酸突變可能會對PRRSV 的細(xì)胞嗜性產(chǎn)生一定影響。Xie 等［19］發(fā)現(xiàn)歐洲型PRRSV 減毒株與傳代毒株在GP2a 的3 個氨基酸位點具有相同的氨基酸突變，分別為88(V →F)、94(M →I)、95(F →L)。在隨后的研究中，研究者構(gòu)建了具有上述氨基酸替換的突變體，并對PAM 和MARC-145 細(xì)胞進行感染。結(jié)果表明，該突變促進了歐洲型PRRSV 適應(yīng)MARC-145 細(xì)胞系，但對適應(yīng)PAM 細(xì)胞系沒有明顯影響。Zhang 等［20］佐證了該觀點，即PRRSV 對MARC-145 的適應(yīng)由次要包膜蛋白GP2a 和GP3 決定。

近年來，有研究認(rèn)為包膜蛋白GP5 的氨基酸位點78（異亮氨酸）可能影響PRRSV 對PAM 細(xì)胞系的適應(yīng)，而且GP5/M 二聚體通過與唾液酸粘附素相互作用參與了PRRSV 進入PAM 細(xì)胞的過程［21］。雖然有證據(jù)表明GP5 與細(xì)胞嗜性有一定聯(lián)系，但有研究用GP5 和M 蛋白的外域替換EAV 的相應(yīng)區(qū)域，得到的嵌合EAV 并未改變其細(xì)胞嗜性。因此，GP5 和M 蛋白并非PRRSV 細(xì)胞嗜性的決定因素。

2.2 GP5 與病毒感染復(fù)制的關(guān)系

病毒受體位于宿主細(xì)胞表面，多為蛋白質(zhì)（也有糖類和脂類），在細(xì)胞信息傳遞中發(fā)揮重要作用。研究表明，GP5 通過與受體的結(jié)合參與PRRSV 感染細(xì)胞的過程［22］。

硫酸乙酰肝素（HepS）是一種蛋白聚糖，PAM 細(xì)胞表面存在的HepS 可作為PRRSV 受體。研究表明，將HepS 類似物與PRRSV 混合后，美洲型PRRSV 的PAM 感染率降低到92%，歐洲型PRRSV 的PAM 感染率則降低到88%［23］。這表明HepS 可能參與PRRSV 感染的過程。感染動力學(xué)分析表明，PRRSV 附著于HepS 在感染早期發(fā)生。非還原性SDS-PAGE 顯示，GP5/M 二聚體可與PAM 上的HepS 結(jié)合。隨后在一些受體的參與下，病毒粒子內(nèi)化形成胞內(nèi)體，最后釋放病毒RNA 到細(xì)胞質(zhì)。

唾液酸黏附素(Sn)也被稱為CD169,主要參與細(xì)胞間或細(xì)胞與病毒間的相互作用。CD169 表達(dá)于PAM 細(xì)胞表面，在其他的PRRSV 易感細(xì)胞系（MA104 和MARC-145）和非易感細(xì)胞系中都沒有發(fā)現(xiàn)。Xia 等［24］發(fā)現(xiàn)GP5/M 二聚體與CD169 以唾液酸依賴性方式結(jié)合，隨后通過吸附與內(nèi)吞作用參與病毒感染宿主細(xì)胞的過程。但一般認(rèn)為CD169 對病毒的吸附作用較弱，主要介導(dǎo)的是病毒的內(nèi)吞過程，且CD169 并不能單獨導(dǎo)致PRRSV 的感染。

波形蛋白（Vimentin）是一種具有中心α 螺旋結(jié)構(gòu)域的環(huán)狀二聚體單體分子，主要存在于非洲綠猴腎細(xì)胞內(nèi)（MA104 及其衍生細(xì)胞系）。Kim 等［25］發(fā)現(xiàn)波形蛋白是PRRSV 受體復(fù)合物的組分，在介導(dǎo)PRRSV 的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用，且波形蛋白的單克隆抗體能夠阻斷PRRSV感染。有研究表明［26］，波形蛋白與GP5 結(jié)合從而完成識別過程，但王偉偉等［27］用ELISA 方法證明波形蛋白與N 蛋白結(jié)合而非GP5。

非肌球蛋白重鏈9（Non-muscle myosin heavy chain 9，MYH9）是大肌球蛋白超家族成員之一。Xue 等［28］證實了PRRSV 進入細(xì)胞的過程受到GP5 和MYH9 的共同調(diào)節(jié)。GP5 的第一個胞外域（GP5-ecto-1）與MYH9 的C 端結(jié)構(gòu)域（PRA）相互作用，可誘導(dǎo)MYH9 的聚集，這是肌球蛋白組裝的必要步驟，有助于PRRSV 病毒粒子進入細(xì)胞。這與Guo 等［29］的研究結(jié)果一致。這些研究表明GP5 與MYH9 相互作用，參與PRRSV 向鄰近細(xì)胞傳播（通過納米管）。還有研究表明，通過重組表達(dá)的PRA 會中斷PRA 與MYH9 的相互作用，從而在體外阻斷PRRSV 的感染［30］。

3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）是一種含有335 個氨基酸的細(xì)胞質(zhì)蛋白，在物種間高度保守，可與多種蛋白相互作用，進而執(zhí)行多種生物學(xué)功能。Liu 等［31］研究表明，GAPDH 是GP5 蛋白的靶標(biāo)，具有糖酵解活性，且只有細(xì)胞質(zhì)中的GAPDH 可以促進PRRSV 的復(fù)制。進一步研究證實，GP5 的氨基酸位點93～105 與GAPDH 的Lys227 結(jié)合，可競爭性破壞GAPDH 與Siah1（E3泛素連接酶）的相互作用，阻礙GAPDH 進入細(xì)胞核，而留在細(xì)胞質(zhì)中的GAPDH 通過其糖酵解活性促進PRRSV 的復(fù)制。

細(xì)胞蛋白Snapin 參 與SNARE（soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment protein receptor）所介導(dǎo)的膜融合過程，也是溶酶體相關(guān)細(xì)胞器復(fù)合物1（BLOC-1）的成員。Hicks 等［32］設(shè)計了酵母雙雜交試驗證實，GP5 的氨基酸位點31～60 和M 蛋白的氨基酸位點1～22與Snapin 相互作用，降低了Snapin 水平，從而導(dǎo)致病毒復(fù)制減少。

CD151 與CD163、CD209 也是近年研究比較多的細(xì)胞受體，它們均在PRRSV 的感染中起作用［33］，但并未有證據(jù)顯示其與GP5 相互作用。研究認(rèn)為，在病毒進入宿主細(xì)胞的過程中，即PRRSV 感染PAM 細(xì)胞初期，HepS 首先與GP5/M 異二聚體結(jié)合，黏附PRRSV；隨后CD169 參與病毒內(nèi)化；接著在CD163 的作用下，HepS 與PRRSV 的GP2a/GP3/GP4 異三聚體結(jié)合，PRRSV脫衣殼并釋放基因組RNA 到細(xì)胞中。在這個過程中還有其他受體參與［22］。

目前GP5 的大多數(shù)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)仍然依賴于生物信息學(xué)分析，或者參照EAV 等相關(guān)病毒來預(yù)測。因此，GP5 與受體作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)一直不夠明確［34］。此外，大多數(shù)研究使用合成肽或者細(xì)菌表達(dá)的蛋白質(zhì)來替代PRRSV 的包膜蛋白（如GP5），但模擬的蛋白在膜關(guān)聯(lián)或肽鏈折疊方面的真實性有待商榷。例如一些構(gòu)象表位或翻譯后需要修飾的表位（如糖基化），可能存在于異質(zhì)分離株中，并不能靠常規(guī)方法來可靠重建。因此，必須開發(fā)可信度更高的生物信息學(xué)預(yù)測手段才能推動相關(guān)的基礎(chǔ)研究。

3 GP5 對病毒中和與毒力的影響

3.1 GP5 對PRRSV 病毒中和的影響

研究發(fā)現(xiàn)，基于ORF3～ORF6 的重組蛋白以及質(zhì)粒DNA 具有誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的能力［35］。在PRRSV 的所有糖基化蛋白中，GP5 的免疫原性最強，含有很多中和表位。因此，GP5 在PRRSV不同毒株之間的交叉保護方面起關(guān)鍵作用。有研究將GP5 蛋白中的一些氨基酸突變與病毒的中和性能進行關(guān)聯(lián)分析，這使得大量分子流行病學(xué)調(diào)查的數(shù)據(jù)具有更重要的意義。

GP5 有至少3 個B 細(xì)胞表位（氨基酸位點27～30、37～45、187～200），至少2 個T 細(xì)胞表位（氨基酸位點117～131、149～163）［36］。Kim 等［35］證實GP5 的5 個候選位點與病毒中和密切相關(guān)，氨基酸位點分別為32～34、38～39、57～59、137和151。其中用N 取代34 位殘基會導(dǎo)致在該區(qū)域添加1 個新的N-糖基化位點，這可能掩蓋中和抗體對保守線性中和表位的識別。Rowland 等［37］推測第34 位氨基酸變化可能是病毒逃逸中和抗體的標(biāo)志物，目前這種假設(shè)尚未被證實。氨基酸位點38～39 位于GP5 的N 末端外區(qū)，并且在PRRSV 的保守線性中和表位區(qū)域內(nèi)［38］。許多對VR2332 中和抗體具有抗性的分離株發(fā)生了氨基酸位點38（H →K 或N）和39（L →F 或I）的替換。氨基酸位點57～59 位于GP5 高變區(qū)（氨基酸位點57～61 位）中，根據(jù)計算機輔助預(yù)測，該序列的替換可能導(dǎo)致抗原表位發(fā)生構(gòu)象改變，從而降低中和抗體對分離株的識別［39］。氨基酸位點137、151 位最初是用于RFLP 分析以區(qū)分疫苗毒株與野毒株［40］，兩位點處在2 個跨膜區(qū)域（氨基酸位點65～130、170～190）之間，可能屬于GP5 的額外胞外域。因此，137、151 氨基酸位點的替換可以顯著改變GP5 的抗原性［41］，然而研究表明該替換對病毒中和并沒有顯著影響［40］。

GP5 共 有5 個N-糖基化位 點（N30、N32/33/34、N35、N44、N51）［42］。Wei 等［43］證實，GP5 的N34、N44、N51 突變會提高病毒對抗體的敏感性，使機體產(chǎn)生更高水平的抗體，同時也會抑制PRRSV 的增殖。GP5 外域的高變區(qū)（氨基酸位點32～35）具有潛在的N-糖基化位點，且添加新的糖基化位點可能會掩蓋中和抗體對保守線性中和表位的識別。這表明GP5 胞外結(jié)構(gòu)域糖基化的缺失會增強病毒的中和效果以及中和表位B 的免疫原性。目前研究者還不清楚GP5 或其他包膜蛋白（如GP2、GP3、GP4）中的糖基化位點具體如何影響抗體識別，而且尚無有關(guān)豬或小鼠的PRRSV 抗體在病毒粒子包膜上識別肽聚糖的報道。大多數(shù)研究認(rèn)為，GP5 蛋白的糖基化位點在中和反應(yīng)的阻斷或病毒逃逸中起作用［44］，而非直接作為潛在的中和抗體靶標(biāo)［45］。

3.2 GP5 對PRRSV 毒力的影響

PRRSV 不同毒株在毒力、抗原和遺傳特性方面都有不同，一些氨基酸位點的突變被認(rèn)為與PRRSV 的毒力相關(guān)。

Allende 等［46］發(fā)現(xiàn)，PRRSV 的9 個氨基酸位點替換可能導(dǎo)致其毒力減弱，包含結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)的5 個氨基酸位點與非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)的4 個氨基酸位點。GP5 蛋白上有2 個可替換位點，分別為氨基酸位點13(R →Q)和151(R →G)。氨基酸位點13(R →Q)是一個保守的突變，位于GP5的信號肽區(qū)域，翻譯后被刪除。這種突變會改變信號肽的凈電荷，干擾GP5 向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的轉(zhuǎn)運。氨基酸位點151(R →G)突變改變位于糖蛋白的親水部分，可能導(dǎo)致PRRSV 毒力減弱［46］。

Zhang 等［47］研究發(fā)現(xiàn)，5 種同時具有氨基酸位點13R 和151R 的分離株具有高毒性，可導(dǎo)致仔豬抑郁、厭食、體溫過高、呼吸困難，并造成母豬流產(chǎn)；而具有13R 或151R 的3 株分離株具有中等毒力，并導(dǎo)致中度臨床體征（高熱、厭食、呼吸道癥狀）；其余分離株引起較輕的臨床癥狀（體溫升高伴食欲不振）。Ostrowski 等［38］發(fā)現(xiàn)GP5 的初級中和表位（氨基酸位點37～45）和誘導(dǎo)表位（氨基酸位點27～31）在抑制免疫反應(yīng)中起重要作用。這些位置上一些關(guān)鍵氨基酸的取代可能導(dǎo)致病毒逃逸中和抗體的識別。

Wesley 等［48］通過分析90 多 株P(guān)RRSV 毒株，發(fā)現(xiàn)弱毒疫苗株GP5 蛋白的第137 個氨基酸一般為137A，野毒株一般為137S，但并未有報道稱該位點影響PRRSV 毒力。Khatun 等［49］將PRRSV 突變株和MLV 毒株在豬體內(nèi)以及細(xì)胞中傳代致弱，根據(jù)不同代次病毒中穩(wěn)定存在的減毒序列來推斷導(dǎo)致毒力減弱的氨基酸突變，其中與GP5 相關(guān)的氨基酸突變?yōu)?51G，但ORF2（10F）以及ORF6（16E）才是導(dǎo)致病毒毒力減弱的主要序列。由于GP5 可能參與PRRSV 與細(xì)胞受體的結(jié)合過程，并包含誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫的主要表位。因此，這些氨基酸位點的變化可能會影響細(xì)胞的趨向性，從而影響毒力強弱。當(dāng)前研究認(rèn)為，GP5 在確定PRRSV 的毒力相關(guān)位點以及誘導(dǎo)免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［45］。

4 GP5 在疫苗研究中的應(yīng)用

PRRSV 弱毒疫苗對異源毒株只能提供部分保護作用［50］，且有毒力返強的風(fēng)險。而PRRSV 滅活疫苗雖然具有更好的安全性，但2005 年以來的滅活疫苗效果一直表現(xiàn)不佳，目前大多數(shù)國家已經(jīng)停止使用［51］。而將PRRSV 弱毒疫苗與滅活疫苗聯(lián)用可產(chǎn)生更好的免疫效果［52］，但免疫成本偏高，較難在臨床中推廣?；谝陨蠁栴}，研究人員利用現(xiàn)代生物技術(shù)開展了基于ORF5/GP5 的PRRS 基因工程疫苗研究（表1），以期為我國養(yǎng)豬業(yè)提供優(yōu)質(zhì)的候選PRRS 疫苗。

表1 基于GP5 的基因工程疫苗Table 1 GP5-based genetic engineering vaccines

當(dāng)前研究認(rèn)為，宿主針對PRRSV 的免疫分為先天免疫與特異性免疫［53］。特異性免疫主要包括細(xì)胞介導(dǎo)免疫（CMI）與特異性體液免疫（中和反應(yīng)等）。在CMI 中，輔助T 細(xì)胞（CD4+）和細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（CD8+）均能在PRRSV 感染后8 周內(nèi)檢測到。由于GP5 以及其他的一些結(jié)構(gòu)蛋白（GP4、M、N）是CMI 的強誘導(dǎo)物，因此CD4+、CD8+T 細(xì)胞水平常用于評價基于GP5 的基因工程疫苗效果。此外，GP5/M 二聚體被認(rèn)為是誘導(dǎo)PRRSV 中和反應(yīng)的關(guān)鍵，且中和抗體主要指向GP5，因此CD4+、CD8+以及中和抗體水平的升高都屬于宿主針對GP5 的免疫反應(yīng)。

4.1 DNA 疫苗

DNA 疫苗即通過基因工程技術(shù)，將編碼抗原的外源基因注入動物體內(nèi)，使其在動物體內(nèi)表達(dá)，從而產(chǎn)生中和抗體，達(dá)到預(yù)防疾病的目的。近年來，通過DNA 改組技術(shù)將不同的抗原基因進行體外重組，可以篩選出綜合性能更加優(yōu)秀的DNA 疫苗。PRRSV GP5-Mosaic 疫苗是近年來由Cui 等［54］研發(fā)的一種DNA 疫苗，該疫苗可以顯著提升外周血單核細(xì)胞（PBMC）分泌的干擾素-γ（IFN-γ）mRNA 表達(dá)，產(chǎn)生的特異性中和抗體水平高于對照，對不同毒株的交叉保護（主要指細(xì)胞反應(yīng)）也得到了驗證。魏春華等［55］利用DNA 改組技術(shù)進行體外基因重組，去信號肽和非中和表位，篩選出2 個重組突變體（ΔORF5-8 和ΔORF5-46）。以此為基礎(chǔ)進一步構(gòu)建的重組DNA 疫苗能刺激機體產(chǎn)生特異性的GP5 蛋白抗體，與弱毒活疫苗組的免疫效果相近。血清中和試驗證實，該重組DNA 疫苗能產(chǎn)生針對3～4 個不同譜系（尤其是譜系1 和譜系3 的代表毒株）的中和抗體。

可見，DNA 疫苗目前最大的優(yōu)勢是能夠?qū)Σ煌V系的毒株產(chǎn)生交叉保護，但與弱毒活疫苗的缺點相似。DNA 疫苗是否會與宿主基因整合，造成免疫耐受或其他不可控的影響還尚不可知。需要更多的動物實驗來驗證DNA 疫苗的安全性。

4.2 亞單位疫苗

亞單位疫苗一般選取病毒（桿狀病毒、腺病毒等）或細(xì)菌（酵母菌等）表達(dá)體系，在體外正確表達(dá)抗原蛋白，注入動物體內(nèi)從而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫。近年來，關(guān)于PRRSV 亞單位疫苗的研究增多。

GP5m-鐵蛋白疫苗是近年來由Ma 等［56］研發(fā)的一種亞單位疫苗。該疫苗用修飾的GP5 和鐵蛋白融合，并使用桿狀病毒表達(dá)，可以產(chǎn)生較高的抗體滴度，并顯著提升TH1 介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在臨床實驗中可以引發(fā)豬的特異性保護反應(yīng)，平均直腸溫度、呼吸、病毒血癥、宏觀和微觀肺部病變等各項評分均顯著降低。Ad-NADC20-PP1和AD-NADC20-PP2 是由Tian 等［57］通過腺病毒載體表達(dá)多表位肽作為抗原構(gòu)建的一種亞單位疫苗。一項對30 頭仔豬的免疫試驗表明，與對照相比，疫苗組的肺部病變面積以及血清中病毒的RNA 載量數(shù)值更低，但差異不顯著，因此該疫苗的保護效果有待進一步驗證。

亞單位疫苗副作用小、安全性高。由于亞單位疫苗不能在體內(nèi)復(fù)制，因此面臨免疫劑量大和費用昂貴等問題。目前已有的PRRSV 亞單位疫苗尚未投入商品化應(yīng)用。

4.3 病毒活載體疫苗

與亞單位疫苗和DNA 疫苗不同，使用病毒活載體疫苗免疫動物，效果與自然感染非常相似，能較長時間刺激機體產(chǎn)生特異性和非特異性免疫，而且病毒載體可插入多個外源基因從而預(yù)防多種疾病。rPRV-NC56 是Zhao 等［59］以CHSCDJY-2019 為親本構(gòu)建的具有g(shù)E/gI/TK基因缺失且共表達(dá)PRRSV NADC30-like 毒株GP5 和M 蛋白的偽狂犬病毒載體疫苗。該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生NADC30-like 毒株特異性體液和細(xì)胞免疫，但在高致病PRRSV 組中引發(fā)的中和抗體滴度顯著降低，因此是一種用于控制NADC30-like 毒株的候選疫苗。

Becares 等［60］研制了一種用重組傳染性胃腸炎病毒（rTGEV）作為載體共表達(dá)PRRSV GP5 和M 蛋白的疫苗，該疫苗對PRRSV 的損傷有部分保護作用（減少臨床體征和肺損傷），但目前最大的問題是rTGEV 系統(tǒng)中GP5 蛋白的不穩(wěn)定性，在傳代8～10 次后會造成異源基因丟失。此外，rTGEV 載體疫苗保護性不足可能與表達(dá)的蛋白存在誘導(dǎo)負(fù)調(diào)節(jié)T 細(xì)胞（Treg）的表位有關(guān)。GP5蛋白或者M 蛋白存在誘導(dǎo)Treg 的負(fù)調(diào)節(jié)信號，因此可能會導(dǎo)致PRRSV 免疫反應(yīng)延遲［64］。華思紅等［58］構(gòu)建了表達(dá)GP5 的重組腺病毒，根據(jù)動物實驗，該疫苗能對PRRSV 強毒產(chǎn)生一定保護作用；但ELISA 試驗結(jié)果顯示，免疫后并不能檢測到PRRSV 特異性血清抗體。黃袁慧等［61］構(gòu)建了表達(dá)重組GP5 的昆蟲桿狀病毒載體，但未對其免疫原性作進一步研究。

病毒活載體疫苗安全性較高，特異性較好，可同時表達(dá)多種抗原，但多次傳代后的穩(wěn)定性還有待驗證。此外，如果宿主本身存在載體病毒的中和抗體，則會降低免疫效果。但總的來看，病毒載體疫苗是目前相對成熟的一種疫苗。

4.4 細(xì)菌和植物載體疫苗

細(xì)菌和植物載體疫苗近年來也備受研究者關(guān)注，這些疫苗可能對機體非特異性免疫（促炎細(xì)胞因子、干擾素等）具有更好的誘導(dǎo)效果。Wang等［62］將PRRSV 的ORF5或ORF6基因整合到伊萬諾維李斯特菌（Listeria Ivanovii，LI）的基因組中，對非分泌和分泌的細(xì)菌蛋白樣品進行蛋白質(zhì)免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)重組LI 菌株中有GP5 或M 蛋白的表達(dá)和分泌。因此，這可能成為一種潛在的新型疫苗。An 等［63］研發(fā)了一種轉(zhuǎn)基因擬南芥植物，可以表達(dá)PRRSV 重組糖蛋白GP4D 和GP5D。豬采食表達(dá)GP4D 和GP5D 蛋白的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉，其肺部病變評分比對照顯著降低，肺部病毒血癥和病毒載量也降低；免疫豬的PRRSV 特異性抗體滴度、促炎細(xì)胞因子（TNF-α 和IL-12）、干擾素（IFN γ）的水平升高。因此，用植物來替代傳統(tǒng)載體具有一定的應(yīng)用前景。

以細(xì)菌為載體的活載體疫苗在免疫方式、菌株培養(yǎng)、遞呈基因等方面有較多優(yōu)勢，但是減毒菌面臨毒力返強的危險，而且細(xì)菌活載體疫苗免疫效率低，需要長期試驗確定最佳免疫劑量和免疫周期［65］。此外，機體對細(xì)菌的耐受性也會影響疫苗效果。

5 展望

PRRS 給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，對其防控至關(guān)重要。由于PRRSV 變異極快，而且商業(yè)化弱毒活疫苗對不同譜系毒株的交叉保護較弱，因此，一直以來如何防控PRRSV 是困擾世界養(yǎng)豬業(yè)的一大難題。多年來研究者從多方面多角度探究PRRSV 的特性，生物信息學(xué)分析是重要內(nèi)容之一。近年來的分子流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在我國流行的PRRSV 中，不同譜系GP5 的氨基酸變異位點有一定的規(guī)律可循，且不同譜系ORF5具有其特征序列，可以用于分型。此外，人工智能的發(fā)展推動了生物信息學(xué)方法對GP5 結(jié)構(gòu)的可靠預(yù)測，但基于GP5 新結(jié)構(gòu)模型的機制研究尚未有報道?，F(xiàn)有的研究認(rèn)為，GP5 對于細(xì)胞嗜性并不起決定作用，但其與多種病毒受體互作，形成的分子復(fù)合物可能對PRRSV 的感染和復(fù)制產(chǎn)生影響。通過初級結(jié)構(gòu)預(yù)測，GP5 含有多個中和表位，因此部分研究圍繞GP5 如何影響病毒的中和與毒力展開。但由于之前對GP5 結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)預(yù)測并不統(tǒng)一，因此該部分的研究尚不完善?，F(xiàn)有的證據(jù)表明，GP5 具有良好的免疫原性，可用于基因工程疫苗的開發(fā)。近年GP5 的相關(guān)DNA 疫苗、亞單位疫苗、病毒細(xì)菌載體疫苗、植物載體疫苗相繼問世。雖然一些疫苗的表現(xiàn)良好，經(jīng)動物實驗具有良好的免疫原性與交叉保護效果，但鑒于其穩(wěn)定性、安全性和免疫效率等問題，這些疫苗尚未能商品化應(yīng)用。2022 年Veit 等［8］使用alphafold2對GP5/M二聚體結(jié)構(gòu)的可靠預(yù)測，將會促使GP5 的相關(guān)機制研究成為PRRSV 的研究熱點，進而促進GP5 相關(guān)疫苗研制。