關(guān)鍵詞：鎘脅迫； 豌豆； 根邊緣細(xì)胞； 幼根； 毒害

中圖分類號：S529 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-8151（2023）03-0068-08

鎘（Cd²⁺）是劇毒重金屬元素之一，1984 年聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署將鎘列于“ 危害全球環(huán)境的化學(xué)物質(zhì)和化學(xué)過程清單”的首位［1］。中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中很多地區(qū)土壤普遍存在鎘超標(biāo)問題［2-4］。土壤中的鎘很容易被植物吸收，對植物生長發(fā)育造成一系列的傷害，如破壞光合色素，抑制植物光合速率［5］，影響植物對Ca、Mg、Fe 等營養(yǎng)元素的吸收等［6-7］。鎘隨食物鏈進(jìn)入人體內(nèi)可形成鎘硫蛋白，選擇性地蓄積在肝、腎中，排出速度很慢，容易引起骨骼變形、致癌等，嚴(yán)重威脅人體健康［8］。

鎘主要通過被植物根吸收進(jìn)入植株。根邊緣細(xì)胞（root border cell， RBC）是從根冠表皮游離出來并聚集在根尖周圍的一群特殊細(xì)胞。RBC 從根表皮游離出來后，其代謝活性上升、基因表達(dá)明顯不同于根冠細(xì)胞。RBC 能特異性地合成、分泌一系列化學(xué)物質(zhì)調(diào)節(jié)根際環(huán)境，抑制或促進(jìn)根際周圍生物因子的活動(dòng)，抵御外界有毒物質(zhì)如鋁、鎘等對根尖的傷害［9-12］。王亞男等［13］研究發(fā)現(xiàn)，鎘對綠豆根邊緣細(xì)胞和根尖有毒害作用，根尖受到鎘脅迫時(shí)，可釋放更多根邊緣細(xì)胞，并通過RBC 黏膠層增厚螯合有毒物質(zhì)、程序性凋亡等方式來抵御Cd2+ 對根尖的毒害。張賢仕［14］研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫對豌豆RBC 有致死效應(yīng)，且對豌豆幼根產(chǎn)生顯著的傷害，這種傷害主要表現(xiàn)在根去除RBC 后，豌豆幼根抗氧化酶活性升高，根系活力顯著降低，而未除去RBC 的幼根受傷害程度較輕。本研究以豌豆為受體植物，較系統(tǒng)地研究了鎘脅迫對豌豆RBC 及幼根的傷害，從細(xì)胞學(xué)和生理學(xué)層面解析了鎘對豌豆幼苗早期生長的脅迫傷害機(jī)制，為豌豆避鎘栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料為中豌6 號，購于山西省晉中市太谷縣當(dāng)?shù)胤N子公司。氯化鎘（CdCl2）購于天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

1. 2 材料培養(yǎng)及處理

挑選適量均勻飽滿的豌豆種子，0. 1% HgCl2消毒5 min，用去離子水洗去殘液，將種子用干凈的濕毛巾包裹，放于瓷盤中，置25 ℃ 培養(yǎng)箱中催芽。種子露白后，挑選萌發(fā)生長一致的種子待用。取20 個(gè)直徑100 mm、高50 mm 的PVC 塑料管，將消毒的單層紗布用橡皮筋固定在管口上。將露白的種子置于紗布上，上蓋3 層濕紗布，將PVC 塑料管轉(zhuǎn)入加有適量去離子水的發(fā)芽盒蓋子上，將發(fā)芽盒移入25 ℃人工氣候箱中進(jìn)行根懸空培養(yǎng)。待根長至5～10 mm 時(shí)，將20 個(gè)PVC 塑料管分為4 組（4 個(gè)處理）。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)置1、2、5μmol·L^-1 Cd²⁺水溶液對根進(jìn)行噴霧處理，每隔6 h噴1 次，共3 次。對照噴去離子水。待對照根長至約20～25 mm 時(shí)，進(jìn)行如下處理：（1）不同處理分別取5 個(gè)幼根，剪取10 mm 根尖，AO-EB 復(fù)合染液染色，進(jìn)行根尖原位觀察拍照；另取30 個(gè)根尖用于測定根冠果膠甲基酯酶（PME）活性。（2）不同處理取適量根尖，測定根長，根超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性，根H₂O₂、丙二醛（MDA）、超氧陰離子（O₂ˉ ?）含量，根活性氧（ROS），根系活力，根細(xì)胞膜透性等生理指標(biāo)，DAB、NBT、ROS 染色觀察拍照。（3）不同處理取30 個(gè)根尖，制備根邊緣細(xì)胞懸液，統(tǒng)計(jì)根邊緣細(xì)胞數(shù)量。

同上述根懸空培養(yǎng)的方法，不進(jìn)行鎘脅迫處理，待根長至約20～25 mm 時(shí)，剪取200 個(gè)根尖，制備根邊緣細(xì)胞的MS 懸液，設(shè)置0、1、2、5 μmol·L^-1Cd²⁺進(jìn)行RBC 離體培養(yǎng)。鎘脅迫培養(yǎng)6 h 后，測定RBC 存活率、凋亡率、黏膠層厚度。

1. 3 指標(biāo)測定與方法

根尖原位觀察和RBC 數(shù)量、存活率測定：參考胡忠良等［15］的方法。每個(gè)處理挑選約30 個(gè)生長一致的根，剪取5 mm 長根尖于盛有2 mL 1 mol·L^-1MS 培養(yǎng)液的離心管中，振蕩器振蕩30 s，吸出細(xì)胞懸液，再用0. 5 mL MS 培養(yǎng)液沖洗2 次根尖。收集細(xì)胞懸液，用1 mL 微量注射器抽打3 次，使成團(tuán)的邊緣細(xì)胞分散開。將細(xì)胞懸液在4 ℃ 下500 r·min^-1 離心2 min，棄去部分上清液，獲得分散均勻、濃度適宜的細(xì)胞懸液備用。取30 μL 不同處理的RBC 懸浮液，加入20 μL AO-EB 復(fù)合染液（AO∶EB=1∶1），避光染色1 min 后，在OlympusBX 53（U-RFL-T）熒光顯微鏡（藍(lán)色激發(fā)光）10 倍鏡下觀察拍照。每處理選取10 個(gè)視野拍照，統(tǒng)計(jì)RBC 總數(shù)，活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)量（活細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，死細(xì)胞呈橘紅色或紅色熒光）。每處理切取10 個(gè)根尖置載玻片上，滴加少量AO-EB 復(fù)合染液立即在顯微鏡下觀察拍照。

RBC 凋亡率的測定：取30 μL RBC 懸液，加入30 μL Hochest-33258 染液，暗處染色5 min 后，在紫外UV 激發(fā)光下觀察活細(xì)胞與凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征并計(jì)數(shù)［16］。

RBC 黏膠層厚度的測定：取30 μL RBC 懸液，加30 μL 的墨汁混勻，吸取30 μL 在普通光源下顯微觀察拍照。不同處理選取10 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行RBC黏膠層厚度的測量，每個(gè)細(xì)胞測3 個(gè)不同位置取其平均值［17］。

根冠果膠甲基酯酶（PME）活性測定：參照馬金虎等［18］的方法，不同處理隨機(jī)剪取30 個(gè)約5 mm的根尖，加入400 μL PME 提取液，冰浴研磨后轉(zhuǎn)移至離心管中，再用400 μL PME 提取液清洗研缽1 次，合并入離心管中，置于4 ℃ 冰箱中，每隔20 min 振蕩1 次，1 h 后，4 ℃ 15 000 r·min^-1 離心10 min。取300 μL 酶液加入4 mL PME 反應(yīng)液，37 ℃水浴2 h，525 nm 波長下測定OD 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算PME 活性。

SOD、POD、CAT 活性和MDA 含量測定分別采用氮藍(lán)四唑還原法、愈創(chuàng)木酚法、紫外吸收法和硫代巴比妥酸法測定，根系活力采用氯化三苯基四氮唑（TTC）還原法測定，H₂O₂ 含量采用分光光度法測定［19］。O₂ˉ·含量參照李光忠［20］的方法測定。利用DDS-II 型電導(dǎo)儀測定根細(xì)胞膜透性。

二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色：細(xì)胞顆粒中的過氧化物酶，能將H₂O₂ 中的氧釋放出來，氧化DAB，形成金黃色沉淀從而定位過氧化物酶活性的部位，金黃色沉淀越深，說明此處累積的H₂O₂ 越多［21］。將不同處理的豌豆幼根浸泡在DAB 染液中，置于光下，染色培養(yǎng)4 h 后取出，用去離子水沖洗3～5 遍，在體視顯微鏡下以同一參數(shù)條件進(jìn)行觀察拍照。

ROS 熒光探針染色：采用北京盒子生工科技有限公司生產(chǎn)的活性氧檢測試劑盒進(jìn)行染色測定。植物體內(nèi)活性氧是植物體內(nèi)化學(xué)性質(zhì)活躍的含氧原子團(tuán)如超氧陰離子、過氧化氫等的總稱。2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成2'，7'-二氯二氫熒光素（DCFH），而DCFH 不能透過細(xì)胞膜，從而使探針易于裝載至細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH 生成有熒光的2'，7'- 二氯熒光素（DCF）。綠色熒光的強(qiáng)度與活性氧的水平成正比。

氯化硝基氮藍(lán)四唑（NBT）染色：超氧陰離子自由基（O₂ˉ·）能將NBT 還原成不溶于水的藍(lán)色甲臜，可定位O₂ˉ·的產(chǎn)生部位。對植物根尖染色后，有O₂ˉ·產(chǎn)生的部位會呈深藍(lán)色或藍(lán)紫色，其它部位近無色或者呈植物本身的色素。所有指標(biāo)測定均3 次重復(fù)。

1. 4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

采用Microsoft Excel 2019 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism8 軟件作圖，Adobe Photoshop2019 CC 進(jìn)行輔助繪圖，SPSS 23. 0 軟件對測定指標(biāo)進(jìn)行比較（Duncan 法），顯著水平均為Plt;0. 05。

2 結(jié)果與分析

2. 1 Cd²⁺脅迫對豌豆RBC數(shù)量和PME活性的影響

從圖1A 可以看出，鎘脅迫抑制豌豆RBC 的數(shù)量，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，隨著Cd²⁺濃度的升高，附著在根尖表面的RBC 數(shù)量逐漸減少，部分細(xì)胞出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。2、5 μmol·L^-1 Cd²⁺脅迫處理后，與對照比，單株豌豆RBC 數(shù)量分別降低了15. 42% 和32. 17%（圖1B）。1、2、5 μmol·L^-1 Cd²⁺脅迫處理，根尖PME 活性顯著升高，分別比對照升高15. 53%、21. 59% 和25. 76%（圖1C）。

采用RBC 離體培養(yǎng)的方法（圖2A、2C、2E）研究發(fā)現(xiàn)，Cd²⁺脅迫誘導(dǎo)豌豆RBC 凋亡、死亡，RBC黏膠層增厚。1、2、5 μmol·L^-1 Cd²⁺脅迫，RBC 存活率分別比對照降低7. 42%、14. 29% 和42. 30%（圖2B）。RBC 凋亡率分別比對照高40. 53%、160. 61% 和306. 60%（圖2D）。RBC 黏膠層厚度分別比對照增加55. 40%、148. 74% 和248. 21%（圖2F）。

2. 2 Cd²⁺脅迫對豌豆根尖活性氧、過氧化氫和超氧陰離子含量的影響

由圖3 可見，Cd²⁺脅迫誘導(dǎo)根尖活性氧積累、過氧化氫和超氧陰離子含量升高。用DAB 對根尖進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)，隨著Cd²⁺濃度升高，根尖染色越深，H₂O₂ 積累越多（圖3A）。定量測定，5 μmol·L^-1Cd²⁺脅迫下，根尖H₂O₂含量比對照升高了13. 04%（圖3B）；用NBT 對根尖進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)，隨著Cd²⁺脅迫增加，根尖染色越深，超氧陰離子含量增加（圖3C），定量測定，1、2、5 μmol·L^-1 Cd²⁺脅迫下，根中超氧陰離子含量分別比對照升高了22. 99%、44. 16% 和51. 82%，均達(dá)顯著差異（圖3D）；用ROS 熒光探針對根尖染色發(fā)現(xiàn)，隨著Cd²⁺濃度升高，根尖藍(lán)色熒光亮度增強(qiáng)（ 圖3E）。2、5μmol·L^-1 Cd²⁺脅迫，根尖ROS 熒光強(qiáng)度分別比對照升高了16. 18% 和44. 37%（圖3F）。

2. 3 Cd²⁺脅迫對豌豆根尖抗氧化酶活性的影響

圖4 結(jié)果表明，鎘脅迫誘導(dǎo)豌豆根尖抗氧化酶活性增強(qiáng)。1、2、5 μmol·L^-1 Cd²⁺ 脅迫，SOD 活性分別比對照升高39. 71%、46. 51% 和53. 91%（圖4A），POD 活性分別比對照升高19. 99%、24. 16%和35. 92%（圖4B）。2、5 μmol·L^-1 Cd²⁺ 脅迫，CAT 活性分別比對照升高24. 42% 和38. 70%（圖4C）。

2. 4 Cd2+脅迫對豌豆根尖細(xì)胞膜透性的影響

從圖5 可知，隨鎘脅迫濃度增加，根尖MDA含量升高，根尖膜透性增大。1、2、5 μmol·L^-1 Cd²⁺脅迫，根尖MDA 含量分別比對照增加140. 67%、155. 98% 和161. 24%（圖5A）。2、5 μmol·L^-1 Cd²⁺脅迫，根尖相對電導(dǎo)率分別比對照升高13. 32% 和31. 81%（圖5B）。

2. 5 Cd²⁺對豌豆幼根根系活力及根長的影響

由圖6 可知，鎘脅迫顯著抑制豌豆幼根的根系活力及幼根生長，鎘離子濃度越高抑制作用越強(qiáng)烈。與對照相比，1、2、5 μmol·L^-1 Cd²⁺脅迫，豌豆根系活力與對照比分別降低4. 81%、13. 00% 和17. 32%（圖6C）。幼根的根長分別比對照減少18. 32%、26. 81% 和41. 41%（圖6A、圖6B）。

3 討論

當(dāng)植物根遭受土壤中有害物質(zhì)，如化感物質(zhì)和鋁、鎘脅迫時(shí)，根邊緣細(xì)胞會迅速向胞外釋放多種化學(xué)物質(zhì)，進(jìn)一步增厚黏膠層，吸附并螯合有毒物質(zhì)，緩解有害物質(zhì)脅迫對植物根的傷害［18，22-23］。王亞男［13］報(bào)道，200 μmol·L^-1 Cd²⁺ 誘導(dǎo)綠豆黏膠層顯著增厚。本研究和其相似，豌豆根尖黏膠層厚度與Cd²⁺ 濃度呈正相關(guān)，這可能是根邊緣細(xì)胞在有毒物質(zhì)下的一種應(yīng)激保護(hù)現(xiàn)象。鎘誘導(dǎo)植物根尖細(xì)胞壁中的PME 活性升高，相關(guān)基因上調(diào)，果膠去甲酯化程度上升，根邊緣細(xì)胞數(shù)量增加［13，24］。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著Cd²⁺ 濃度的增加，豌豆根尖PME 活性不斷增加，這可能是因?yàn)殒k誘導(dǎo)豌豆根尖細(xì)胞壁中PME 相關(guān)基因的表達(dá)，提高PME 活性以釋放更多RBC 抵御鎘脅迫。但本研究中RBC 數(shù)目隨著Cd²⁺濃度增加不斷減少，這與王亞男［13］的研究結(jié)果相反，造成這種結(jié)果的原因可能是隨著Cd²⁺ 濃度增加，豌豆根尖組織受損加劇，產(chǎn)生邊緣細(xì)胞的能力不斷下降。重金屬誘導(dǎo)根邊緣細(xì)胞的凋亡死亡。李榮峰等［25］研究發(fā)現(xiàn)，鎘誘導(dǎo)大豆根邊緣細(xì)胞死亡；梁劍等［26］報(bào)道，鎘誘導(dǎo)麻瘋樹根邊緣細(xì)胞存活率下降至45%～60%。從本研究結(jié)果看，隨著Cd²⁺濃度的升高，豌豆根邊緣細(xì)胞存活率不斷降低、凋亡死亡率不斷升高，表明鎘對豌豆根邊緣細(xì)胞的傷害存在劑量性依賴。

鎘脅迫引起植物氧化脅迫傷害，導(dǎo)致植物組織體內(nèi)膜脂過氧化、抗氧化系統(tǒng)代謝水平活躍，活性氧、MDA 含量升高。SOD、POD、CAT 活性增強(qiáng)，清除細(xì)胞內(nèi)活性氧，維持機(jī)體內(nèi)活性氧平衡，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷［27］。Zabka A 等［28］和Tamás 等［29］報(bào)道，鎘脅迫誘導(dǎo)根尖活性氧的積累，造成大麥、蠶豆等植物根尖細(xì)胞發(fā)育異常、根系活力降低、根長變短。張珂［30］研究發(fā)現(xiàn)，10 μmol·L^-1的Cd²⁺ 顯著誘導(dǎo)了小麥抗氧化酶SOD、POD 和CAT 活性的提高。此外，鎘會造成小麥、蠶豆、土豆等植物體內(nèi)MDA 的積累［31-33］。從本研究結(jié)果看，鎘造成豌豆幼根中活性氧的積累，隨著Cd²⁺濃度的升高，豌豆幼根的ROS 含量增加，其中H₂O₂和O₂ˉ·含量顯著增加，活性氧積累造成了豌豆幼根中抗氧化酶SOD、POD 和CAT 活性的升高；Cd²⁺造成豌豆幼根膜脂過氧化，其中MDA 含量顯著升高，細(xì)胞膜透性增加。隨著Cd²⁺濃度的增加，幼根的根系活力不斷下降，根長變短。這與前人的研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)鎘脅迫下根邊緣細(xì)胞對豌豆幼根具有一定的保護(hù)作用。由于邊緣細(xì)胞是附著在根冠外的特殊細(xì)胞，因而能夠較容易洗下邊緣細(xì)胞，得到較純凈的豌豆幼根。同時(shí)，本研究也有一些需要完善的地方。我們將繼續(xù)探究去除和未去除邊緣細(xì)胞對鎘脅迫下豌豆根尖組織結(jié)構(gòu)的影響；同時(shí)探究鎘對邊緣細(xì)胞及幼根細(xì)胞壁成分的影響及相關(guān)基因的表達(dá)，以更深入地解釋邊緣細(xì)胞對根的保護(hù)機(jī)制。

4 結(jié)論

鎘對豌豆根邊緣細(xì)胞產(chǎn)生脅迫，降低其對豌豆根尖的保護(hù)，進(jìn)一步造成豌豆幼根活性氧積累、膜脂過氧化、抗氧化酶活性升高、根系活力減弱、根長變短，且豌豆根邊緣細(xì)胞和幼根受損程度隨鎘的濃度升高而升高。