史宛瑞，崔立剛，梁曉龍

前哨淋巴結（sentinel lymph node，SLN）作為原位腫瘤發(fā)生淋巴結轉移的第一站，對于決定腫瘤分期、治療以及預后意義重大，因此對 SLN 示蹤尤為重要。SLN 示蹤技術是指采用各種示蹤劑顯示腫瘤引流區(qū)域淋巴結。目前主要分為三種方法：核素探測法、染料法和熒光探測法。其中，臨床上使用的放射性膠體和染料介導的 SLN 示蹤方法有其局限性。采用放射性膠體進行淋巴結定位的缺點主要有以下幾方面：醫(yī)護人員的輻射暴露、輻射物的處理問題、高昂的醫(yī)療成本以及對獲取放射性同位素的限制等[1]。采用染料法對 SLN 進行示蹤主要包括以下幾種染料：亞甲藍、納米碳、異硫藍和專利藍等，染料法顯示腫瘤引流區(qū)域淋巴結也有其局限性，如全身過敏反應、高假陰性率、致密脂肪組織中的低顯示率以及 SLN 中的積聚和停留時間不足等[2-3]。相比之下，在提高轉移性淋巴結的檢測靈敏度方面，熒光探測法在淋巴結定位中的應用具有巨大的前景。傳統(tǒng)的熒光探針有吲哚菁綠、亞甲藍等染料，它們能夠靈敏地顯示 SLN，但仍然存在一些問題，如染料自身顏色會污染手術視野，在淋巴結累積較少、停留時間短等，均會影響示蹤效果。因此，具有多功能的熒光納米探針相繼被開發(fā)用于克服傳統(tǒng)熒光探針的缺點[4]。

對于熒光成像，優(yōu)良的熒光染料分子的篩選需要考慮以下標準：熒光波長、量子產率、溶解度、光穩(wěn)定性、清除率和毒性等。在熒光波長方面，吸收和散射是阻礙熒光在組織中傳播的限制因素[5]。隨著熒光波長的增加，光的吸收和散射可以最小化[6]。熒光量子產率是檢驗熒光探針效率的另一個標準[7]。到目前為止，大多數報道的熒光探針在血清中的量子產率為 10%～20%，更高的量子產率非常罕見[8]，為開發(fā)具有改進的量子產率和光穩(wěn)定性的新熒光探針留下了很大的空間。熒光探針需要較好的可溶性，以便進入淋巴系統(tǒng)。熒光探針應具有較低的光化學破壞性和較高穩(wěn)定性，從而有利于其實際應用。熒光探針的潛在毒性是阻礙其臨床轉化的首要因素，應仔細考慮毒性問題，包括其化學成分、穩(wěn)定性以及參數，以便進行臨床前研究和臨床應用[9]。近年來，國內外學者對 SLN 影像示蹤進行了深入的研究，開發(fā)出各種新型熒光探針用于淋巴結示蹤。本文就 SLN 熒光示蹤方法的研究進展予以綜述，為未來開發(fā)更有前景的示蹤方法奠定基礎。

1 吲哚菁綠

吲哚菁綠是一種近紅外三碳菁染料，具有較好的生物安全性，已廣泛應用于癌癥診斷和其他領域，包括眼科的血管造影術、心輸出量和肝功能的評估、組織和器官的灌注分析、光動力治療和光熱治療等[10]。除了上述應用外，吲哚菁綠在 SLN 中的應用也很有前景。

吲哚菁綠作為腫瘤的熒光示蹤劑有許多優(yōu)點，包括其對原發(fā)病灶的定位、對 SLN 活檢的引導，為外科手術提供了重要的術中信息[11]。與傳統(tǒng)的淋巴結病理檢查相比，吲哚菁綠示蹤 SLN 可以有效減少淋巴結切除術后的并發(fā)癥。幾項臨床試驗和臨床前研究表明，吲哚菁綠在檢測癌癥 SLN 方面優(yōu)于藍色染料和放射性膠體[12-13]。Kitai 等[14]在一項 18 例癌癥患者的初步研究中發(fā)現，SLN 可通過皮下注射吲哚菁綠進行鑒定，檢測率約為 94%。這種方法使外科醫(yī)生能夠識別具有低侵襲性的 SLN，為檢測癌癥患者的腋窩 SLN提供了一種簡單而快速的方法。Papathemelis 等[15]在 104 名癌癥患者中對示蹤劑吲哚菁綠和 Technetium99m顯示 SLN的敏感性進行了臨床評估，吲哚菁綠和 Technetium99m對SLN 的檢測率分別為 98% 和 100%。該研究強調了吲哚菁綠與 Technetium99m相比的優(yōu)勢，因為其成本低，并避免了有害輻射。

然而，由于親水性差，與其他熒光染料相比檢測靈敏度欠佳等原因，吲哚菁綠的應用也有一定的局限性[16]。此外，吲哚菁綠由于其分子量低，很容易擴散到位于真正轉移淋巴結附近的其他淋巴結[16]。因此，非轉移性淋巴結可能被錯誤診斷為轉移性淋巴結，導致癌癥分期錯誤。

2 亞甲藍

亞甲藍作為熒光染料對 SLN 進行定位，具有操作簡單、價格便宜、無需使用其他設備的優(yōu)勢，是目前臨床上應用較為廣泛的示蹤劑。最初使用高劑量亞甲藍靜脈注射，用于識別甲狀旁腺腫大，并導致腺體呈藍色[17]。Yue 等[18]的研究中，亞甲藍對腋窩逆向淋巴結示蹤的成功率可高達93.5%。然而，使用高劑量亞甲藍有許多缺點。亞甲藍引起皮膚和尿液明顯變色，可能會導致患者出現過敏反應[19]。此外，其神經毒性可能會在一定程度上導致發(fā)病。一些研究利用了亞甲藍的近紅外特性，它可以實現比可見光更好的組織穿透。亞甲藍是最常用于淋巴結定位的染料之一，具有80% 的總檢測率和 50% 的雙側淋巴結檢測率[20-22]。與吲哚菁綠相比，亞甲藍因其不與蛋白結合的固有特性，其熒光在組織中具有更好的穿透能力[23]。因此，亞甲藍比吲哚菁綠更適合對 SLN 進行示蹤，因為它具有更高的吸收率和更少的熒光污染[23]。但是亞甲藍染色特異性差，量子產率弱，需要的定位時間較長，而且染色時間較短，不利于作為示蹤劑對 SLN 進行精準定位。因此，需要對材料進行改進以獲得效果滿意的示蹤劑。

3 熒光納米探針

熒光示蹤劑吲哚菁綠和亞甲藍已應用于淋巴結定位，但是它們在淋巴結內的積聚效果差、由于分子量低易于擴散到真正轉移淋巴結外的其他淋巴結等，這些可能會影響 SLN定位的準確性[24]?？朔@些缺點的潛在方法是將這些示蹤劑標記于納米顆粒上，以提高其穩(wěn)定性和循環(huán)時間，從而促進它們在腫瘤中的積聚。納米技術和材料化學方面正在進行的研究工作促進了基于納米材料的新型熒光探針的開發(fā)，這大大加快了熒光成像在 SLN 定位中的應用[25]。納米材料具有獨特的物理化學性質，如納米尺寸、高穩(wěn)定性和顯著的表面積/體積比，這使它們對 SLN 定位更有前景[26]。

研究表明，將傳統(tǒng)示蹤劑特別是吲哚菁綠嵌入納米材料中，可以增強熒光染料在腫瘤的積聚、生物相容性和特異性。與單獨的游離染料相比，可以以更低的劑量產生更高的熒光信號[27]。納米探針的表面性質與其穩(wěn)定性、毒性和生物分布密切相關[28]。例如，有研究利用氨基修飾的聚乙二醇或胺修飾的右旋糖酐結合氧化石墨烯上的羧基，使納米材料在各種生理溶液中具有良好的穩(wěn)定性[29]；因 DNA 具有特異性雜交的結構，將其組裝到納米探針上，可通過新型光熱溶解策略減輕納米探針的長期毒性作用[30]；而在納米顆粒外包被特定的涂層，如兩性離子化合物等，可以最小化生物分子冠的作用，改變納米顆粒的生物分布[31]。靶向納米探針的最新進展證明了表面功能化對 SLN 定位更具特異性和選擇性[32]。最近的一些研究表明，使用靶配體如多肽、抗體和受體配體來修飾于納米探針的表面，即可通過特異性靶向轉移性腫瘤細胞來實現對 SLN 的示蹤[33-34]。例如，Chen等[35]設計并制備了一種負載腦內皮細胞靶向劑血管肽-2 和抗腫瘤藥物（線粒體靶向劑三苯基膦修飾的氯尼達明）的趨化性納米馬達，實現了對腦內皮細胞-腫瘤細胞-線粒體的精確分步靶向。以下重點介紹幾種近期基礎研究中研發(fā)的熒光納米探針。

3.1 IR780 和甘露糖共軛體組裝的納米顆粒

轉移淋巴結的特異性識別是臨床研究的重點和難點，尤其是前哨淋巴結是否發(fā)生轉移，對于決定手術術式和治療計劃至關重要，傳統(tǒng)的熒光探針難以滿足要求。為了達到特異識別就需要解決靶向和背景熒光干擾問題。在實際應用中往往需要根據病變區(qū)域微環(huán)境的特點來設計探針。例如，當癌癥出現惡性傾向時，集落刺激因子-1 和趨化因子-2 從周圍環(huán)境中吸收單核細胞，分化為 M2 腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophages，TAM），增加腫瘤細胞的侵襲，進一步促進腫瘤的發(fā)展，在轉移性淋巴結中發(fā)現了大量的 M2 TAM[36]。據此，Zhao 等[37]將甘露糖通過二硫鍵與近紅外（near infrared，NIR）染料 IR780 連接，得到甘露糖-IR780 綴合物（MR780），該綴合物進一步自組裝成對谷胱甘肽響應的近紅外納米熒光探針。在生理條件下，該探針具有較好的穩(wěn)定性并且保持熒光猝滅狀態(tài)。而在轉移性淋巴結中，MR780 納米探針表面的甘露糖作為一種簡單的天然配體，可以選擇性地與 TAM 表面 CD206（macrophage mannose receptor，MMR）結合，進一步在腫瘤微環(huán)境中谷胱甘肽作用下斷開二硫鍵，納米探針發(fā)生解體進而恢復熒光。該納米熒光探針提供了一種通過靶向 M2 TAM 的新方法來檢測小鼠乳腺癌癥早期淋巴結轉移，可以實現精準靶向和無創(chuàng)成像雙重功能。

3.2 吲哚菁綠標記的鐵蛋白納米顆粒

傳統(tǒng)的納米顆粒成像很難提供任何關于特定腫瘤的淋巴結或淋巴管中參與的信息。這種非特異性示蹤可能導致精確度降低，也會導致材料擴散到非轉移性淋巴結，這對轉移淋巴結的準確定位有很大影響。靶向受體配體識別可以很好地解決這些問題。吲哚菁綠標記的納米顆粒在實時淋巴結定位和局部區(qū)域淋巴結示蹤的效果已在許多研究中得到證實[13]，而將其與具有靶向特性的蛋白顆粒結合則有望進一步提高其示蹤能力。研究表明，乳腺癌細胞中 H 鐵蛋白和TfR1 之間具有較強的靶向親和力，將吲哚菁綠標記到 H鐵蛋白片段上表現出優(yōu)異的特性。這項研究表明，給藥 6 h后，腫瘤中有強烈的吲哚菁綠負載的 H 鐵蛋白信號，而游離吲哚菁綠沒有表現出腫瘤靶向特異性。因此，吲哚菁綠標記的鐵蛋白納米顆?？赡鼙憩F出良好的熒光特性，細胞攝取能力和高腫瘤靶向能力增加[38]。

3.3 脂質體熒光納米顆粒

脂質體也具有巨大的治療潛力，它們幾乎可以包裹任何的小分子。脂質體的生物相容性好，顆粒的尺寸可以從幾納米到幾微米不等，其物理和化學性質已經被充分研究，是用于藥物遞送和治療的良好載體[39]。熒光材料可以共價或非共價結合到脂質體上（在脂質膜上或在內水腔中）。此外，它們的表面可以很容易地用生物識別分子進行功能化，如抗體、聚糖和多肽等，用于特異性靶向。例如，葉綠素在結構上與卟啉相似，都具有近紅外熒光特性，是一種安全的熒光材料，在生物體內成像具有很大潛力。但是葉綠素水溶性差，為提高其水溶性進行 SLN 成像，可將其封裝到納米脂質體中。Fan 等[40]通過使用葉綠素結合的脂質體進行了淋巴結定位。他們發(fā)現，平均尺寸為 22 nm 的脂質體能夠在小鼠模型中發(fā)射大約 680 nm 的熒光，用于 SLN 定位。此外，他們觀察到該材料對巨噬細胞和正常肝細胞系的細胞毒性較低，在臨床 SLN 定位上具有巨大潛力。

3.4 基于熒光硅納米顆粒的外泌體探針

為了克服傳統(tǒng)納米示蹤劑的一些固有缺點，如納米材料粒徑和形狀難以控制，影響其性質；尺寸小、活性高，容易被環(huán)境中雜質所污染等，可以通過對其表面進行修飾或者優(yōu)化制備條件，從而得到更加穩(wěn)定、性質更好的材料。外泌體作為參與細胞間通訊的特異性膜泡，近年來受到了極大的關注。與合成的納米顆粒相比，外泌體具有免疫原性低、毒性低等優(yōu)點。此外，外泌體還有很強的同源靶向能力，因此腫瘤來源的外泌體有望在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用。熒光硅基納米材料具有相對強的熒光、優(yōu)異的穩(wěn)定性、毒性低等特點，適用于長期實時的生物成像。基于以上材料特性，Han 等[41]開發(fā)了基于硅納米顆粒的外泌體（SiNPs@EXO），可以很好地區(qū)分轉移性淋巴結和正常淋巴結，該研究也證明了癌細胞來源的外泌體具有靶向同源細胞的能力。因此，具有穩(wěn)定熒光特性的 SiNPs 和具有腫瘤歸巢效應的癌細胞來源的外泌體的聯合為轉移性淋巴結的示蹤提供了一種新方法。SiNPs@EXO 的熒光信號在注射后 15 min 達到峰值，甚至在注射后 3 h 仍保持相對較強的強度，表明該類探針可以快速準確地檢測轉移淋巴結。

3.5 熒光雙靶向納米顆粒

除了可用于多種癌癥的傳統(tǒng)納米顆粒外，有些研究還設計了特定于某種腫瘤的納米顆粒。為了提高靶向特異性，單一靶向有時不能滿足定位需求，需要設計雙靶向納米顆粒進行示蹤。如使用負載 NIR 熒光染料 DiR-BOA 的雙靶向納米顆粒來靶向淋巴結中的乳腺癌細胞，通過使用兩種成像方式（熒光成像和光聲成像）實現對淋巴結的識別[42-43]。其中，乳腺癌過表達 CD44 受體，通過透明質酸靶向 CD44 作為該納米顆粒的第一個靶點[44]。然而，CD44 的表達位點容易受到透明質酸占用的影響，很容易飽和，導致腫瘤靶向性不佳[45]。雙受體靶向給藥系統(tǒng)將更有效地靶向乳腺癌細胞，因此，開發(fā)了一種類似肽-磷脂支架納米顆粒的高密度脂蛋白，可以靶向乳腺癌的另一受體-B 類 I 型清道夫受體（scavenger receptor class B type I，SR-BI）。值得注意的是，該納米顆?？梢酝ㄟ^熒光成像或光聲成像快速實現淋巴結可視化，同時具有 CD44 和 SR-BI 的雙重靶向性[46]。

4 多模態(tài)成像探針

在臨床實踐中，除了熒光成像外，CT、PET、MRI 和放射性同位素成像通常也是 SLN 定位的檢查方法[47]。然而，每種成像方式都有其獨特的優(yōu)勢和固有的局限性，例如放射性同位素成像提供了良好的穿透深度，也可以定量檢測，但是分辨率較差，不能清楚地識別淋巴結。MRI 在軟組織（如淋巴系統(tǒng)）中對比度高，可以提供功能信息，但是靈敏度有限、空間分辨率低[48-49]。類似地，PET/CT 的空間和時間分辨率也較差[47]。熒光成像提供了高空間分辨率和時間分辨率，但是由于滲透深度有限，淋巴通路的成像受到影響[50]。因此，結合熒光成像和其他成像方法的多模態(tài)納米探針的設計有利于更好地進行 SLN 的示蹤[47]。為此，Huang 等[51]將正電子發(fā)射放射性核素64Cu、NIR 染料ZW800 和 MRI 造影劑 Gd3+三者整合到介孔SiNP 中，以促進 4T1 荷瘤模型中 SLN 的多模態(tài)（NIRF/MRI/PET）成像。這種三模態(tài)的納米探針在轉移性 SLN 的定位中有其獨特的優(yōu)勢，在攝取率、穩(wěn)定性和滯留時間上都有所提升。然而，需要進一步的研究，以優(yōu)化三種成像粒子的比例、顆粒大小和臨床轉化的遞送途徑。

5 結論與展望

淋巴結定位對判斷惡性腫瘤預后有重要意義。SLN 示蹤可早期識別區(qū)域淋巴結中的微轉移，有助于惡性腫瘤患者采取合適的治療方式，顯著改善患者的預后。然而，傳統(tǒng)的SLN 示蹤劑（如小分子染料）有一定的局限性。近年來，專門用于 SLN 定位的非侵入性分子成像方法得到了快速發(fā)展，如熒光成像，因其具有高靈敏度和非放射性[36]。納米技術發(fā)展迅速，為尋找更合適的熒光探針用于無創(chuàng) SLN成像奠定了良好的基礎，其優(yōu)勢包括優(yōu)異的光學穩(wěn)定性、尺寸可調、更高的熒光強度和豐富的表面功能化修飾等。盡管納米熒光探針在準確定位淋巴結方面取得了顯著進展，但仍存在一些局限性，如納米探針的臨床轉化受到材料毒性的影響。在設計納米探針時，不僅要注意它們的性能，還要注意長期的生物安全性，這對臨床轉化至關重要；一些納米探針僅能用于特定腫瘤的示蹤，不適合在其他腫瘤中應用。因此，在納米顆粒設計時應更多地關注不同腫瘤之間的差異和聯系，以不同腫瘤之間的相似性為切入點；此外，大多數納米探針用于 SLN 定位，不適用于多發(fā)淋巴結轉移的患者。因此，在納米顆粒的設計中應更多地注意適用于所有轉移淋巴結。相信隨著納米技術的飛速發(fā)展，熒光探針在 SLN 的示蹤中將得到進一步的發(fā)展，甚至可以結合治療功能，其前景值得期待。