王 焱

(中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，光華口腔醫(yī)學(xué)院，廣東省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省牙頜系統(tǒng)修復(fù)重建技術(shù)與材料工程技術(shù)研究中心，廣州 510055)

引導(dǎo)骨再生（guided bone regeneration，GBR）術(shù)是一種被廣泛應(yīng)用于口腔種植和牙周臨床的技術(shù)，其通過(guò)屏障膜的使用，在牙齦軟組織與骨缺損之間建立生物屏障，阻擋上皮和成纖維細(xì)胞長(zhǎng)入骨缺損區(qū)，為成骨細(xì)胞增殖、新骨形成提供一個(gè)相對(duì)封閉的環(huán)境，從而達(dá)到引導(dǎo)骨組織再生和定向修復(fù)的目的[1]。理想的引導(dǎo)骨再生屏障膜應(yīng)具有良好的機(jī)械性能，包括良好的空間維持性能和臨床可操作性，良好的生物性能如生物相容性、生物活性、組織選擇性和抗菌性等，以適配復(fù)雜的口腔組織環(huán)境并促進(jìn)新骨形成[1]。

在各類(lèi)GBR 膜材料中，天然高分子材料來(lái)源的屏障膜，如膠原、明膠、殼聚糖、絲素蛋白等，生物相容性相對(duì)較好，但通常機(jī)械強(qiáng)度低、降解速度快，難以支撐大面積骨缺損的再生空間[2]，且功能較為單一。因此，人工合成功能性GBR 屏障膜材料的研發(fā)對(duì)于臨床具有重要意義。目前，人工合成可吸收聚合物膜的細(xì)胞親和性和骨傳導(dǎo)活性仍較弱[3]，且其降解過(guò)程可能釋放酸性副產(chǎn)物引起炎癥反應(yīng)[4]，影響臨床效果。近年來(lái)，廣大學(xué)者從口腔軟硬組織固有的再生環(huán)境和再生過(guò)程出發(fā)，基于骨組織工程的策略，將骨再生相關(guān)分子、成骨活性細(xì)胞與支架材料三者復(fù)合，并結(jié)合先進(jìn)的納米工程技術(shù)，調(diào)控材料的功能成分和理化結(jié)構(gòu)，從而獲得可以適配組織再生過(guò)程各種活性分子、活性細(xì)胞、組織生長(zhǎng)需求的新型功能屏障膜，以獲得更理想的臨床療效，滿足臨床更高的需求。本文就近年基于組織工程理論對(duì)GBR 功能屏障膜材料進(jìn)行改性的技術(shù)及方法進(jìn)行總結(jié)梳理，以期為廣大臨床及科研工作者提供參考。

1 功能成分調(diào)控

屏障膜在GBR 過(guò)程中不僅僅起到被動(dòng)物理屏障作用，更能發(fā)揮主動(dòng)的生物活性功能促進(jìn)骨組織再生?；诠墙M織工程原理，通過(guò)改變屏障膜支架的成分和結(jié)構(gòu)，可調(diào)控成骨細(xì)胞的黏附、增殖、分化，促進(jìn)新生骨的沉積。其中，屏障膜功能成分的調(diào)控策略主要包括添加骨再生相關(guān)生長(zhǎng)因子、生物活性骨替代材料、促成骨活性藥物或化學(xué)成分、骨免疫調(diào)控的金屬活性離子、抗菌成分等。

1.1 添加骨再生相關(guān)生長(zhǎng)因子

如何調(diào)控多種具有不同生物活性的生長(zhǎng)因子在骨再生的相應(yīng)階段發(fā)揮作用，模擬自然成骨過(guò)程，是近代骨組織工程的主要研究熱點(diǎn)。屏障膜可以作為成骨相關(guān)生長(zhǎng)因子的良好緩釋載體，形成生物活化功能性膜，促進(jìn)成骨活性細(xì)胞的增殖和表達(dá)。目前常用的促骨組織生長(zhǎng)因子主要有骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、血小板源生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor, PDGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin-like growth factor, IGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor, TGF-β）等[5]。BMP是骨組織工程中應(yīng)用和研究最廣泛的生長(zhǎng)因子之一，具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化增殖為成骨細(xì)胞的能力。它可以與各種具有不同性質(zhì)的GBR 載體膜結(jié)合，賦予膜促進(jìn)骨再生的生物活性[6]。目前在屏障膜材料中添加生長(zhǎng)因子的主要技術(shù)難點(diǎn)在于生長(zhǎng)因子的活性保持、有效/安全濃度的控制和釋放控制。另外，生長(zhǎng)因子的成本也是產(chǎn)品臨床轉(zhuǎn)化中需考慮的另一因素。

1.2 添加生物活性骨替代材料

將具有骨傳導(dǎo)性的骨替代材料如磷酸鈣、羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）、β-磷酸三鈣被加入屏障膜中，能起到促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化、增強(qiáng)新骨礦化沉積、促進(jìn)骨組織再生的作用。研究報(bào)道磷酸鈣改性的絲基膜可檢測(cè)到更顯著的新骨形成[7]。還有研究使用電噴霧或超聲涂布方法對(duì)聚（D，L-乳酸）/聚（D，L-丙交酯-乙交酯）膜表層進(jìn)行HA 納米粒子涂布，涂層聚合物膜顯示出更好的成骨細(xì)胞代謝活性[8]。自20 世紀(jì)60 年代后期以來(lái)，用于組織工程再生醫(yī)學(xué)的生物活性玻璃被廣泛開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。生物活性玻璃具有良好的軟硬組織黏附性，以及骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)和促血管生成特性，被認(rèn)為是第三代生物醫(yī)學(xué)材料[9]。將其通過(guò)表面涂層技術(shù)涂覆在生物屏障膜表面，可達(dá)到明顯的功能改善。Dau 等的研究已顯示通過(guò)旋轉(zhuǎn)噴涂法制備的二氧化硅增強(qiáng)納米HA 涂層膠原膜顯示出顯著提升的促血管化特性[10]。

1.3 添加促成骨活性藥物或化學(xué)成分

部分促成骨的藥物或化學(xué)成分可影響局部成骨微環(huán)境，從而調(diào)控成骨過(guò)程。雙膦酸鹽通過(guò)減弱破骨細(xì)胞活性來(lái)干擾骨轉(zhuǎn)換過(guò)程，從而減少骨破壞吸收。Vab Oirschot B 等報(bào)道了睪酮和阿倫膦酸鹽藥物涂層的PLA 膠原膜顯示出優(yōu)于無(wú)藥物對(duì)照組的骨再生效果[11]。還有部分研究報(bào)道了化學(xué)藥物辛伐他汀、化學(xué)分子N-甲基吡咯烷酮[12]和GlyT2-IN-1（Yoda1）[13]、生物活性提取物表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯[14]等化學(xué)藥物應(yīng)用于改良屏障膜性能的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均顯示出一定的促骨再生效果。此外，一些其它動(dòng)植物活性成分如BMP-2 相關(guān)肽P28，釉原蛋白和淫羊藿苷也已應(yīng)用于骨組織工程[15]，表現(xiàn)出可應(yīng)用于GBR 屏障膜改性的促成骨潛能。總體而言，目前關(guān)于藥物成分應(yīng)用于屏障膜的研究較少且較為分散，在其研發(fā)過(guò)程中，藥物成分的生物安全性和細(xì)胞毒性需要重點(diǎn)關(guān)注，部分藥物促組織再生的具體機(jī)制還需更進(jìn)一步探究。

1.4 添加骨免疫調(diào)控的金屬活性離子

近年來(lái)，功能性GBR 屏障膜的研發(fā)除了關(guān)注干細(xì)胞成骨分化的直接調(diào)控，還關(guān)注對(duì)干細(xì)胞分化的微環(huán)境尤其是免疫微環(huán)境的管理，通過(guò)創(chuàng)造利于成骨分化的局部微環(huán)境，誘導(dǎo)新骨的形成。研究表明，金屬活性離子如鋅（Zn）、鎂（Mg）、鈷（Co）和鍶（Sr）等具有良好的成骨調(diào)控和免疫調(diào)控作用[16]。在可吸收膠原膜降過(guò)程中，微量金屬活性離子的釋放可以調(diào)節(jié)局部的成骨微環(huán)境，促進(jìn)骨再生。鋅是一種有效的骨免疫調(diào)節(jié)劑，影響巨噬細(xì)胞極化和成骨細(xì)胞分化[17]。有研究報(bào)道金屬有機(jī)框架晶體修飾的電紡不對(duì)稱雙層聚己內(nèi)酯/膠原（PCL/Col）膜實(shí)現(xiàn)了鋅離子的pH 響應(yīng)性釋放，在體外和體內(nèi)均顯示骨誘導(dǎo)性和血管生成增強(qiáng)[18]?？傮w而言，金屬活性離子可賦予屏障膜活性功能，不易分解，作用效果較穩(wěn)定，作為骨免疫調(diào)控因子用于骨組織工程研發(fā)可吸收功能屏障膜具有良好應(yīng)用前景。需注意的是，金屬離子的作用具有濃度依賴性，其釋放速率和濃度調(diào)控是優(yōu)化其在屏障膜中作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

1.5 添加抗菌成分

細(xì)菌雖然不直接參與骨組織再生過(guò)程，但細(xì)菌感染引起的炎癥反應(yīng)會(huì)激活破骨細(xì)胞，抑制成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，引發(fā)骨吸收。因此，在膜中添加抗菌成分能有效降低術(shù)后感染的風(fēng)險(xiǎn)，在一定層度上保障新骨的正常生成。抗菌成分主要通過(guò)涂層方式和結(jié)構(gòu)載藥緩釋系統(tǒng)應(yīng)用于功能屏障膜。聚乙二醇、超疏水結(jié)構(gòu)涂層、生物膜基質(zhì)降解酶涂層、銀納米粒子涂層、二氧化鈦光活性涂層等物質(zhì)被廣泛用于抗菌屏障膜的制作[15]。靜電紡絲作為一種新的納米支架制備技術(shù)，可用于制備載藥緩釋系統(tǒng)。常用的抗菌藥物和化合物如阿司匹林、阿奇霉素、甲硝唑、抗菌肽等可通過(guò)靜電紡絲技術(shù)裝載進(jìn)電紡納米纖維膜中，且可通過(guò)改變加工參數(shù)來(lái)調(diào)控藥物的裝載效率和釋放特性[19]。Boda 等人通過(guò)靜電紡絲法將一種負(fù)載抗菌肽D-GL13K 的氧化果膠的涂覆于殼聚糖膜上，結(jié)果顯示載有抗菌肽的殼聚糖膜具有優(yōu)異的抗菌性能[20]?？股睾推渌咕钚晕锏脑谄琳夏ぶ械母郊邮褂眯枰P(guān)注其耐藥性和細(xì)胞毒性，如何更好地負(fù)載抗菌成分、調(diào)控其特異性釋放和長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮作用仍是研究熱點(diǎn)。

2 理化結(jié)構(gòu)調(diào)控

基于組織工程原理，除了功能成分，屏障膜的孔隙結(jié)構(gòu)、表面形貌、降解速度、膜層數(shù)結(jié)構(gòu)、仿生礦化等都可在一定程度上調(diào)控細(xì)胞遷移、黏附等生理活動(dòng)，最終影響GBR 技術(shù)的效果。

2.1 屏障膜的孔隙結(jié)構(gòu)

孔隙結(jié)構(gòu)是GBR 屏障膜的一個(gè)重要性質(zhì)，屏障膜材料的孔隙率和孔隙大小會(huì)影響長(zhǎng)入細(xì)胞的類(lèi)型，包括牙齦上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫炎癥細(xì)胞、血管組織及骨組織細(xì)胞等。選擇合適的孔隙率和孔隙大小，對(duì)于促進(jìn)骨組織的生長(zhǎng)起著至關(guān)重要的作用。在膠原膜材料中，隨著孔隙率和孔隙大小的增加，巨噬細(xì)胞M2 相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)增加，而M1 相關(guān)的標(biāo)志物表達(dá)下降[21]。據(jù)報(bào)道，e-PTFE膜5-30 μm 大小的孔隙容易導(dǎo)致細(xì)菌污染和軟組織的牢固附著。隨后開(kāi)發(fā)的具有亞微米0.2 μm 孔徑的高密度(d)-PTFE，可避免此種現(xiàn)象[22]。Gutta 等研究提示鈦膜中超過(guò)1 mm 的大孔徑可以促進(jìn)更好的骨再生[23]。目前臨床及實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的各類(lèi)屏障膜的孔隙率和孔隙大小各不相同，最佳的膜孔隙率和孔隙大小也尚無(wú)定論，需要更加嚴(yán)格地控制實(shí)驗(yàn)因素，通過(guò)進(jìn)一步的系統(tǒng)研究去驗(yàn)證。同時(shí)，膜的多孔性和滲透性在局部骨缺損區(qū)促進(jìn)骨愈合的具體作用機(jī)制也需進(jìn)一步探究。

2.2 屏障膜的降解速度

對(duì)于可吸收屏障膜，其降解速度應(yīng)該與新骨的形成速度相匹配，以維持局部輪廓。天然膠原膜雖然具有良好的生物相容性，但仍存在降解不規(guī)則、降解速率過(guò)快、空間穩(wěn)定性差等問(wèn)題，通常只能維持30 天左右，容易導(dǎo)致手術(shù)部位塌陷[24]。目前可有以下幾種方法改進(jìn)：1）多層膜疊加獲得更加致密的結(jié)構(gòu)以及更長(zhǎng)的降解時(shí)間；2）通過(guò)各種方法增加膠原蛋白交聯(lián)度，從而降低降解速度；3）通過(guò)添加其他降解時(shí)間更長(zhǎng)的生物材料，如生物陶瓷、碳和聚合物材料等；4）采用人工材料如PLA，PLGA，PCL 等，通過(guò)靜電紡絲等技術(shù)制備成納米纖維支架材料，延長(zhǎng)降解時(shí)間，同時(shí)可獲得良好的比表面積、機(jī)械強(qiáng)度和仿生效果[25]。另外，更為理想的多功能GBR 膜材料還可充當(dāng)藥物或生物分子的載體，降解速度可適配GBR 過(guò)程不同細(xì)胞的生長(zhǎng)需求以及不同階段成骨和抗菌需求，因此，膜的成分、結(jié)構(gòu)及降解行為也可根據(jù)不同的階段的組織再生需求去進(jìn)行材料設(shè)計(jì)，從而達(dá)到理想的材料基因工程的理念。

2.3 多層屏障膜

設(shè)計(jì)不同功能和結(jié)構(gòu)的多層屏障膜可賦予屏障膜更加豐富的性能，以滿足更加復(fù)雜的臨床要求。每層膜應(yīng)具有不同的結(jié)構(gòu)特性：內(nèi)層（疏松層）高孔隙率有利于成骨細(xì)胞的粘附和增殖，同時(shí)穩(wěn)定血凝塊，促進(jìn)軟組織在雙層膜中的整合。外層（致密層）的孔隙率較小且強(qiáng)度大，阻止成纖維細(xì)胞向骨缺損區(qū)的遷移，允許干細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)，同時(shí)維持成骨空間。此外，雙層膜結(jié)構(gòu)之間存在的間隙應(yīng)能夠促進(jìn)組織整合[26]。有研究利用靜電紡絲和光交聯(lián)技術(shù)制備了明膠甲基丙烯酰胺（gelatin methacrylamine，GelMA）/ 聚乙二醇二丙烯酸酯（poly ethylene glycol diacrylate，PEGDA）雙層膜。該膜具有纖維納米結(jié)構(gòu)和水凝膠性質(zhì)的雙層結(jié)構(gòu)，內(nèi)層具有高孔隙率而外層具有低孔隙率。控制交聯(lián)時(shí)間和PEGDA 比例也可以調(diào)節(jié)雙層膜的物理性質(zhì)、降解速率、細(xì)胞粘附和增殖[26]。功能梯度膜（functionally gradient membrane, FGM) 也是一種特殊的多層屏障膜。其成分或結(jié)構(gòu)呈連續(xù)或梯度分布，因此除了結(jié)構(gòu)，其功能也呈梯度變化[27]。多層屏障膜是一種新的發(fā)展趨勢(shì)，可用于克服單一材料的不足。利用不同膜材料或不同制備技術(shù)，如3D 打印、空氣等離子體、靜電紡絲和光交聯(lián)的組合、紫外線照射或化學(xué)溶液浸漬和交聯(lián)的組合等，可制作不同結(jié)構(gòu)不同特性的多層膜，使其發(fā)揮更加全面的作用。但另一方面，復(fù)雜的制備工藝和高制作成本一定程度上又限制了其生產(chǎn)和應(yīng)用。

2.4 仿生礦化

仿生礦化，即模擬天然組織的化學(xué)成分和微觀結(jié)構(gòu)，通過(guò)分子仿生合成、分子自組裝等技術(shù)，人為調(diào)控?zé)o機(jī)礦物在有機(jī)物模板上的沉積，從而制備出具有高度模擬生物礦化組織的顯微分級(jí)結(jié)構(gòu)和優(yōu)異力學(xué)性能的無(wú)機(jī)有機(jī)復(fù)合材料[28]。膠原模板本身具備優(yōu)異的生物相容性，其所含的礦化鈣磷晶體可模擬天然骨組織的無(wú)機(jī)成分；與此同時(shí)，仿生礦化膠原材料本身具備的三維多孔結(jié)構(gòu)又使其具有優(yōu)良的骨傳導(dǎo)性, 為血管和新生骨組織提供了良好的生長(zhǎng)空間[29]。

通過(guò)仿生礦化的方法對(duì)膠原膜材料進(jìn)行改進(jìn), 可獲得顯著提升的機(jī)械強(qiáng)度和骨傳導(dǎo)性等性能以適應(yīng)臨床應(yīng)用的需求。有研究通過(guò)偶聯(lián)高分子量聚丙烯酸可實(shí)現(xiàn)膠原類(lèi)屏障膜的纖維內(nèi)自礦化，該仿生礦化膠原膜可通過(guò)激活線粒體動(dòng)力學(xué)途徑促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，同時(shí)基于該仿生礦化策略可提高膠原基質(zhì)的剛度，為間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的骨組織再生提供有利的機(jī)械力學(xué)信號(hào)[30]。近期有研究報(bào)道了具有免疫調(diào)控作用的imRNA- 無(wú)定形磷酸鈣礦化前體介導(dǎo)的仿生礦化膠原膜，該材料不僅在骨缺損區(qū)域完成了快速礦化，還能通過(guò)激活JAK2/STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型分化促進(jìn)血管化骨再生進(jìn)程[31]。

總之，仿生礦化可賦予屏障膜優(yōu)異的成分和結(jié)構(gòu)特性，利于骨再生。此外，通過(guò)在仿生礦化膠原內(nèi)添加生物活性因子等還可進(jìn)一步賦予其促進(jìn)干細(xì)胞的黏附、增殖和成骨分化的能力，具有良好的應(yīng)用前景。

3 電化學(xué)調(diào)控

骨組織修復(fù)和再生的過(guò)程需要多種生理信號(hào)，包括生物化學(xué)信號(hào)、機(jī)械信號(hào)和電信號(hào)，它們共同作用以保障組織形態(tài)和功能的恢復(fù)。天然骨組織本身具有壓電效應(yīng)，它在響應(yīng)機(jī)械活動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的電荷/電位能夠促進(jìn)骨的生長(zhǎng)。而電活性生物材料能夠直接對(duì)細(xì)胞傳輸電化學(xué)信號(hào)以誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化和促進(jìn)組織再生[32]。電活性生物材料可以分為壓電材料和導(dǎo)電材料。其中壓電材料由于其響應(yīng)機(jī)械變形而產(chǎn)生電荷/電勢(shì)的能力，可以在骨缺損區(qū)形成仿生電學(xué)微環(huán)境，具有良好的骨誘導(dǎo)性，在骨組織工程領(lǐng)域顯示出巨大的潛力。

用于骨組織工程的壓電材料類(lèi)型主要包括了人工聚合物如聚L-乳酸（poly L-lactide，PLLA）、聚偏氟乙烯（poly vinylidene fluoride，PVDF) 、聚偏氟乙烯-三氟乙烯（Poly vinylidene fluoride-trifluro ethylene，PVDF-TrFE）、聚羥基丁酸酯等；陶瓷類(lèi)材料如HA、鈮酸鋰、鈦酸鋇、氮化硼納米管等[32]。近年來(lái)，通過(guò)使用具有壓電活性的屏障膜材料或者在屏障膜中添加電活性材料使其具有壓電活性已受到越來(lái)越多的關(guān)注。目前關(guān)于壓電材料應(yīng)用于屏障膜的研究主要集中于人工聚合物材料和陶瓷材料及其復(fù)合材料。有研究證實(shí)，具備電活性的PLLA 膜具有可吸收性和良好的促成骨能力，化學(xué)改性后的PLLA 胺基生物膜可以促進(jìn)細(xì)胞的黏附和增殖，增加體外實(shí)驗(yàn)骨缺損區(qū)的新骨形成[33]。還有研究表明，含5%鈦酸鋇納米顆粒的PVDF-TrFE 膜具有和天然骨組織接近的壓電系數(shù)，可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，能有效地促進(jìn)血管化成骨[34]。通過(guò)調(diào)整壓電成分在屏障膜中的比例或者壓電膜本身的壓電系數(shù)，可改變膜材料表面及內(nèi)部的電學(xué)微環(huán)境，使其有利于新骨形成，從而改善骨缺損局部組織再生的進(jìn)程，這也成為調(diào)控屏障膜性能的一種重要的電化學(xué)策略。壓電屏障膜材料的未來(lái)研究方向是對(duì)材料親水性、壓電性能和表面形貌進(jìn)行改進(jìn)，并結(jié)合藥物遞送和抗菌性能的提升，以及與干細(xì)胞的結(jié)合運(yùn)用。

4 挑戰(zhàn)及展望

基于組織工程策略的新型功能性GBR 屏障膜研發(fā)，總體理念在于調(diào)控材料的功能成分和理化結(jié)構(gòu)，以期獲得可以適配組織再生過(guò)程的局部再生微環(huán)境需求的新型功能屏障膜。隨著生物材料、納米技術(shù)、組織工程等的發(fā)展，新型GBR 屏障膜的研發(fā)內(nèi)容更加多元化，分支也更加廣泛，但目前尚無(wú)一種新型膜能完全滿足理想GBR 屏障膜的所有要求，關(guān)于屏障膜的研發(fā)，目前大部分研究也仍處于實(shí)驗(yàn)室階段；同時(shí)，一些深入的分析研究也有待進(jìn)行，如各種因子、成分負(fù)載于膜上作用的交互作用、時(shí)空效應(yīng)和潛在機(jī)制等，確定合適的改性方法和材料的組合仍應(yīng)是未來(lái)研發(fā)屏障膜的主要方向。總之，新型功能性GBR 屏障膜從實(shí)驗(yàn)室材料設(shè)計(jì)、研發(fā)到最終臨床轉(zhuǎn)化仍有很長(zhǎng)的路要走，但是遵循組織工程學(xué)的原理去進(jìn)行材料設(shè)計(jì)將是未來(lái)重要的一種趨勢(shì)。

衷心感謝王小雙博士在本文文獻(xiàn)檢索及資料整理等方面所做的大量工作。