李寧晰，顧文源，倪俊卿，馬亞賓，朱禮倩，丁秀艷★

（1.河北大學生命科學學院，河北保定 071002；2.河北省動物疫病預防控制中心，河北石家莊 050026；3.河北省畜牧良種工作總站，河北石家莊 050035）

1 牛皰疹病毒1 型

牛皰疹病毒1 型（Bovine herpes virus 1，Bo-HV-1）是皰疹病毒科α 皰疹病毒亞科成員。 牛是BoHV-1 感染的自然宿主，在全球廣泛流行和分布，對世界養(yǎng)牛業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失，美國養(yǎng)牛業(yè)因該病毒每年損失約30 億美元。

通常BoHV-1 病毒感染引起呼吸道、 生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。 其潛伏期通常為2～7 天。其臨床癥狀主要包括呼吸系統(tǒng)炎癥、高燒、結膜炎、鼻孔發(fā)炎、呼吸困難、生殖器官病變潰瘍以及子宮炎癥等。 重要的是BoHV-1 感染還可以導致免疫抑制，從而導致繼發(fā)性細菌感染，引起牛呼吸系統(tǒng)疾病綜合癥（BRDC），是引起幼畜死亡的重要原因之一。 急性感染后會建立持續(xù)終生的潛伏感染，長途運輸、疾病和用藥等均能激活潛伏感染的病毒， 從而產生具有感染性的病毒并引起發(fā)病。

大量流行病學調查表明BoHV-1 在我國廣泛分布，并造成了較大的經(jīng)濟損失。 開發(fā)簡便、快速并且適合大范圍應用的病毒檢測技術對我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)具有重要意義， 本文就目前常用實驗室檢測技術進行綜述。

2 實驗室檢測BoHV-1 感染的常用方法及PCR 檢測的優(yōu)勢

目前實驗室檢測BoHV-1 感染的技術較多，例如細胞培養(yǎng)、組織病理學、血清學、病毒分離鑒定、 電子顯微鏡和聚合酶鏈式反應（PCR）等。 細胞培養(yǎng)技術是利用BoHV-1 感染細胞造成的細胞病變效應（CPE）的特征性，通過觀察CPE 來進行檢測， 需要細胞培養(yǎng)周期長且檢測的準確性較低； 組織病理學通過檢測組織樣本中病毒基因表達產物來對BoHV-1 感染進行檢測，由于這類病毒裂解性感染是暫時性的，故組織學檢測具有時間局限性； 電子顯微鏡技術可以通過識別細胞樣本中病毒顆粒從而快速檢測BoHV-1 感染，但其準確性同樣較低；病毒分離鑒定是BoHV-1 感染常用檢測方法，但病毒分離的條件比較苛刻， 病毒失活以及分離時間過久都會影響檢測結果， 且病毒分離鑒定僅限于實驗室檢驗，很難進行大規(guī)模的臨床樣品檢測；血清學測試則通過利用多種酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）對感染牛的血清樣本進行檢測，相較于前面所述的幾種方法，ELISA 技術操作相對簡單方便，也是目前應用較多的一項檢測技術。 但是該方法所用試劑盒主要依賴進口產品， 價格較高，不適合大量臨床樣品檢測。

對比上述幾類檢測技術，PCR 方法具有便捷、靈敏度更高、成本低等優(yōu)勢，可以在較短時間內獲得檢測結果。 PCR 方法所具有的高度靈敏性使其在檢測過程中對于樣品的要求更低，利用眼鼻拭子、精液、腦組織等樣品均可以進行檢測。 不同種類的PCR 技術（如熒光定量PCR、巢式PCR、多重PCR 等）也可以滿足不同條件下的檢測需求， 并且檢測成本以及檢測環(huán)境的要求也相對較低，適用于大規(guī)模檢測。

3 不同PCR 方法檢測BoHV-1 研究現(xiàn)狀

3.1 常規(guī)PCR 技術

常規(guī)的PCR 技術是相對簡便的基因片段擴增實驗方法， 也是最早被嘗試應用于檢測Bo-HV-1 感染的方法之一。 常規(guī)PCR 通過設計與BoHV-1 病毒基因片段的特異性結合引物，確定最佳反應條件（如退火溫度、延伸時間等），準確擴增對應病毒基因片段，通過凝膠電泳直觀準確的顯示檢測結果。

盡管常規(guī)PCR 是成熟的實驗技術， 大量實驗發(fā)現(xiàn)在實際檢測中很難順利擴增BoHV-1 基因片段，其原因可能在于BoHV-1 基因組中富含CG 堿基，故在引物設計以及目的片段擴增實驗過程中難以對退火溫度等條件進行優(yōu)化， 常規(guī)PCR 實驗擴增的特異性降低， 從而導致實驗結果容易出現(xiàn)非目的條帶，甚至可能出現(xiàn)無法擴增目的DNA 片段的情況， 這限制了PCR 技術在BoHV-1 臨床檢測中的應用。

3.2 巢式PCR

巢式PCR（Nested PCR）也稱為套式聚合酶鏈反應， 是一種在常規(guī)PCR 基礎上改進的實驗技術， 可以在常規(guī)PCR 特異性偏低的情況下用于PCR 實驗檢測。 這種實驗方法需要設計兩對不同的PCR 引物，第一對引物用于對目的DNA片段進行常規(guī)的PCR 擴增， 然后以第一輪PCR產物為模板， 利用第二對引物 （被稱為巢式引物），擴增一條相對更短的DNA 片段，可以排除第一輪常規(guī)PCR 擴增中出現(xiàn)的非特異性條帶，通過巢式PCR 技術可以提高PCR 擴增的特異性。

利用巢式PCR 可以解決常規(guī)PCR 檢測Bo-HV-1 病毒感染實驗中出現(xiàn)的非特異性片段擴增問題，從而提高PCR 檢測的準確性，同時提高其準確性。 目前巢式PCR 實驗技術已經(jīng)相對成熟，并應用于多種病毒的檢測。 研究顯示在病毒感染后， 在抗體產生之前即可通過巢式PCR 檢測到精液等樣品中的BoHV-1。 當前已經(jīng)有研究利用巢式PCR 檢測牦牛樣本中BoHV-1 感染。隨著研究的深入， 巢式PCR 技術檢測BoHV-1核酸具有廣闊的應用前景。

3.3 熒光定量PCR 檢測技術

熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一種常用于通過對感染病原微生物基因或其mRNA 表達進行定量實驗室檢測技術，通過設計帶有熒光標記的探針對PCR 產物進行特異性標記，可以實時監(jiān)控PCR 反應過程，隨著目的片段的擴增，熒光信號逐漸增強，從而獲得循環(huán)閾值（CT）等相關數(shù)據(jù)，用于計算分析待檢基因的拷貝數(shù)等所需結果。國外已有多個實驗室已建立了利用熒光定量PCR 對BoHV-1 臨床樣品進行檢測的技術。

相較于血清學等檢測方法， 熒光定量PCR具有可再現(xiàn)性、 高特異性和高敏感性等優(yōu)點，縮短了檢測時間， 并實現(xiàn)了對基因進行定量的檢測。 研究表明熒光定量PCR 技術可以區(qū)分Bo-HV-1 與BoHV-5。 此外在基礎研究中也可以利用熒光定量PCR 檢測BoHV-1 基因表達變化情況。

3.4 其他PCR 相關檢測方法

除上述幾類常用的PCR 檢測方法外， 還有其他PCR 檢測技術被用于檢測BoHV-1 檢測及相關基礎研究。 例如多重聚合酶鏈式反應（Multiplex PCR Assay），可以通過實驗操作在同一的反應體系中使用多對引物，在檢測BoHV-1感染的同時分別檢測與BoHV-1 致病相關的多種其他牛病病毒，以實現(xiàn)對病畜感染情況進行快速定性檢測，目前這種方法經(jīng)已經(jīng)可以用于檢測并區(qū)分4 種與BoHV-1 相關的病毒。另外有研究表明PCR 檢測可以與southern 印跡雜交技術結合，具有更高的敏感性，可用于檢測精液等樣本中的BoHV-1 病毒。 這些PCR 技術為PCR 檢測BoHV-1 感染提供了更多選擇。

4 總結與展望

BoHV-1 作為一種以牛作為唯一自然宿主的病原體，病毒感染主要引起呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的疾病，并對病畜造成免疫抑制，影響病畜種群的經(jīng)濟效益。研發(fā)更加高效準確且適用于對大規(guī)模臨床樣品進行BoHV-1 檢測的產品， 將對BoHV-1 進行高效防控提供重要保障，而在諸多檢測技術中，PCR 技術是一個較好的選擇。

相較于其他常用的檢測方法 （如病毒分離鑒定、ELISA 檢測等），PCR 檢測靈敏度較高，對于待檢樣品的量需求較少， 檢測周期相對較短，檢測成本較低，可以應對數(shù)量較多、規(guī)模較大的檢測需求。 不同種類的PCR 技術也可以滿足不同條件下的檢測需求。 盡管如此，PCR 在檢測BoHV-1 感染方面仍有一些問題需要解決，例如PCR 檢測技術具有較高的靈敏度和準確性，但容易受到實驗環(huán)境和實驗過程操作等方面的干擾而導致實驗結果發(fā)生偏差，因此，進一步提高PCR 檢測效率、 準確性和提高實驗穩(wěn)定性才能進一步提高PCR 技術在BoHV-1 檢測方面的應用價值?？傊?，利用PCR 檢測BoHV-1 的技術正在不斷完善，隨著研究的推進，PCR 檢測技術可以為BoHV-1 病毒防治工作提供更加便捷高效的檢測方法。