◆作者：杭柏林 李雯琪 曹荔

◆單位：河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院

抗生素的負(fù)面作用日益嚴(yán)重，世界很多國(guó)家和地區(qū)逐漸禁止使用抗生素促生長(zhǎng)劑，中國(guó)于2020 年開(kāi)始禁止在飼料中添加任何抗生素。因此，抗生素替代品就受到了人們的廣泛關(guān)注。其中，噬菌體（bacteriophage，phage）是一種較好的抗生素替代品，有著廣闊的臨床應(yīng)用前景。噬菌體是感染、裂解細(xì)菌的病毒，在自然界中廣泛存在。根據(jù)裂解效應(yīng)的差異，可分為裂解性噬菌體（或稱烈性噬菌體、毒性噬菌體）和溶原性噬菌體（或稱溫和噬菌體）。裂解性噬菌體可直接裂解宿主細(xì)菌，導(dǎo)致其死亡。溶原性噬菌體大多數(shù)情況下會(huì)將其基因組整合到宿主菌的染色體上，并隨著宿主菌基因組的復(fù)制而復(fù)制，通常情況下并不裂解宿主菌。因此，臨床上常常使用裂解性噬菌體（下文中都簡(jiǎn)稱為噬菌體）來(lái)預(yù)防和治療細(xì)菌性感染。噬菌體對(duì)真核細(xì)胞沒(méi)有毒害作用，在“后抗生素時(shí)代”被認(rèn)為是具有較好前景的抗生素替代品（侯忠余等，2022）。雖然噬菌體治療方法在20 世紀(jì)初已出現(xiàn)，但現(xiàn)在的“復(fù)興”趨勢(shì)卻是由細(xì)菌耐藥危機(jī)驅(qū)動(dòng)而形成的。近年來(lái)，隨著細(xì)菌耐藥性的日益嚴(yán)重，噬菌體在對(duì)抗細(xì)菌感染方面的作用再次受到廣泛關(guān)注。目前，作為一種天然“抗菌藥物”，噬菌體在較多領(lǐng)域如養(yǎng)殖、食品、醫(yī)療等都有較好的應(yīng)用，被認(rèn)為是對(duì)抗致病菌的重要武器。本文主要就噬菌體的優(yōu)點(diǎn)、問(wèn)題與對(duì)策進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹，希望為噬菌體制劑的臨床應(yīng)用與開(kāi)發(fā)提供一些參考。

1 優(yōu)點(diǎn)

與抗生素相比，噬菌體具有很多優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)是噬菌體吸引人們研究與使用的“驅(qū)動(dòng)力”。

1.1 特異性強(qiáng)

噬菌體一般只殺滅對(duì)應(yīng)宿主細(xì)菌，通常不會(huì)跨越種或?qū)俚慕缦?。噬菌體能專一地引起宿主細(xì)胞的裂解而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，為致病菌的防控提供了一種新的手段（侯忠余等，2022）。這種特異性與細(xì)菌表面受體和噬菌體表面受體結(jié)合蛋白（反受體）的相互作用有關(guān)（Flayhan 等，2012）。雖然隨著噬菌體與宿主菌的相互作用以及研究的不斷深入，這種特異性或?qū)Ｒ恍詴?huì)逐漸被“打破”，但相對(duì)于抗生素、抗菌肽、中藥制劑等抗菌物質(zhì)而言，噬菌體的特異性還是很強(qiáng)的。

1.2 安全、無(wú)殘留

噬菌體對(duì)人和動(dòng)物沒(méi)有毒副作用，不會(huì)產(chǎn)生殘留（周艷等，2014；孫利廠等，2018），被認(rèn)為對(duì)人和動(dòng)物是安全的（Yen 等，2017；呂霖等，2019；Rehman s等，2019）。噬菌體進(jìn)入機(jī)體后，對(duì)機(jī)體和內(nèi)源性組織的正常運(yùn)轉(zhuǎn)沒(méi)有影響（聶若男等，2019）。當(dāng)宿主菌被全部裂解后，噬菌體也會(huì)被機(jī)體的免疫系統(tǒng)所清除（Kortrlght 等，2019；李虹嬌等，2021），即噬菌體隨宿主菌的消亡而消亡（曹振輝等，2012），從而表現(xiàn)出無(wú)殘留的特點(diǎn)。因此，某些國(guó)家和地區(qū)已經(jīng)批準(zhǔn)了某些噬菌體制劑在臨床上的應(yīng)用。例如，歐洲的某些國(guó)家已經(jīng)使用某些噬菌體制劑用來(lái)治療人類皮膚金黃色葡萄球菌感染（Zhang 等，2015），美國(guó)FDA 已經(jīng)批準(zhǔn)李斯特菌噬菌體制劑在芝士和禽產(chǎn)品上作消毒用（Fischetti 等，2005）。

1.3 對(duì)環(huán)境友好

因?yàn)槭删w具有特異性，只能裂解特定的細(xì)菌。所以，噬菌體對(duì)自然生物群落中的細(xì)菌沒(méi)有干擾作用（龍門等，2016），對(duì)環(huán)境中的固有微生物沒(méi)有破壞作用（曹振輝等，2012）。因此，噬菌體也被認(rèn)為是有效且安全的生態(tài)環(huán)境凈化用生物制劑（葛展霞等，2018）?；诖?，噬菌體的應(yīng)用范圍將進(jìn)一步得到拓寬。

1.4 可穿透生物被膜，對(duì)耐藥菌有效

耐藥菌對(duì)人和動(dòng)物相關(guān)疾病的治療與防控提出了挑戰(zhàn)。生物被膜是賦予細(xì)菌耐藥性的一個(gè)重要原因。而噬菌體可破壞細(xì)菌的生物被膜（Phee 等，2013）。噬菌體感染、裂解生物被膜外層的細(xì)菌，新形成的噬菌體穿透生物被膜進(jìn)入生物被膜內(nèi)層，繼續(xù)感染內(nèi)層的細(xì)菌，直至裂解完所有細(xì)菌（Khalifa 等，2016；楊羽等，2022）。噬菌體產(chǎn)生的解聚酶具有清除生物被膜的能力（Majkowska-Skmbek 等，2018）。噬菌體TSK1 處理培養(yǎng)的肺炎克雷伯菌后可使其生物被膜量降低85% ～100%（Tabassum 等 ，2018）。當(dāng)噬菌體DM33 感染后，銅綠假單胞菌就失去了形成生物被膜的能力（Zegans 等，2009）。噬菌體可以隨細(xì)菌的進(jìn)化而對(duì)自身進(jìn)行修飾，使其具有裂解耐藥菌的能力（李虹嬌等，2021）。噬菌體在解決耐藥菌感染方面具有很好的應(yīng)用前景（Rehman s 等，2019），被認(rèn)為是潛在的“超級(jí)細(xì)菌的有效克星”（葛展霞等，2018）。這個(gè)特點(diǎn)是目前人們研究與開(kāi)發(fā)噬菌體的主要“推動(dòng)力”。

1.5 生產(chǎn)與使用的成本低

生產(chǎn)噬菌體的成本比較低（李帥華等，2020）。制備噬菌體制劑所需的原材料均非常容易獲得。噬菌體以指數(shù)方式進(jìn)行增殖，劑量放大效應(yīng)明顯（曹振輝等，2012）。所以，應(yīng)用時(shí)劑量不會(huì)很高。同時(shí)，不需要反復(fù)多次給藥（吳立婷等，2022）。因此，使用成本也相應(yīng)地不會(huì)很高。

1.6 劑型與給藥途徑多樣化

可以將噬菌體制成不同的劑型，如清洗液、軟膏、粉末、敷料、面霜、霧化劑等（舒飛鴻等，2022）。噬菌體應(yīng)用有多種給藥途徑。注射給藥途徑包括肌肉注射、腹腔注射、靜脈注射、皮下注射；局部給藥途徑包括皮膚局部給藥、眼局部給藥、耳局部給藥、口腔局部給藥、鼻腔局部給藥或霧化吸入、尿路給藥、直腸給藥等（舒飛鴻等，2022）。口服給藥也是常見(jiàn)的給藥途徑，但要避免胃酸的影響。其他不常用途徑還包括浸浴、噴霧等。針對(duì)不同的感染部位以及局部感染或全身感染的差異，可選擇不同劑型的噬菌體制劑通過(guò)不同給藥途徑進(jìn)行應(yīng)用。這個(gè)特點(diǎn)非常有利于噬菌體的具體應(yīng)用。

1.7 不影響正常菌群

正常菌群對(duì)機(jī)體的健康具有重要作用。噬菌體不損害生物機(jī)體內(nèi)共存的微生物群落（聶若男等，2019；劉暢等，2022）。噬菌體具有很強(qiáng)的特異性，主要對(duì)其靶菌具有裂解作用，但對(duì)腸道內(nèi)的其他正常菌群沒(méi)有干擾作用（曹振輝等，2012；馬艷香等，2012）。這個(gè)特點(diǎn)也是噬菌體對(duì)人和動(dòng)物安全的另一個(gè)方面。

1.8 來(lái)源廣泛

噬菌體在自然界中的分布非常廣泛，有細(xì)菌的地方就會(huì)有噬菌體，含量也非常豐富（聶若男等，2019；Brussow 等，2022）。因此，自然界中的噬菌體被認(rèn)為是可以利用的豐富的抗菌資源庫(kù)（Wommack 等，2000）。以臨床上的目標(biāo)菌為“釣餌”，可以從多種環(huán)境中“釣”（分離）到相應(yīng)的噬菌體，且分離率較高。例如，從多種食物如碎牛肉、豬肉等肉制品、奶制品、生菜等中分離出許多針對(duì)沙門菌的噬菌體（聶若男等，2019）。

2 問(wèn)題

雖然噬菌體具有較多的優(yōu)點(diǎn)，但在實(shí)際應(yīng)用時(shí)也面臨一些問(wèn)題。

2.1 突變的耐受菌

噬菌體與細(xì)菌之間存在著“此消彼長(zhǎng)”的演化關(guān)系。在演化的過(guò)程中，細(xì)菌可能發(fā)生突變，通過(guò)阻止細(xì)菌吸附（Chen 等，2017）、流產(chǎn)感染（Hyman 等，2010）、CRISPR-Cas（Rostol 等，2019）等方式對(duì)原來(lái)有效的噬菌體產(chǎn)生耐受現(xiàn)象，從而使得原來(lái)有效的噬菌體變得無(wú)效。這是應(yīng)用噬菌體治療細(xì)菌感染時(shí)最常見(jiàn)的問(wèn)題（林焱等，2022）。雖然噬菌體也會(huì)產(chǎn)生新的突變來(lái)應(yīng)對(duì)耐受細(xì)菌，但需要重新篩選和評(píng)估，而這個(gè)工作相當(dāng)繁瑣的。

2.2 存在免疫原性

噬菌體有著相對(duì)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，具有較好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)人和動(dòng)物產(chǎn)生較好的體液免疫和細(xì)胞免疫。體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗體中存在有抗噬菌體作用的中和抗體，而這種中和抗體是影響噬菌體治療效果的重要因素之一（王冉等，2019）。

2.3 菌株和毒株的不同導(dǎo)致效果的差異

不同細(xì)菌和不同噬菌體因來(lái)源不同而有著不同的生物學(xué)特性。對(duì)于一株給定的噬菌體針對(duì)臨床中同一種細(xì)菌的不同菌株時(shí)，其感染能力和抑菌能力會(huì)存在差異（Mahmoud 等，2018；林焱等，2022），就可能會(huì)出現(xiàn)不同的結(jié)果。因此，寬噬菌譜的噬菌體在臨床應(yīng)用時(shí)會(huì)遇到不同的菌株，從而會(huì)表現(xiàn)出裂解效果的差異。同樣，針對(duì)同一株細(xì)菌的不同噬菌體毒株對(duì)宿主菌的感染能力和抑菌能力也存在著差異，也可能會(huì)出現(xiàn)不同的結(jié)果。

2.4 環(huán)境中存在滅活噬菌體的理化因素

應(yīng)用時(shí)噬菌體必須是活的。而具體應(yīng)用時(shí)，環(huán)境中存在著各種影響噬菌體存活的物理性和化學(xué)性因素，如溫度、紫外線、有機(jī)溶劑、酸堿度（pH）等對(duì)噬菌體的裂解效果有著不同程度的影響。噬菌體P65 在30～45 ℃時(shí)有較好的裂解活性，在70 ℃時(shí)基本失活，在pH 4～10 時(shí)裂解活性較穩(wěn)定，在pH 2 時(shí)基本失活，隨著紫外線照射時(shí)間延長(zhǎng)而裂解活性逐漸降低（侯忠余等，2022）。環(huán)境中可能存在著保護(hù)細(xì)菌的物質(zhì)或抗病毒物質(zhì)，如脂肪（GILL 等，2006）、乳清蛋白（O'FLAHERTY 等，2005）等，從而影響噬菌體的裂解效果（侯忠余等，2022）。只有能夠耐受體內(nèi)外環(huán)境的噬菌體才能走向應(yīng)用（肖小平等，2021）。

2.5 噬菌譜較窄

噬菌體的噬菌譜（或稱宿主譜）一般都較窄，從而表現(xiàn)出特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。然而，這也限制了噬菌體的應(yīng)用。雖然現(xiàn)在有一些研究報(bào)道稱分離到了對(duì)不同種屬細(xì)菌或?qū)δ撤N細(xì)菌的不同血清型菌株或不同種菌株具有裂解作用的噬菌體。例如，炭疽芽孢桿菌噬菌體AP631 還可以不完全裂解部分蠟樣芽孢桿菌（張慧娟等，2016）；噬菌體C6 對(duì)非致病性大腸桿菌（E.coli 22）和致病性大腸桿菌（包括大腸桿菌O157(E.coli W1)、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC W3、STEC W5)、腸致病性大腸桿菌（EPEC 143)）具有裂解作用（林焱等，2022）；噬菌體qbNJl4 對(duì)來(lái)自不同宿主且可致不同癥狀的14 株腸道內(nèi)大腸桿菌和13 株腸道外大腸桿菌具有裂解作用（姜珊等，2015）；某些噬菌體可跨屬感染細(xì)菌，如噬菌體L6jm 可感染豬霍亂沙門菌和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（張玉宇等，2020）；噬菌體LP8 可裂解產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌和威爾斯李氏桿菌（李天昊等，2022）。雖然可以通過(guò)將不同嗜菌譜的噬菌體制成噬菌體雞尾酒混合制劑來(lái)拓寬噬菌譜，但是，這個(gè)譜還不夠?qū)挕?/p>

2.6 可能存在的安全性問(wèn)題

某些噬菌體的基因組中可能含有耐藥基因、毒力因子基因和整合酶基因，從而導(dǎo)致耐藥因子的傳遞。因此，在篩選到一株噬菌體后應(yīng)進(jìn)行全基因組測(cè)序，仔細(xì)分析后判斷其安全性。在制備噬菌體制劑時(shí)，如果僅簡(jiǎn)單地通過(guò)過(guò)濾方法除去宿主菌，收集濾液進(jìn)行應(yīng)用，可能會(huì)因?yàn)榱呀夂笏拗骶募?xì)胞碎片、內(nèi)毒素、表達(dá)的毒力物質(zhì)、質(zhì)粒DNA 等導(dǎo)致對(duì)使用宿主的安全性問(wèn)題。因此，應(yīng)用時(shí)應(yīng)使用精制的純度高的噬菌體。某些噬菌體在應(yīng)用到人或動(dòng)物機(jī)體時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)輕微的或一過(guò)性的不適（舒飛鴻等，2022）。也許對(duì)于某些免疫力極低人員或極個(gè)別不同體質(zhì)的人或動(dòng)物可能是不適合使用噬菌體的。某些裂解性噬菌體可向溶原性噬菌體轉(zhuǎn)變，進(jìn)而會(huì)改變宿主菌的毒力和致病性。

3 對(duì)策

解決上述這些問(wèn)題，對(duì)加快噬菌體的開(kāi)發(fā)與臨床應(yīng)用具有重要意義。

3.1 混合、聯(lián)用，開(kāi)發(fā)噬菌體源物質(zhì)，應(yīng)對(duì)耐受菌

存在對(duì)噬菌體耐受的細(xì)菌是影響噬菌體應(yīng)用的一個(gè)重要因素。噬菌體雞尾酒制劑是幾種不同的噬菌體混合制成的制劑。當(dāng)耐受菌對(duì)其中的某種噬菌體產(chǎn)生耐受，但對(duì)另一種噬菌體不一定也產(chǎn)生耐受，從而可以延長(zhǎng)制劑的使用時(shí)間。噬菌體聯(lián)合抗生素進(jìn)行使用，可以降低噬菌體和抗生素的使用劑量，降低細(xì)菌對(duì)噬菌體和抗生素形成耐受性的概率。噬菌體復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的溶菌酶、解聚酶、內(nèi)溶素等對(duì)突變的耐受菌仍有較好的抗菌活性。噬菌體來(lái)源的內(nèi)溶素穩(wěn)定性高，細(xì)菌對(duì)其沒(méi)有耐受性，將可能成為替代噬菌體的新選擇（舒飛鴻等，2022）。

3.2 通過(guò)化學(xué)與基因工程方法，避開(kāi)免疫原性的影響

因免疫原性而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體可能加快噬菌體的清除，從而影響噬菌體的使用效果。選擇低免疫原性的噬菌體可以避免適應(yīng)性免疫應(yīng)答，或者通過(guò)化學(xué)修飾來(lái)降低噬菌體的免疫原性，延長(zhǎng)噬菌體在體內(nèi)的半衰期，或者將噬菌體進(jìn)行包被以規(guī)避中和抗體的作用，或者通過(guò)生物技術(shù)去除噬菌體上賦予免疫原性的蛋白，從而提高噬菌體的治療效果（王冉等，2019）。

3.3 因“株”設(shè)案，達(dá)其最大功效

噬菌體的毒株不同，使用效果會(huì)不同。在篩選噬菌體時(shí)，要將具體某株噬菌體的生物學(xué)特性充分了解清楚，然后根據(jù)這些特性設(shè)計(jì)具體的使用方案，才能達(dá)到相應(yīng)效果。

3.4 提高穩(wěn)定性，確保噬菌體活著

只有活的噬菌體才能發(fā)揮相應(yīng)的裂解功能。因此，要通過(guò)各種方法來(lái)確保噬菌體活著。通過(guò)多方篩選或通過(guò)基因工程方法改造以獲得高環(huán)境穩(wěn)定性的噬菌體，或者對(duì)噬菌體進(jìn)行包被技術(shù)處理如微囊化以提高噬菌體的存活率。

3.5 拓寬噬菌譜，擴(kuò)大應(yīng)用范圍

寬譜噬菌體具有重要的應(yīng)用價(jià)值（許方方等，2021）。如能像抗生素那樣具有較寬泛的抗菌譜，噬菌體將得到更廣泛的應(yīng)用。將針對(duì)不同菌的噬菌體表面的反受體通過(guò)基因工程方法展示在同一種噬菌體上，可擴(kuò)大噬菌體的嗜菌譜。在實(shí)驗(yàn)室條件下，將噬菌體A 與菌B 共培養(yǎng)使其發(fā)生共演化，篩選后獲得可裂解菌A 和菌B 的噬菌體AB，將噬菌體AB 再與菌C 共培養(yǎng)使其發(fā)生共演化，篩選后獲得可裂解菌A、菌B 和菌C 的噬菌體ABC，如此循環(huán)進(jìn)行“共演化-篩選”過(guò)程，將可能獲得寬嗜菌譜的噬菌體。

3.6 多點(diǎn)多面檢測(cè)噬菌體及其制劑，確保安全

噬菌體對(duì)人和動(dòng)物的安全性直接決定了其臨床應(yīng)用價(jià)值。在分析完噬菌體的溶原/裂解性能后，對(duì)裂解性噬菌體可先進(jìn)行全基因組測(cè)序，分析其攜帶毒力因子和耐藥基因等情況，再對(duì)安全的裂解性噬菌體進(jìn)行精制。可借鑒動(dòng)物病毒的純化方法來(lái)純化噬菌體（梁莉等，2010）。總之，在篩選可應(yīng)用的噬菌體時(shí)應(yīng)注意多方面的檢測(cè)與分析，最終選擇對(duì)人和動(dòng)物安全的噬菌體。

4 展望

噬菌體在細(xì)菌性疾病治療與預(yù)防領(lǐng)域的應(yīng)用潛力巨大，值得深入開(kāi)發(fā)與研究。雖然已經(jīng)有部分噬菌體制劑在生產(chǎn)實(shí)踐中進(jìn)行應(yīng)用，但是還有許多工作需要進(jìn)一步完善。（1）我國(guó)關(guān)于噬菌體產(chǎn)品生產(chǎn)和制造的標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)法規(guī)還相當(dāng)少，需建立完善的噬菌體應(yīng)用安全評(píng)價(jià)體系以保證噬菌體生產(chǎn)應(yīng)用中每個(gè)環(huán)節(jié)的安全性。（2）在國(guó)家層面上加大對(duì)噬菌體治療的基礎(chǔ)研究投入，建設(shè)全國(guó)性甚至世界性的噬菌體庫(kù)，并進(jìn)行資源共享，提升噬菌體治療的價(jià)值。（3）“噬菌體+X（抗生素、抗菌肽、中藥制劑、疫苗、微生態(tài)制劑、后生元等）”的聯(lián)合使用可以拓寬噬菌體的應(yīng)用范圍，是值得深入開(kāi)發(fā)研究的方向。（4）利用噬菌體展示技術(shù)開(kāi)發(fā)新型噬菌體，以提高穩(wěn)定性或和拓寬嗜菌譜。（5）革蘭陰性的宿主菌被裂解后釋放的內(nèi)毒素可能對(duì)人和動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生負(fù)面作用，如何規(guī)避這一問(wèn)題，同時(shí)確保噬菌體的裂解活性，目前還需深入研究。

參考文獻(xiàn)：（略）