文聲昕 吳 強 韓亞坤 郭珊珊 唐 奕 柯 璐 何仁亮

國際疼痛研究協(xié)會將神經(jīng)病理性疼痛(neurpathic pain,NP)定義為由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的病變或疾病引起的疼痛。其常見病因有糖尿病神經(jīng)病變、脊髓損傷、病毒感染(帶狀皰疹后神經(jīng)痛)和化療等,常見癥狀為異常疼痛、痛覺過敏、自發(fā)性疼痛和感覺異常等,這些癥狀使患者出現(xiàn)睡眠障礙、焦慮,甚至抑郁。目前治療NP包括藥物干預(抗驚厥藥和阿片類藥物)、物理治療和局部神經(jīng)阻滯,但效果有限和不良反應增多。由于NP的發(fā)病機制尚未得到充分闡明,臨床治療效果有限,故探索NP發(fā)生的分子機制具有重要意義。在傷害性感受系統(tǒng)中,表觀遺傳修飾被認為調(diào)控分子的長期變化,在組織損傷相關疼痛的發(fā)展和維持中起著關鍵作用[1]。Waddington在1942年提出表觀遺傳這一概念,它指的是不改變DNA序列調(diào)節(jié)基因表達,并在環(huán)境刺激時對基因轉(zhuǎn)錄或翻譯過程的調(diào)控,使個體產(chǎn)生長期的影響。表觀遺傳修飾有RNA修飾、非編碼RNA、DNA甲基化和組蛋白修飾,這些修飾方式直接或間接地影響基因表達。本文將對目前NP表觀遺傳學作用機制研究進展進行綜述,以期為該疾病的診療提供潛在靶點。

一、RNA修飾

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)是表觀遺傳學中RNA甲基化的一個新興領域,包括以METTL3、METTL14、WTAP和KIA1429為代表的寫入蛋白介導甲基化過程,以FTO和ALKBH5為代表的擦除蛋白介導去甲基化過程,以及YTH和HNRNP為代表的閱讀蛋白介導甲基化識別和mRNA翻譯過程[2]。m6A修飾可被不同的m6A結(jié)合蛋白YTH結(jié)合,從而調(diào)節(jié)RNA的轉(zhuǎn)錄、剪接、輸出、翻譯和降解來影響各種生理和病理過程。近年來證據(jù)表明,m6A修飾調(diào)控基因可能參與了NP的發(fā)展和維持[3～6]。

在完全弗氏佐劑(complete Freund′s adjuvant, CFA)誘導的小鼠炎性疼痛模型中,METTL3介導的m6A修飾通過調(diào)節(jié)pri-miR-365-3p加工來調(diào)節(jié)疼痛敏化[2]。Pan等[3]選擇性下調(diào)脊髓中METTL3,這提高了脊髓中10～11易位甲基胞嘧啶雙加氧酶1(ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1, TET1)mRNA和m6A的水平,從而產(chǎn)生疼痛超敏反應。相比之下,過表達METTL3逆轉(zhuǎn)m6A的缺失,阻斷CFA誘導脊髓中TET1的增加,可導致疼痛減弱;同時YTHDF2水平降低,脊髓TET1穩(wěn)定上調(diào),這揭示下調(diào)脊髓METTL3與YTHDF2協(xié)調(diào)的新機制,即穩(wěn)定脊髓神經(jīng)元中TET1的上調(diào),有助于調(diào)節(jié)炎性疼痛。Zhang等[4]建立保留神經(jīng)損傷(spinal nerve injury, SNI)大鼠疼痛模型,通過分析METTL3和m6A甲基化表達水平,發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)大鼠比較,NP大鼠中METTL3和m6A甲基化顯著下調(diào)。

進一步研究發(fā)現(xiàn),METTL3通過介導pri-miR-150在基因498處的m6A甲基化,與YTHDF2結(jié)合加速了miR-150的成熟。而miR-150可直接靶向腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)mRNA,最終建立METTL3/miR-150/BDNF調(diào)控通路。結(jié)合臨床帶狀皰疹患者血清標本,證明METTL3在帶狀皰疹患者中也下調(diào)。

m6A去甲基化酶FTO在周圍神經(jīng)損傷背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)中產(chǎn)生Runx1而上調(diào),通過消除Ehmt2 mRNA、穩(wěn)定Ehmt2 mRNA/G9a表達和沉默受損DRG中μ阿片受體(mu-opioid receptor, MOR)表達,引起神經(jīng)損傷疼痛超敏反應。鑒于FTO抑制劑甲氯芬那酸為非甾體抗炎藥,阻斷FTO可能在神經(jīng)性疼痛管理中具有潛在的臨床應用[5]。在脊神經(jīng)結(jié)扎(spinal nerve ligation, SNL)模型中,脊髓神經(jīng)元中基質(zhì)金屬蛋白酶24(matrix metalloproteinase24,MMP24)表達上調(diào)。甲基化RNA免疫沉淀測序和RNA免疫沉淀測定表明,m6A減少神經(jīng)性疼痛條件下MMP24 mRNA的富集。此外,FTO與脊髓神經(jīng)元中的MMP24共定位,并在SNL后與脊髓中MMP24 mRNA結(jié)合增加[6]?？傊?在各種疼痛模型中,RNA m6A修飾介導了痛覺敏化的多種調(diào)節(jié)機制。這些研究不僅揭示了神經(jīng)性疼痛背后的表觀遺傳學機制,而且還為治療提供了新思路。

二、非編碼RNA

人類基因組中僅2%由蛋白質(zhì)編碼基因組成,其余約98%是非編碼基因。非編碼RNA(noncoding RNA,ncRNA)是一組不編碼功能蛋白的RNA,具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯和穩(wěn)定性的特點。ncRNA主要包括microRNA(miRNA)、長ncRNA(lncRNA)、環(huán)狀RNA(circRNA)和小核仁RNA(snoRNA)。許多研究發(fā)現(xiàn),miRNA、lncRNA和circRNA與NP的病理過程有關[7～10]。

miRNA與靶mRNA結(jié)合或直接與蛋白質(zhì)相互作用來負調(diào)控基因表達。miRNA主要通過與非翻譯區(qū)(3′UTR)結(jié)合來控制基因的表達,導致mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯。在NP誘發(fā)的疼痛基因中,80%受miR-183家族的調(diào)控。此外,miR-18a、miR-19a、miR-19b和miR-92a簇成員的過表達可引起機械性異位痛,而阻斷這些miRNA可減少神經(jīng)損傷引起的機械性異位痛。miR-17-92簇主要通過下調(diào)DRG中的多個KV通道來引起疼痛[7]。lncRNA linc00311在NP大鼠脊髓中表達顯著上調(diào),降低其可抑制STAT3活化而下調(diào)免疫炎性細胞因子及(Ca2+)i水平,從而降低疼痛閾值[11]。Du等[8]鑒定了一種保守的lncRNA,命名為神經(jīng)損傷特異性lncRNA(NIS-lncRNA)。

DRG中ELF1是一種與NIS-lncRNA啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,能誘發(fā)NIS-lncRNA上調(diào),從而促進受損的DRG神經(jīng)元中Fus觸發(fā)CCL-2基因表達,有助于神經(jīng)損傷誘導的傷害性超敏反應的發(fā)展和維持。由此可見,NIS-lncRNA可能是NP的內(nèi)源性引發(fā)劑,可為NP的診療提供潛在靶點。另外,神經(jīng)損傷誘導背根神經(jīng)節(jié)特異性富集的長鏈非編碼RNA(DS-lncRNA)的下調(diào)促進了轉(zhuǎn)錄輔因子RALY與RNA聚合酶Ⅱ(RNP Ⅱ)和Ehmt2基因啟動子的結(jié)合,增加Ehmt2 mRNA和G9a蛋白的表達,下調(diào)包括Oprm1 mRNA和MOR在內(nèi)的許多疼痛相關基因,并引起神經(jīng)性疼痛[9]。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組比較,SNL大鼠3、7、10、14天后脊髓中circAnks1a的表達明顯上調(diào)。

SNL大鼠的疼痛行為可以通過siRNA下調(diào)circAnks1a來緩解,其機制是通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子B的表達以降低SNL大鼠脊髓的興奮性來緩解NP。Cao等[12]使用患有帶狀皰疹后神經(jīng)痛(post herpetic neuralgia, PHN)患者的皮膚來研究PHN中miRNA的表達,發(fā)現(xiàn)PHN患者皮膚中的miR-4506、hsa-miR-1258和hsa-miR-330-5p上調(diào)超過5倍。綜上所述,ncRNA的發(fā)現(xiàn)為NP的診斷和治療帶來了新的前景,關于作用機制需進一步研究。

三、DNA甲基化

DNA甲基化通過多種機制抑制基因轉(zhuǎn)錄。甲基-cpg結(jié)合域(methylated DNA binding domain, MBD)蛋白家族作為轉(zhuǎn)錄抑制因子或輔助抑制因子的對接位點,在胞嘧啶的第5碳上添加一個甲基,產(chǎn)生5-甲基胱氨酸(5mC),這一過程由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1 (DNA methyltransferase 1, DNMT1)、DNMT3a和DNMT3b催化,它們建立并維持了基因組甲基化模式。而5-甲基胞嘧啶(5mC)轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)是由TET介導,促進DNA去甲基化[13]。哺乳動物基因組中,70%～80%的CpG被甲基化,作為一種更穩(wěn)定的表觀遺傳修飾,其可以沉默或下調(diào)啟動子或增強子,這種不同的基因表達調(diào)節(jié)可影響疼痛和鎮(zhèn)痛。

1.DNMT觸發(fā)DNA甲基化沉默基因表達:周圍神經(jīng)損傷通過激活受損DRG感覺神經(jīng)元中的轉(zhuǎn)錄因子CREB來上調(diào)DNMT1的表達。這種上調(diào)與Kcna2啟動子和5′-非翻譯區(qū)域內(nèi)某些CpG位點的DNA甲基化水平升高相關,而Kv1.2是NP發(fā)生的關鍵因素,DNMT1可能有助于NP的發(fā)展[14]。Zhao等[15]建立SNL和慢性壓迫性損傷(chronic compress injury, CCI)動物模型,證明通過激活轉(zhuǎn)錄因子OCT1能增加受損DRG神經(jīng)元中DNMT3a的表達,阻斷這種增加可阻止神經(jīng)損傷引起的Kcna2表達,從而減輕NP。相反,在沒有神經(jīng)損傷的情況下,模擬這種增加會降低Kcna2啟動子活性,降低Kv電流,增加DRG神經(jīng)元的興奮性并導致脊髓中樞敏化和神經(jīng)性疼痛癥狀,這表明DNMT3a可能通過抑制DRG中的Kcna2表達而導致NP。

Liu等[16]進一步研究DNMT3a介導的miR-214-3p表觀遺傳學抑制作用,發(fā)現(xiàn)其增強星形膠質(zhì)細胞中CSF1的產(chǎn)生,繼而在SNL模型大鼠中誘導了神經(jīng)炎癥和疼痛行為。此外,DNMT3b在SNL模型中下調(diào),引起GPR151基因啟動子的去甲基化,促進轉(zhuǎn)錄因子Krüppel樣因子5(Krüppel-like factor 5, KLF5)與G蛋白偶聯(lián)受體151(G-protein coupled receptor 151,GPR151)啟動子的結(jié)合,并進一步增加脊髓神經(jīng)元中GPR151的表達。增加的GPR151可能通過激活MAPK信號轉(zhuǎn)導和增加疼痛相關基因表達而促成NP的發(fā)生[17]。有研究表明,周圍神經(jīng)損傷通過DRG中DNA甲基化來下調(diào)MOR和Kv1.2的表達,從而誘發(fā)NP[13]。

2.DNA去甲基化TET1調(diào)控甲基化水平:DNA去甲基化TET1過表達通過調(diào)控MOR啟動子區(qū)域甲基化水平,增加MOR的表達,從而改善神經(jīng)損傷導致的痛覺過敏和嗎啡耐受[18]。值得一提的是,化療引起的神經(jīng)性疼痛是癌癥治療的常見劑量限制性不良反應,但其潛在機制在很大程度上是未知的。Deng等[19]構(gòu)建大鼠奧沙利鉑疼痛模型,使用全基因組表達微陣列和基因本體分析確定脊髓背角中序列特異性DNA結(jié)合蛋白HOXA6上調(diào)。其通過TET1介導的SOX10啟動子去甲基化導致NP。紫杉醇誘導的雙孔結(jié)構(gòu)域K+通道1.1 (K2p1.1)的下調(diào)是由DRG中啟動子DNA甲基化增加引發(fā)NP。損傷的DRG中TET1過表達可能通過挽救K2p1.1的表達來減輕化療引起的神經(jīng)性疼痛[20]。

5-氮雜胞苷是一種目前被許可用作化療的DNMT抑制劑,基于其降低MeCP2水平的功效,它也可用作鎮(zhèn)痛劑。然而,鎮(zhèn)痛效果只有在鞘內(nèi)給藥時才能達到,因此限制了其潛在的治療用途。另一方面,降低DNA甲基化會導致疼痛過敏,因為受影響的CpG位點(啟動子與內(nèi)含子區(qū)域)將對基因表達的變化產(chǎn)生不同的影響[21]。綜上所述,DNMT可能與基因啟動子結(jié)合,導致基因甲基化或去甲基化,從而加重或緩解NP,這將為NP的治療提供新的指導。給予基因特異性siRNA或慢病毒治療是未來的一種前瞻性治療選擇。

四、組蛋白修飾

組蛋白修飾是對核小體N-端組蛋白尾部的轉(zhuǎn)錄后修飾(post-transcriptional modifification, PTM),可調(diào)控染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。組蛋白乙?；饕l(fā)生在H3和H4 N-端保守的賴氨酸殘基上,由組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase, HAT)和組蛋白去乙?；?histone deacetylase, HDAC)催化進行。這種可逆的乙?；揎椬饔每墒谷旧|(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生動態(tài)改變,并對基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響[22, 23]。組蛋白甲基化是由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(histonemethyl transferase, HMT)完成的。甲基化可發(fā)生在組蛋白的賴氨酸和精氨酸殘基上,疼痛過程中不同程度的組蛋白甲基化增加了組蛋白修飾和調(diào)節(jié)基因表達的復雜性[24, 25]。

1.組蛋白乙?；瘜ν从X敏化發(fā)揮重要調(diào)節(jié)機制:在紫杉醇引起的NP模型中,脊髓背角中活化T細胞的核因子(NFATc2)可直接上調(diào)CXCL14的表達,這是通過NFATc2和p300之間相互作用增加了CXCL14啟動子區(qū)域中組蛋白H4的乙?；?。此外,敲除脊髓背角的CXCL14顯著減弱了紫杉醇誘導的NP[22]。組蛋白H3賴氨酸9乙?；?H3K9ac)可激活星形膠質(zhì)細胞中降鈣素基因相關肽(calcitonin-gene-related peptide, CGRP),神經(jīng)損傷后表達H3K9ac的星形膠質(zhì)細胞數(shù)量增加。抑制CGRP可減輕NP的發(fā)展,同時抑制CCI大鼠中H3K9ac、CX3CR1和IL-1β的表達[23]。另外在SNL模型中,CXCL13被激活引起疼痛,其機制是受損DRG神經(jīng)元中鋅指蛋白382(ZNF382)的下調(diào),這破壞了HDAC1和SET結(jié)構(gòu)域[26]。

組蛋白乙?；赏ㄟ^溴區(qū)結(jié)構(gòu)域和超末端結(jié)構(gòu)域(bromodomain and extra terminal domain, BET)蛋白募集,對小膠質(zhì)細胞介導的脊髓神經(jīng)炎癥的關鍵作用,結(jié)合HDAC和BET抑制劑靶向神經(jīng)性疼痛可能代表一種新的治療選擇[27]。Borgonetti等[28]研究SUM52和SUM35的新型雙重HDAC/BRD4抑制劑在小鼠SNI模型中的藥理學特征,結(jié)果顯示,作為多靶點藥物的單個分子同時調(diào)節(jié)BET和HDAC活性,可為NP緩解帶來希望。丙戊酸是一種組蛋白去乙?；敢种苿?可通過STAT1/NF-κB和JAK2/STAT3信號通路調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞功能并抑制脊髓神經(jīng)炎癥[29]。

2.組蛋白甲基化參與了痛覺敏化的形成:zeste同源物2(EZH2)增強子對H3賴氨酸27(H3K27me3)的三甲基化是一種表觀遺傳標記,可調(diào)節(jié)周圍神經(jīng)損傷后炎癥相關基因的表達[24]。精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(coac-tivator-associated arginine methyltransferase 1, CARM1)是組蛋白精氨酸甲基化的表觀遺傳調(diào)節(jié)因子,鞘內(nèi)注射BC-1215(一種新型Fbxo3抑制劑)可阻止CARM1泛素化,從而阻斷K+通道基因沉默并改善神經(jīng)損傷后的異常性疼痛[25]。另外,G9a(由Ehmt2編碼)是組蛋白3賴氨酸9甲基轉(zhuǎn)移酶,負責基因沉默的關鍵染色質(zhì)調(diào)節(jié)劑,G9a抑制劑(UNC0638)可用于增強阿片類藥物在治療慢性神經(jīng)性疼痛中的鎮(zhèn)痛作用。由此可見,組蛋白乙酰化與去乙?；?、甲基化與去甲基化通過不同的調(diào)節(jié)機制參與NP的發(fā)生,這些都將是NP治療和預防的重要研究對象。

目前,表觀遺傳修飾參與NP形成的分子機制尚不明確。然而,越來越多的證據(jù)表明,RNA修飾、DNA甲基化和組蛋白修飾通過調(diào)節(jié)神經(jīng)炎性反應、神經(jīng)膠質(zhì)細胞的激活、離子通道等在NP的發(fā)展中起到關鍵作用。目前的研究大都基于動物模型的探索,并且表觀遺傳修飾之間交叉仍然難以明確,研究人員需要在更高級動物模型中探索其他的表觀遺傳調(diào)控模式,可使用全基因組方法,例如染色質(zhì)免疫沉淀,然后進行深度測序(ChIP-seq),以繪制在神經(jīng)性疼痛的基因和非基因區(qū)域的范圍。隨著對NP的表觀遺傳修飾及其分子機制認識的不斷增加,NP的有效治療和預防前景更加廣闊。