廖宇寧 黃雨欣 廖林淇 陳苑君

改性C18色譜柱對(duì)三七總皂苷含量測(cè)定的影響

廖宇寧 黃雨欣 廖林淇 陳苑君

［廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司，廣西 梧州 543000］

改性C18色譜柱是在C18結(jié)構(gòu)中添加苯基后，大幅改變C18色譜柱對(duì)特定化合物的分離特性，文章通過(guò)三七總皂苷中人參皂苷Re的改變進(jìn)行分析說(shuō)明，將新構(gòu)建的改性C18色譜柱與標(biāo)準(zhǔn)C18運(yùn)行方法進(jìn)行了多樣品含量對(duì)比，并對(duì)重現(xiàn)性、標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性、加標(biāo)回收率進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示：該改性色譜柱大幅提升了人參皂苷Re分離度，并能縮短液相分析總時(shí)長(zhǎng)；使用150 mm長(zhǎng)度色譜柱就能夠獲得250 mm長(zhǎng)度色譜柱的理論塔板數(shù)，所測(cè)含量結(jié)果偏差＜2%。

C18；苯基；人參皂苷Re；分離度

引言

三七作為一種傳統(tǒng)藥材，有著悠久的應(yīng)用歷史，主要的功效是散瘀、止血、消腫、止痛和補(bǔ)虛。隨著現(xiàn)代醫(yī)藥理念的發(fā)展，人們研究三七中的有效成分，并將各成分根據(jù)所需功效進(jìn)行分離提純以獲得特定功效的提取物，用于各種適應(yīng)癥的治療與預(yù)防。該研究涉及成分分離以及含量測(cè)定，三七總皂苷為三七主要提取物，包含5種最主要的成分，分別是三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd。三七皂苷R1具有活血散淤、止血、消腫定痛的效果，并對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)和修復(fù)作用；人參皂苷Rg1具有抗炎活性，可用于預(yù)防關(guān)節(jié)炎，對(duì)心血管系統(tǒng)方面具有保護(hù)作用，及形成抗動(dòng)脈血栓促進(jìn)心肌血管再生，抗細(xì)胞凋亡延緩神經(jīng)干細(xì)胞衰老，并表現(xiàn)出抗癌特性，可抑制腫瘤細(xì)胞侵襲；人參皂苷Re具有舒張血管的作用，能促進(jìn)血液循環(huán)，可抗疲勞、抗氧化、抗高血脂，在保護(hù)心血管系統(tǒng)的同時(shí)，還可以保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在治療阿爾茨海默癥研究中還發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Re有降血糖、抗休克、抗血小板聚集等多種藥效作用；人參皂苷Rb1在心血管系統(tǒng)方面具有保護(hù)心肌、抑制心肌細(xì)胞凋亡、保護(hù)血管的作用，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面可以在腦缺血時(shí)提供保護(hù)作用，減少缺血對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)，對(duì)腦卒中有良好的治療效果，還能促進(jìn)記憶能力并增強(qiáng)認(rèn)知，同時(shí)還具有抗腫瘤、抗糖尿病等藥理特性；人參皂苷Rd具有能夠擴(kuò)張血管和保護(hù)腎臟功能，發(fā)揮抗腫瘤調(diào)節(jié)免疫的作用。

通過(guò)對(duì)5種主要成分的藥理作用進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)三七在心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都有著極為重要的藥用醫(yī)療價(jià)值，在具有相近藥理作用的同時(shí)，功效也有一些細(xì)微差別，隨著研究的深入將會(huì)發(fā)掘出更多功效和用法，勢(shì)必對(duì)各成分的提純分離和檢測(cè)有更高的要求。在現(xiàn)有《中華人民共和國(guó)藥典》中收錄的高效液相檢測(cè)條件[1]，對(duì)于三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd能夠?qū)崿F(xiàn)較好的分離，但是人參皂苷Rg1、人參皂苷Re的分離效果一直不理想，也是三七總皂苷液相含量檢測(cè)中分離的難點(diǎn)。盡管通過(guò)更換使用多種品牌的C18色譜柱，或者改變部分梯度變化來(lái)增加人參皂苷Rg1、人參皂苷Re的分離效果，但是收效相對(duì)有限。在研究一款改性C18色譜柱時(shí)，發(fā)現(xiàn)其三七總皂苷?qǐng)D譜中，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re的保留時(shí)間比常規(guī)C18色譜柱大幅度減少，說(shuō)明改性C18色譜柱對(duì)三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re這3個(gè)成分有選擇性，改性C18色譜柱可以獲得與常規(guī)C18色譜柱有明顯差異的三七總皂苷?qǐng)D譜，該差異可以用于提高分離效果和縮短分析時(shí)長(zhǎng)，本文將通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)來(lái)解析證明這個(gè)推斷[2-3]。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

所需的實(shí)驗(yàn)儀器有：萬(wàn)分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，AL204），超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司，Milli-Q IQ7000），2臺(tái)高效液相色譜儀（美國(guó)WATERS公司，Waters e2695及紫外檢測(cè)器2489），常規(guī)C18色譜柱Shim-pack GIS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），改性C18色譜柱ACE EXCEL5 C18-AR（4.6 mm×250 mm，5 μm），改性C18色譜柱ACE EXCEL3 C18-AR（4.6 mm×150 mm，3 μm）。

1.2 試劑

所需的試劑有：乙腈（德國(guó)默克公司，色譜純），甲醇（德國(guó)默克公司，色譜純），純化水（Millipore），三七總皂苷提取物試樣、三七總皂苷混合對(duì)照（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

1.3 對(duì)照品配制與方法驗(yàn)證用供試品配制

對(duì)照品：取約50 mg三七總皂苷混合對(duì)照，用萬(wàn)分之一天平精密稱定至20 mL容量瓶中，加甲醇至容量瓶一半震搖至全部溶解后，再加甲醇至刻度搖勻，配制成濃度為2.5 mg/mL的對(duì)照溶液。

含量對(duì)比供試品：取8個(gè)批次的三七總皂苷提取物試樣，用萬(wàn)分之一天平分別精密稱定約100 mg至25 mL容量瓶中，加甲醇至容量瓶一半震搖至全部溶解后，再加甲醇至刻度搖勻作為含量對(duì)比供試品。

重現(xiàn)性、加標(biāo)回收供試品：取1個(gè)批次的三七總皂苷提取物試樣，用萬(wàn)分之一天平精密稱取每份約70 mg共6份至25 mL容量瓶中，加甲醇至容量瓶一半震搖至全部溶解后，再加甲醇至刻度搖勻作為重現(xiàn)性供試品。用移液管分別從6個(gè)重現(xiàn)性供試品溶液中精密量取5 mL至6個(gè)10 mL容量瓶中，分別加入上述配制的2.5 mg/mL對(duì)照溶液至刻度，作為加標(biāo)回收供試品。

2 方法與結(jié)果

2.1 常規(guī)C18色譜柱藥典方法下三七總皂苷?qǐng)D譜

使用常規(guī)C18色譜柱Shim-pack GIS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）按《中華人民共和國(guó)藥典》三七總皂苷含量測(cè)定項(xiàng)下要求分析。圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 常規(guī)C18藥典方法三七總皂苷?qǐng)D譜

由圖1可知，參皂苷Rg1、人參皂苷Re的保留時(shí)間非常接近，分離度僅為1.6。雖滿足基本性能要求，但是與極限要求1.5非常接近，若要增加分離效果，分析方法需要進(jìn)行調(diào)整。

2.2 常規(guī)C18色譜柱與改性C18色譜柱的對(duì)比

將藥典方法作適當(dāng)調(diào)整，將流速降為1.0 mL/min，并改動(dòng)部分梯度時(shí)間，延長(zhǎng)比例分析時(shí)長(zhǎng)，能更清楚地展現(xiàn)兩種柱子的差異性。分析使用Shim-pack GIS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）與改性C18柱ACE EXCEL5 C18-AR（4.6 mm×250 mm，5 μm）進(jìn)樣對(duì)比色譜圖。圖譜見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 常規(guī)C18三七總皂苷?qǐng)D譜

圖3 改性 C18三七總皂苷?qǐng)D譜

由圖2可知，調(diào)整方法后人參皂苷Rg1、人參皂苷Re保留時(shí)間明顯增加，分離度增加至2.5。通過(guò)圖3可以發(fā)現(xiàn)，前3個(gè)成分保留時(shí)間有明顯差異，證實(shí)改性C18色譜柱對(duì)三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re 3個(gè)成分有不同于常規(guī)C18的選擇性，圖3中3個(gè)成分保留時(shí)間大幅減少，但人參皂苷Rg1、人參皂苷Re分離度仍達(dá)到2.6，大于常規(guī)C18色譜柱所得的分離度（2.5）。改性C18色譜柱使用非最優(yōu)分析方法就能得到優(yōu)于常規(guī)C18色譜柱的分離效果，由此可以說(shuō)明改性C18色譜柱在人參皂苷Rg1、人參皂苷Re分離上有著優(yōu)異的效果。

2.3 優(yōu)化分析方法后改性C18色譜柱性能

由圖4可知，分析總時(shí)長(zhǎng)小幅縮減，但是人參皂苷Rg1、人參皂苷Re分離效果顯著，分離度達(dá)到3.8（見(jiàn)表1），對(duì)于藥典方法的分離度1.6，使用改性C18色譜柱在合適的分析方法下，可大幅度提高參皂苷Rg1與人參皂苷Re的分離度。

圖4 優(yōu)化分析方法后改性C18分析三七總皂苷?qǐng)D譜

表1 優(yōu)化分析方法后改性C18分析三七總皂苷?qǐng)D譜數(shù)據(jù)

2.4 根據(jù)改性C18色譜柱性能壓縮分析時(shí)長(zhǎng)

由圖4可知，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re分離度雖大幅提升，可分析時(shí)間依舊過(guò)長(zhǎng)，改性C18色譜柱的分離效果即便縮短柱長(zhǎng)亦能得到比常規(guī)C18長(zhǎng)柱更好的分析柱效。柱長(zhǎng)減短可以明顯縮短分析時(shí)長(zhǎng)，但是會(huì)損失部分分離度與理論塔板數(shù)。為了彌補(bǔ)這個(gè)缺失，縮短柱長(zhǎng)同時(shí)減小粒徑，粒徑的減小可以把損失的部分分離度與理論塔板數(shù)補(bǔ)回，讓短柱擁有和原來(lái)長(zhǎng)柱相近的性能，壓力會(huì)有所提高，但只要控制在可接受范圍內(nèi)即可，因此選用ACE EXCEL3 C18 AR（4.6 mm×150 mm，3 μm）。

由圖5所示，3 μm改性C18短柱分析時(shí)長(zhǎng)壓縮至50 min，與長(zhǎng)柱分析時(shí)長(zhǎng)90 min相比，用時(shí)縮減44.4%，對(duì)比兩個(gè)圖譜數(shù)據(jù)（結(jié)果見(jiàn)表1、表2），分析柱長(zhǎng)縮短使人參皂苷Re分離度由3.8下降到3.3，降幅為13.2%，理論塔板數(shù)由14 245提升至16 671，增幅為17.0%，符合分析預(yù)期。分析運(yùn)行壓力最高為3 300 psi約22.7 MPa，依據(jù)WATERS e2695耐壓上限5 000 psi是在液相承受范圍內(nèi)。對(duì)比藥典方法，此方法使人參皂苷Re分離度翻倍提升，分析時(shí)長(zhǎng)縮短，并且保留相關(guān)性能指標(biāo)。

圖5 3 μm改性C18短柱分析三七總皂苷?qǐng)D譜

表2 3 μm改性C18短柱分析三七總皂苷?qǐng)D譜數(shù)據(jù)

注：空白表示無(wú)數(shù)據(jù)。

2.5 3 μm改性C18短柱方法學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.5.1 常規(guī)C18長(zhǎng)柱與3 μm改性C18短柱的多批數(shù)據(jù)比對(duì)

使用色譜柱Shim-pack GIS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、ACE EXCEL3 C18 AR（4.6 mm×150 mm，3 μm），分別取對(duì)照溶液與8批供試品溶液各10 μL分別注入2臺(tái)高效液相色譜同時(shí)進(jìn)行分析，記錄峰面積數(shù)據(jù)，分別計(jì)算5種成分含量與總含量并計(jì)算相對(duì)平均偏差。結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

由表3、表4數(shù)據(jù)可以看出，常規(guī)C18長(zhǎng)柱與3 μm改性C18短柱，在分析同一供試品的含量時(shí)結(jié)果偏差較小，除三七皂苷R1偏差稍大外，其余4種成分和總含量相對(duì)偏差均在1%左右，考慮設(shè)備間存在的偏差，樣品的實(shí)際偏差會(huì)更小。

表3 兩款色譜柱8批供試品數(shù)據(jù)比對(duì) 單位：%

表4 8批供試品各成分及總含量相對(duì)平均偏差 單位：%

2.5.2 3 μm改性C18短柱三七總皂苷各成分線性

取對(duì)照溶液2、4、6、8、10 μL注入高效液相色譜考察線性關(guān)系，三七總皂苷各成分呈良好線性關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 3 μm改性C18短柱三七總皂苷各成分線性

2.5.3 3 μm改性C18短柱的重現(xiàn)性

取6份重現(xiàn)性供試品各10 μL，注入高效液相色譜記錄峰面積，計(jì)算5種成分含量與總含量，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，6份供試品各成分及總含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在0.5%左右，擁有良好的重現(xiàn)性。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 3 μm改性C18短柱重現(xiàn)性數(shù)據(jù)表 單位：%

2.5.4 3 μm改性C18短柱加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取6份加標(biāo)供試品各10 μL，注入高效液相色譜，記錄峰面積，計(jì)算5種成分含量與總含量，6份加標(biāo)回收供試品回收率均在95%以上。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 3 μm改性C18短柱加標(biāo)回收數(shù)據(jù)表 單位：%

2.5.5 3 μm改性C18短柱與常規(guī)C18長(zhǎng)柱系統(tǒng)適應(yīng)性比對(duì)

《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)三七總皂苷的要求為人參皂苷Rg1理論塔板數(shù)大于6 000，所有峰分離度大于1.5，分別使用對(duì)照品連續(xù)5針的系統(tǒng)適應(yīng)性良好。5針圖譜重疊圖見(jiàn)圖6、圖7。數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表8、表9。

圖6 常規(guī)C18長(zhǎng)柱《中華人民共和國(guó)藥典》方法5針系統(tǒng)適應(yīng)性圖譜

圖7 3 μm改性C18短柱5針系統(tǒng)適應(yīng)性圖譜

表8 常規(guī)C18長(zhǎng)柱《中華人民共和國(guó)藥典》方法5針系統(tǒng)適應(yīng)性數(shù)據(jù)

注：空白表示無(wú)數(shù)據(jù)。

表9 3 μm改性C18短柱5針系統(tǒng)適應(yīng)性數(shù)據(jù)

注：空白表示無(wú)數(shù)據(jù)。

3 討論

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)證明，改性C18色譜柱中的苯基結(jié)構(gòu)對(duì)三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re這3種成分有明顯的選擇性，突破常規(guī)C18色譜柱的性能局限，對(duì)部分化合物的分析產(chǎn)生較大的影響，為保留時(shí)間接近分離困難的化合物提供一個(gè)新的選擇。在三七總皂苷分析中，改性C18色譜柱可大幅提高人參皂苷Rg1與人參皂苷Re的分離度，實(shí)現(xiàn)更好的分離效果。在分析方法優(yōu)化得當(dāng)?shù)那闆r下，人參皂苷Re分離度可實(shí)現(xiàn)超過(guò)100%的躍升。根據(jù)實(shí)際的需求還可以對(duì)色譜柱長(zhǎng)度和填料粒徑進(jìn)行調(diào)整，從而在分析效率與效果之間尋求滿意的平衡點(diǎn)。該研究?jī)H測(cè)試了分析三七總皂苷時(shí)所產(chǎn)生的變化，并利用該變化得到了常規(guī)C18色譜柱所不能達(dá)到的分析效果，這類改性C18色譜柱是一個(gè)很好的研究方向，在常規(guī)C18色譜柱結(jié)構(gòu)中添加其他基團(tuán)后，獲得部分其他類型柱的特性，從而突破原有的一些局限，為化合物的分析優(yōu)化提供更多可能。

4 結(jié)束語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用改性賦予的特性，使原本分離困難的物質(zhì)達(dá)到更好的分離效果，理論上可用于所有含人參皂苷Rg1、人參皂苷Re的藥材，以及提取物含量的測(cè)定和提純制備，且無(wú)需過(guò)多成本，既經(jīng)濟(jì)又實(shí)用。將來(lái)會(huì)有更多類型的改性C18色譜柱出現(xiàn)，隨著類型的增加，不同的特性將給C18色譜柱賦予更多的能力，為分離困難化合物的分析帶來(lái)更多新的發(fā)現(xiàn)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典: 一部（2020年版）[M]. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020.

[2] 潘俊杰，鄭琴，楊明. 三七中三七總皂苷的提取、分離純化及分析方法的研究進(jìn)展[J]. 世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2007(6): 77-82，87.

[3] 周迎春，趙懷清，梁寧，等. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定三七總皂苷中人參皂苷Rg1、Re、Rb1與三七皂苷R1含量[J]. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003(1): 27-31.

Effect of Modified C18 Chromatographic Column on the Determination of Content in Panax Notoginseng

The modified C18 chromatography column significantly changes the separation characteristics of specific compounds by adding benzene to the C18 structure. This article analyzes and explains the changes in ginsenoside Re in the total saponins of Panax notoginseng, compares the newly constructed modified C18 chromatography column with the standard C18 operating method for multiple sample content, and studies the reproducibility, stability of the standard curve, and recovery rate. The results showed that the modified chromatographic column significantly improved the separation of ginsenoside Re and shortened the total liquid phase analysis time. By using a 150mm length chromatographic column, the theoretical number of plates for a 250mm length chromatographic column can be obtained, and the deviation of the measured content results is less than 2%.

C18; phenyl; ginsenoside Re; resolution

P284

A

1008-1151(2023)11-0053-05

2023-03-28

廖宇寧（1983－），男，廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司工程師，從事精密儀器分析工作。

陳苑君（1986－），女，廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司工程師，從事質(zhì)量控制管理工作。