馮金曉，衣夢(mèng)琦

（青島工學(xué)院食品工程學(xué)院，山東青島 266300）

金黃色葡萄球菌是一種常見的食源性致病微生物，可造成許多部位的嚴(yán)重感染，如偽膜性腸炎、心包炎、骨髓炎和敗血癥等[1-2]。野菊花素有“廣譜抗生素”之稱，作為抗菌藥物或功能性食品具有很高的安全性[3]，在軟飲料、醫(yī)藥、臨床等領(lǐng)域具有較為廣闊的應(yīng)用前景[4-5]。試驗(yàn)以水為溶劑提取菊花中的抑菌物質(zhì)，并測(cè)定其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性，以抑菌圈大小為指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化其提取工藝，以期提高提取物的抑菌活性，拓寬菊花的綜合利用途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

干菊花，購(gòu)自膠州市醫(yī)保城；金黃色葡萄球菌，青島工學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

YXQ-LS-50SII 型立式壓力蒸汽滅菌鍋、RE-301 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SW-CJ-1F 型單人雙面超凈工作臺(tái)、DNP-9052 型電熱恒溫培養(yǎng)箱、GM-B2002 型電子天平等。

1.3 試驗(yàn)流程

①干菊花→粉碎→浸泡→熬煮→水浴→抽濾→蒸發(fā)濃縮→水提液；

②金黃色葡萄球菌→活化→制備菌懸液；

③制備培養(yǎng)基→制備藥敏紙片→滅菌→傾倒培養(yǎng)基→傾倒菌懸液→平板涂布→放置藥敏紙片→倒置培養(yǎng)。

1.4 操作要點(diǎn)

（1） 浸泡及熬煮。稱取5 g 菊花粉，按比例加入一定量的純凈水浸泡1 h，加熱煮沸。

（2） 水浴及抽濾。將煮沸后的原料移入恒溫水浴鍋中，水浴一定時(shí)間，進(jìn)行抽濾，得濾液。

（3） 蒸發(fā)濃縮。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將濾液蒸發(fā)濃縮至1 g/mL 的菊花水提液。

（4） 制備菌懸液。將金黃色葡萄球菌在Baird-Parker 培養(yǎng)基的斜面上進(jìn)行活化，向斜面中加入一定量的生理鹽水，輕輕晃動(dòng)，倒入三角瓶中，制成菌懸液備用。

（5） 抑菌試驗(yàn)。將試驗(yàn)所需的培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、藥敏紙片等置于121 ℃下高溫滅菌20 min 備用。將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待凝固后，吸取菌懸液0.2 mL于培養(yǎng)皿中，涂布均勻。用鑷子夾取2 片浸泡菊花水提液的藥敏紙片，1 片浸泡無菌水的藥敏紙片，呈三角形放置在平板中，把放好藥敏紙片的平板做好標(biāo)記，倒置培養(yǎng)48 h。

1.5 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)各因素及水平如下：

（1） 提取料液比分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40， 1∶50；

（2） 提取溫度分別為60，70，80，90，100 ℃；

（3） 提取時(shí)間分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h。

1.6 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對(duì)菊花提取物抑菌活性的影響

料液比對(duì)菊花提取物抑菌活性的影響見圖1。

圖1 料液比對(duì)菊花提取物抑菌活性的影響

由圖1 可知，料液比對(duì)菊花提取物的抑菌活性存在一定的影響，增加料液比，有利于菊花中的抑菌成分被提取出來，提高了菊花提取物的抑菌作用。當(dāng)料液比為1∶10 時(shí)，菊花中的抑菌成分不能被充分提取出來，從而導(dǎo)致菊花提取物的抑菌效果不好；當(dāng)料液比大于1∶10 時(shí)，菊花提取物的抑菌效果隨料液比的增加而逐漸增加；當(dāng)料液比為1∶40 時(shí)，菊花提取物的抗菌效果最優(yōu)，說明此時(shí)菊花中的抗菌物質(zhì)提取得較充分，其抑菌作用最強(qiáng)；當(dāng)料液比大于1∶40 時(shí)，菊花提取物的抗菌效果隨著料液比的增大而逐漸降低。因此，當(dāng)料液比為1∶40 時(shí)抑菌效果最好。

2.2 提取溫度對(duì)菊花提取物抑菌活性的影響

提取溫度對(duì)菊花提取物抑菌活性的影響見圖2。

圖2 提取溫度對(duì)菊花提取物抑菌活性的影響

由圖2 可知，提取溫度過高或過低都會(huì)影響菊花提取物的抑菌活性。在設(shè)置的溫度梯度內(nèi)，隨著溫度的升高，菊花中的抑菌成分能夠被較充分地提取出來，菊花提取物的抑菌作用逐漸增大。當(dāng)提取溫度達(dá)到90 ℃，菊花提取物的抑菌作用達(dá)到最強(qiáng)，抑菌圈直徑為0.89 cm。但隨著提取溫度的持續(xù)上升，菊花提取物的抑菌作用不再加強(qiáng)，反而可能會(huì)由于過高的溫度對(duì)抑菌成分的活性造成破壞，導(dǎo)致抑菌活性下降。因此，選擇提取溫度90 ℃為最佳。

2.3 提取時(shí)間對(duì)菊花提取物抑菌活性的影響

提取時(shí)間對(duì)菊花提取物抑菌活性的影響見圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)菊花提取物抑菌活性的影響

由圖3 可知，提取時(shí)間對(duì)菊花提取物的抗菌效果有一定影響。當(dāng)提取時(shí)間為1.0～1.5 h 時(shí)，菊花中的抑菌物質(zhì)隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷溶出，因此提取物抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用也隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增強(qiáng)；當(dāng)提取時(shí)間到達(dá)1.5 h 時(shí)，菊花提取物抑菌效果最好，此時(shí)抑菌圈直徑為0.82 cm；當(dāng)提取時(shí)間為1.5～3.0 h 時(shí)，菊花提取物的抗菌活性隨提取時(shí)間的不斷增加而減弱，原因可能是抗菌活性物質(zhì)受熱時(shí)間過長(zhǎng)造成活性的降低。因此，選擇提取時(shí)間1.5 h最為合適。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

正交試驗(yàn)結(jié)果分析見表2。

由表2 可知，影響菊花提取物抑菌活性的因素主次順序?yàn)镃＞A＞B，即提取時(shí)間＞料液比＞提取溫度。由正交試驗(yàn)結(jié)果分析確定的最優(yōu)組合為A2B3C2，即菊花提取物抑菌活性最佳的提取條件為料液比1∶40，提取溫度100 ℃，提取時(shí)間1.5 h。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，在此條件下菊花提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑為0.96 cm。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以純凈水作為提取溶劑，對(duì)菊花中的抑菌物質(zhì)進(jìn)行蒸煮提取，研究提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性。結(jié)果表明，菊花提取物對(duì)金黃色葡萄球菌存在一定的抑制作用，并且影響菊花提取物抑菌活性的影響因素順序?yàn)樘崛r(shí)間＞料液比＞提取溫度。根據(jù)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)分析得出結(jié)論，抑制金黃色葡萄球菌效果最強(qiáng)的菊花提取物的提取條件為料液比1∶40，提取溫度100 ℃，提取時(shí)間1.5 h。在最優(yōu)提取條件下，所得抑菌圈直徑為0.96 cm，此時(shí)菊花提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng)。