廖文彥,廖煉煉▲,莫巧明,艾文杰,鄒文靜,梁英業(yè),蘭蕾,秦祖杰,蒙曉明,張錦超,梁欣,唐林濤,田永強(qiáng)

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院,廣西南寧 530201;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西南寧 530023;3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院,廣西南寧 530001)

疼痛的發(fā)生十分廣泛,被稱為第五大生命體征,是一種在人體受到內(nèi)外因素?fù)p害時極易引發(fā)的不適感。國際疼痛研究協(xié)會(IASP)對神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain,NPP)的最新定義為：由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和疾病直接造成的疼痛[1]。NPP是一種常見的慢性疼痛類型[2],可由多種因素誘導(dǎo)發(fā)生,在中國[3]、美國[4]、歐洲[5]均有較高的發(fā)病率,不僅給患者軀體和心理兩方面造成痛苦,產(chǎn)生了昂貴的醫(yī)療費用,還給患者造成工作效率低下等消極影響,帶來了相當(dāng)?shù)慕?jīng)濟(jì)損失[6]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)常用的藥物療法僅能對NPP患者的部分癥狀具有一些緩解作用,且長期使用此類藥物可帶來不同程度的不良反應(yīng)[7]。尋求治療NPP的有效方法,解除患者身心痛苦,減輕社會醫(yī)療成本和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的需求極為迫切,也是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界研究的熱點。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)療法在疼痛的治療上有其獨特的優(yōu)勢,特別是外治療法受到了眾多學(xué)者的關(guān)注和研究[8-10],其中壯醫(yī)針刺療法對于疼痛治療的有效性和安全性在臨床上得到了廣泛認(rèn)可[11]。但對于壯醫(yī)針刺療法治療疼痛的相關(guān)作用機(jī)制研究目前仍屬空白。IKKβ是神經(jīng)病理性疼痛病理生理機(jī)制中重要的關(guān)鍵因子[12],該因子與NPP的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,其表達(dá)升高可引起下游炎癥因子在體內(nèi)含量增加,從而引起炎癥反應(yīng)刺激組織神經(jīng)末梢造成疼痛。有研究發(fā)現(xiàn)miR-429對IKKβ的表達(dá)具有下調(diào)作用[13]。本研究從上述機(jī)制切入,以動物實驗方法探索驗證壯醫(yī)針刺療法治療疼痛的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物實驗選取50只雄性成年SD大鼠(湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供),體重均為250～300 g,生產(chǎn)許可證編號：SCXK(湘)2019-0004,使用許可證編號：SYXK(桂)2019-0001。動物進(jìn)行7天適應(yīng)性喂養(yǎng)后開始實驗。實驗全過程嚴(yán)格按照廣西中醫(yī)藥大學(xué)相關(guān)規(guī)定及科學(xué)倫理規(guī)范進(jìn)行,廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會對實驗進(jìn)行審批及監(jiān)管。

1.2 主要試劑RIPA細(xì)胞裂解液(C1053,北京普利萊基因技術(shù)有限公司);BCA蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)(E-BC-K318-M,Elabscience);內(nèi)參一抗：Mouse Anti-β-Actin(HC201,TransGen Biotech,1/2000);二抗：HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L) (GB23301,Servicebio,1/2000);目的一抗：Rabbit Anti IKKβ (AF6009,Affinity,1/1000)。Trizon Reagent(CW0580S,CWBIO);超純RNA提取試劑盒(CW0581M,CWBIO);miRNA提取試劑盒(CW0627S,CWBIO);HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(R223-01,Vazyme);ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711-02,Vazyme);miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop)(MR101-02,Vazyme);miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix(MQ101-02,Vazyme);50×TAE緩沖液(T1060,Solarbio);6×DNA Loading Buffer(GH101-01,TRANS);50 bp DNA Ladder(MD108,TIANGEN);Gsafe Red plus核酸染料(GK20002,GLPBIO);瓊脂糖粉(75510-019,Invitrogen);ELISA檢測試劑盒(武漢伊萊瑞特,96T,E-EL-R0012)。

1.3 實驗儀器全自動樣品快速研磨儀(Tiss-12,上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司);高速臺式冷凍離心機(jī)(H1750R,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);微型離心機(jī)(D1008E,SCJLOGEX);旋渦混合器(XH-C,常州越新儀器制造有限公司);全自動酶標(biāo)儀(SuPerMax 3100,上海閃普);紫外分光光度儀(NP80,NanoPhotometer);電泳儀(DYY-8C,北京六一生物科技有限公司);普通PCR擴(kuò)增儀(TC-EA,杭州博日科技有限公司);熒光PCR儀(CFX ConnectTM實時,伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品〔上海〕有限公司);超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)儀(Chemi DocTM XRS+,伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品〔上?！秤邢薰?。

1.4 研究方法

1.4.1 動物分組將50只SD大鼠隨機(jī)分為5組：正常組、假手術(shù)組、模型組、非經(jīng)非穴組、壯醫(yī)針刺組,每組10只。

1.4.2 神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠制備按照相關(guān)文獻(xiàn)的方法[14],對大鼠L5脊神經(jīng)進(jìn)行手術(shù)結(jié)扎造模(SNL模型)。具體操作為：大鼠常規(guī)備皮消毒,以10%水合氯醛溶液按照4 mL/kg的給藥量腹腔注射麻醉。選取大鼠雙側(cè)髂后上棘水平連線與脊柱相交處左側(cè)部位,沿與脊柱平行方向縱行切開一約2 cm切口,將皮膚、筋膜、肌肉等逐層分離,并將切口撐開,使L5椎體橫突充分暴露,以咬骨鉗分離椎體與橫突之間的骨質(zhì),使L5脊神經(jīng)充分暴露,將該神經(jīng)以5-0規(guī)格粗細(xì)手術(shù)縫線做雙層結(jié)扎,以避免縫線脫落。完成結(jié)扎后縫合傷口。操作中應(yīng)避免牽拉脊神經(jīng)。模型組、非經(jīng)非穴組、壯醫(yī)針刺組以上述手術(shù)造模,假手術(shù)組則僅暴露脊神經(jīng)幾分鐘,不結(jié)扎,其他步驟同上。完成手術(shù)操作后,觀察大鼠是否出現(xiàn)術(shù)側(cè)后肢外翻,趾間距變窄、跛行、自發(fā)性抬足、不敢著地等情況,并檢測大鼠機(jī)械性刺激縮足閾值(PWMT)是否降低,以判斷SNL模型是否造模成功。

1.4.3 行為學(xué)觀察PWMT觀測[8]：測試之前先將大鼠放入鐵籠20 min適應(yīng)。使用不同粗細(xì)規(guī)格的von-Frey纖維絲接觸刺激大鼠左后足中央。纖維絲粗細(xì)代表不同刺激強(qiáng)度(g)。操作時刺激強(qiáng)度由小到大,每種強(qiáng)度下重復(fù)5次刺激,每次刺激之間間隔3 s。大鼠在同一刺激強(qiáng)度下出現(xiàn)縮足反應(yīng)≥3次則記錄為陽性,此強(qiáng)度為該大鼠的PWMT。本實驗重復(fù)操作3次,取3次實驗結(jié)果的平均值為大鼠最終PWMT。

1.4.4 干預(yù)方法造模完成后,正常組、假手術(shù)組和模型組不進(jìn)行干預(yù),僅觀察。壯醫(yī)針刺組：于造模完成后第1天開始,采用0.16 mm×13 mm針灸針進(jìn)行針刺干預(yù),針刺穴位包括手背一環(huán)10穴、內(nèi)上樁、內(nèi)中樁、內(nèi)下樁、足背一環(huán)7穴。針刺深度3 mm,斜刺進(jìn)針,留針30 min。穴位具體定位為：手背一環(huán)10穴定位,取大鼠前肢第五掌骨橈側(cè)距掌指關(guān)節(jié)3 mm處。內(nèi)上樁、內(nèi)中樁、內(nèi)下樁、足背一環(huán)7穴定位,在大鼠足背橫紋中點至第二、第三足趾跖蹼緣上方紋頭之間分4等份,以足背中間點為中心,以1等份為半徑沿足背形狀作一圓環(huán)。在足背圓環(huán)上按時鐘的1～12時刻分成12等份,每時刻處為1個穴位,共12個穴位。連續(xù)干預(yù)14天。非經(jīng)非穴組：于造模完成后第1天開始,每天針刺距離相應(yīng)穴位3 mm處假穴位點,留針30 min。連續(xù)干預(yù)14天。

1.4.5 動物組織取材干預(yù)結(jié)束并完成行為學(xué)觀測后,在實驗進(jìn)行的第14天,以水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,取靜脈血并無痛處死,取出大鼠L4～6脊髓背角組織,迅速放入液氮罐,待冷卻后保存于-80 ℃冰箱。

1.4.6 免疫印跡檢測采用免疫印跡法(Western Blot)測定大鼠L4～6節(jié)段脊髓背角組織中蛋白含量水平。將大鼠擊碎組織放入試管中,加入細(xì)胞裂解液,研磨勻漿后放入離心機(jī)離心,提取組織總蛋白,測定濃度。將標(biāo)本放入電泳儀電泳,隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,凝膠成像分析,測定出蛋白條帶及內(nèi)參蛋白條帶灰度值,計算出蛋白的表達(dá)水平。

1.4.7 ELISA檢測將大鼠靜脈血離心提取血清,放入酶標(biāo)儀按照ELISA檢測試劑盒說明書步驟檢測出血清表達(dá)水平。

1.4.8 PCR檢測將大鼠L4～6節(jié)段脊髓背角組織裂解勻漿后運(yùn)用熒光免疫PCR技術(shù)檢測其miR-429表達(dá)水平。按照試劑說明書操作步驟提取RNA,使用紫外分光光度計測定樣品濃度、純度。電泳后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),將PCR管插入普通PCR擴(kuò)增儀中,50 ℃條件下保持15 min,然后轉(zhuǎn)到85 ℃條件下保持5 s。采用(2-ΔΔct)法計算miR-429相對表達(dá)量,引物序列如表1。

表1 PCR檢測引物序列

2 結(jié) 果

2.1 PWMT檢測結(jié)果術(shù)前(第0天)各組大鼠之間的PWMT檢測結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);術(shù)后第1天模型組、非經(jīng)非穴組、壯醫(yī)針刺組PWMT檢測結(jié)果較正常組、假手術(shù)組降低(P<0.01),模型組、非經(jīng)非穴組、壯醫(yī)針刺組之間的PWMT檢測結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);術(shù)后第14天壯醫(yī)針刺組的PWMT檢測結(jié)果高于模型組和非經(jīng)非穴組(P<0.01)。見表2、圖1。

2.2 各組大鼠miR-429表達(dá)的變化造模后第14天,正常組大鼠脊髓背角組織中miR-429表達(dá)處于高水平,高于模型組、非經(jīng)非穴組、壯醫(yī)針刺組大鼠脊髓背角組織中miR-429表達(dá)水平(P<0.01),與模型組、非經(jīng)非穴組相比,壯醫(yī)針刺組干預(yù)miR-429表達(dá)水平上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 各組大鼠IKKβ表達(dá)的變化造模后第14天,正常組大鼠IKKβ蛋白表達(dá)處于低水平,與正常組相比,模型組脊髓背角組織IKKβ蛋白表達(dá)水平升高(P<0.01),與模型組、非經(jīng)非穴組相比,壯醫(yī)針刺組可下調(diào)大鼠脊髓背角組織IKKβ蛋白表達(dá)水平(P<0.01)。見圖3。

2.4 各組大鼠血清IL-1β含量的變化造模后第14天,正常組大鼠血清IL-1β含量處于低水平,與正常組、假手術(shù)組相比較,模型組血清IL-1β含量升高(P<0.01),與模型組、非經(jīng)非穴組相比較,壯醫(yī)針刺組可下調(diào)大鼠血清IL-1β含量(P<0.05)。見圖4。

表2 各組大鼠PWMT比較

圖1 各組大鼠術(shù)前(第0天)、術(shù)后第1天、術(shù)后第14天PWMT比較

注：與正常組及假手術(shù)組比較,*P<0.01,與壯醫(yī)針刺組比較,#P<0.05

注：與正常組、假手術(shù)組比較,*P<0.01;與模型組、非經(jīng)非穴組比較,#P<0.01

注：與正常組及假手術(shù)組比較,*P<0.01;與模型組及非經(jīng)非穴組比較,#P<0.05

3 討 論

壯醫(yī)學(xué)雖無神經(jīng)病理性疼痛之稱謂,但壯醫(yī)學(xué)理論對人體多種疼痛病癥均有論述[15]。通過對神經(jīng)病理性疼痛的病理生理機(jī)制進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)壯醫(yī)學(xué)“三道兩路”理論及“筋結(jié)”致痛學(xué)說可與之相契合[16]。在壯醫(yī)學(xué)理論中,“三道兩路”是指“水道”“谷道”“氣道”三道和“火路”“龍路”兩路。在人體生理狀態(tài)下,三道分別主司水液代謝、食物運(yùn)化、氣機(jī)循環(huán)職責(zé),而在兩路之中,龍路是指人體血液循環(huán)的系統(tǒng),火路則可與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中人體的神經(jīng)系統(tǒng)相對應(yīng)[17-18]。壯醫(yī)學(xué)中有“因結(jié)致痛”的說法,即三道兩路不通,氣血瘀堵結(jié)聚從而引起疼痛,涵蓋了對疼痛的基本病機(jī)和治療原則兩個方面的認(rèn)識,概括了在相關(guān)病理性因素的作用下,如機(jī)械性壓迫、勞損而造成的肌肉痙攣、損傷性炎癥等,導(dǎo)致局部組織受力不平衡,產(chǎn)生病理性損傷,在壯醫(yī)理論中認(rèn)為這是氣血堵塞于經(jīng)筋,凝結(jié)阻塞而造成疼痛[19-20]。氣與血在人體密不可分,兩者相互配合發(fā)揮生理功能。在壯醫(yī)理論中,龍路是血液流動循環(huán)的通道,氣推動血在龍路中運(yùn)行,火路是將人體接收內(nèi)外刺激傳入大腦(壯語稱為“巧塢”)并將相關(guān)反應(yīng)信號傳出的途徑,作用與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的神經(jīng)系統(tǒng)相類似。故基于壯醫(yī)學(xué)理論對神經(jīng)病理性疼痛的認(rèn)識大致可概括為：局部組織在各種病理因素的作用下,氣血結(jié)聚不通,造成龍路的血液循環(huán)異常,龍路的暢通受到影響或者相關(guān)病理性因子在龍路中積聚,同時因為龍路血液循環(huán)的異?；蛳嚓P(guān)病理性因子的刺激,對火路產(chǎn)生作用,產(chǎn)生相關(guān)疼痛信號并通過火路傳入大腦(“巧塢”),造成神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病。

本實驗選取的壯醫(yī)針刺穴位為手背一環(huán)10穴、內(nèi)上樁、內(nèi)中樁、內(nèi)下樁、足背一環(huán)7穴,體現(xiàn)了壯醫(yī)針刺療法所遵循的“天圓地方”的配穴理論指導(dǎo)原則[21]。該理論以取象比類的思維,將中國古代哲學(xué)思想中的“天圓地方”運(yùn)用到壯醫(yī)臨床實踐。在該理論看來,“天圓”意為如圓環(huán)一般機(jī)動、靈動,在配穴時著重使用環(huán)穴?！暗胤健眲t代表穩(wěn)固、平衡,即通過動態(tài)的調(diào)節(jié)以達(dá)到人體穩(wěn)固健康的平衡狀態(tài)。手背一環(huán)10穴位于手部,為天部環(huán)穴之一,由于手部運(yùn)動頻率高,且能完成人體最精巧復(fù)雜的動作,神經(jīng)末梢分布豐富且敏感,大腦中與手部對應(yīng)的皮層面積最大,故壯醫(yī)認(rèn)為手部與“巧塢”(大腦)的關(guān)聯(lián)緊密,通過刺激手部穴位,可將針刺的刺激迅速傳至大腦,調(diào)動人體形成良性反饋循環(huán),改善疼痛狀況。內(nèi)上樁、內(nèi)中樁、內(nèi)下樁又合稱“地內(nèi)三樁”,為地部穴,與天部上下對應(yīng),共同調(diào)整人體整體氣血狀況。足背一環(huán)7穴是足背環(huán)穴之一,該穴對于針刺刺激亦較為敏感,常用于治療腰腿痛,治療部位更偏于人體下部。上述諸穴合用可共奏通利人體氣血,疏通三道兩路之瘀阻以緩解疼痛之功。

白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)廣泛參與機(jī)體內(nèi)多種生理病理過程,是最重要的促炎因子之一,在炎癥發(fā)生的過程中,可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的釋放而產(chǎn)生或加重炎癥刺激。且IL-1β還可使多種疼痛介質(zhì)釋放增加,導(dǎo)致疼痛的程度加劇[22]。

IKKβ是NF-κB 經(jīng)典信號通路的重要因子,其活性環(huán)通過的絲氨酸磷酸化構(gòu)成NF-κB 信號通路啟動的必要因素。NF-κB通路廣泛參與多種免疫反應(yīng)、炎癥表達(dá)、細(xì)胞凋亡等生物進(jìn)程,是調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要通路[23]。

miRNA(微小RNA,microRNA)具有單鏈結(jié)構(gòu),不具有編碼蛋白質(zhì)的功能,核苷酸長度在18～25個之間,對基因調(diào)控具有重要作用。miRNA在生物體中作用廣泛,通過其介導(dǎo)的控制機(jī)制,可調(diào)控多種生理病理機(jī)制[24]。有研究表明[13],miR-429對IKKβ具有靶向調(diào)控作用,可下調(diào)IKKβ的表達(dá),從而抑制IKKβ對疾病的影響。

在本研究中,術(shù)后第1天,模型組大鼠PWMT較正常組降低,術(shù)后第14天,壯醫(yī)針刺組大鼠PWMT較模型組升高,表明實驗造模成功,壯醫(yī)針刺對SNL模型大鼠的疼痛具有改善作用。造模后第14天,模型組大鼠血清IL-1β含量較正常組升高,壯醫(yī)針刺組血清IL-1β較模型組降低,表明造模導(dǎo)致大鼠神經(jīng)損傷,炎癥因子釋放增加,激活炎癥反應(yīng)導(dǎo)致疼痛,經(jīng)壯醫(yī)針刺干預(yù)后炎癥因子含量減少,減輕了神經(jīng)所受到的炎癥刺激,使疼痛得以緩解。術(shù)后第14天,模型組大鼠脊髓背角組織IKKβ表達(dá)較正常組增多,壯醫(yī)針刺組大鼠脊髓背角IKKβ蛋白表達(dá)較模型組減少,表明SNL模型大鼠IKKβ蛋白表達(dá)升高,炎癥信號通路活躍,誘發(fā)炎癥反應(yīng)造成疼痛,而壯醫(yī)針刺干預(yù)可下調(diào)IKKβ蛋白表達(dá)水平,壯醫(yī)針刺可能通過抑制炎癥信號通路的活躍程度達(dá)到緩解疼痛的效果。術(shù)后第14天,模型組大鼠脊髓背角組織miR-429表達(dá)較正常組減少,壯醫(yī)針刺組大鼠脊髓背角組織miR-429蛋白表達(dá)較模型組增多,表明NPP發(fā)生時,miR-429表達(dá)減少,從而削弱了其對IKKβ/NF-κB炎癥通路的抑制作用,而壯醫(yī)針刺干預(yù)可上調(diào)miR-429表達(dá)水平,壯醫(yī)針刺可能通過增加miR-429的表達(dá)從而下調(diào)IKKβ以達(dá)到緩解疼痛的效果。

綜上我們推斷,壯醫(yī)針刺或可以通過上調(diào)miR-429表達(dá)而抑制IKKβ/NF-κB炎癥通路的活性,減少炎癥因子IL-1β的釋放,從而獲得緩解NPP所造成的疼痛的效果。