周安邦,徐媛媛,郭小英,周宇,代平平,農(nóng)絲潔,吳標(biāo)良

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,廣西百色 533000;2.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,廣西百色 533000)

糖尿病在中國的發(fā)病率非常高,共有1.164億人,2019年有420萬糖尿病患者因?yàn)槠洳l(fā)癥而死亡[1]。糖尿病可以引起多種并發(fā)癥,如腎衰竭、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變、糖尿病足(diabetic foot,DF)等。DF是糖尿病慢性創(chuàng)面常見的一種類型,患者會(huì)因治療或護(hù)理不當(dāng)最終導(dǎo)致截肢,并且愈合不良。美寶濕潤燒傷膏(moist exposed burn ointment, MEBO)在治療糖尿病慢性創(chuàng)面的臨床和基礎(chǔ)研究方面已經(jīng)得到證明,最近更是在細(xì)胞因子和信號(hào)通路方面取得一些成果[2]。成纖維細(xì)胞能促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù),并且可以分泌大量外泌體(exosomes)。外泌體參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、促進(jìn)血管形成等生物學(xué)活動(dòng)[3],現(xiàn)已顯示外泌體在細(xì)胞間通訊中起著至關(guān)重要的作用。目前根據(jù)研究表明,在創(chuàng)面修復(fù)過程中外泌體起著非常重要的作用。本研究通過觀察MEBO對(duì)高糖培養(yǎng)成纖維細(xì)胞分泌外泌體的影響,從而探討其對(duì)創(chuàng)面再生修復(fù)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)采用SPF級(jí)Wistar大鼠,由長沙天勤生物技術(shù)有限公司提供,公司的許可證號(hào)為SCXK(湘)2014-0011。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑與耗材胰蛋白酶：美國Gibco公司生產(chǎn);DMEM高糖培養(yǎng)液：美國Gibco公司生產(chǎn);PBS：北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn);南美胎牛血清：烏拉圭ExCELL公司生產(chǎn);外泌體提取試劑盒：美國SBI公司生產(chǎn);MEBO：汕頭市美寶制藥有限公司生產(chǎn);超速離心管：美國Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn);超濾管：美國MILLIPORE公司生產(chǎn);青鏈霉素混合液(100×)：北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同濃度MEBO培養(yǎng)液的制備根據(jù)課題組前期研究,將MEBO藥膏通過二甲基亞砜(DMSO)配置成1 g/L母液。然后將母液加入培養(yǎng)液配置成低(20 g/L)、中(40 g/L)、高(80 g/L)三個(gè)濃度。

1.2.2 大鼠成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及分組取剛出生的Wistar大鼠的表皮組織,于無菌超凈臺(tái)中取出,清洗血液、脂肪等殘留組織后,通過酶消化法分離出原代成纖維細(xì)胞,等到細(xì)胞長滿后,用胰蛋白酶消化傳代,此細(xì)胞為P1代,當(dāng)細(xì)胞傳代到P4時(shí),平均分為四組(每組3個(gè)樣本)：正常培養(yǎng)組(對(duì)照組)、MEBO低濃度組(20 g/L)、MEBO中濃度組(40 g/L)、MEBO高濃度組(80 g/L)。

1.2.3 收集上清并提取外泌體通過超速離心去除胎牛血清的外泌體配置培養(yǎng)基。P4代成纖維細(xì)胞貼壁后,等細(xì)胞達(dá)到視野的80%,更換為6 mL不同濃度(20 g/L、40 g/L、80 g/L)的MEBO培養(yǎng)液。培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞上清,然后用超濾管進(jìn)行濃縮,最后用SBI外泌體試劑盒提取沉淀后用PBS重懸。

1.2.4 BCA法檢測(cè)外泌體總蛋白濃度使用BCA試劑盒,在37 ℃孵育箱中靜置30 min。用酶標(biāo)儀在562 mm波長檢測(cè)各個(gè)孔的吸光值。檢測(cè)后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)量出各樣本外泌體蛋白濃度。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)外泌體標(biāo)記蛋白CD81、TSG101的表達(dá)裂解外泌體懸液得到蛋白并通過BCA檢測(cè)其蛋白濃度,制膠后進(jìn)行電泳,然后在甬道上樣。電泳后根據(jù)分子量大小選取凝膠帶進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后用5%BSA溶液室溫封閉1 h。用抗體稀釋液以1∶5000的比例配置CD81、TSG101溶液,4 ℃過夜孵育,再加入1∶5000的二抗孵育1 h。一抗、二抗孵育后均用TBST洗滌三次,每次10 min。CD81、TSG101一抗來源于兔,二抗為山羊抗兔。最后進(jìn)行顯影。

2 結(jié) 果

2.1 Western blotting檢測(cè)外泌體標(biāo)記蛋白CD81、TSG101的表達(dá)MEBO組和對(duì)照組均能表達(dá)外泌體標(biāo)記蛋白CD81、TSG101。見圖1。

2.2 MEBO對(duì)成纖維細(xì)胞分泌外泌體的影響MEBO各濃度組外泌體分泌量均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),MEBO低濃度組(20 g/L)與MEBO高濃度組(80 g/L)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。中濃度組分泌外泌體最多,與低濃度組、高濃度組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

A：對(duì)照組;B：MEBO低濃度組;C：MEBO中濃度組;D：MEBO高濃度組

表1 不同濃度MEBO對(duì)成纖維細(xì)胞分泌外泌體的影響

3 討 論

糖尿病是一種代謝紊亂疾病,已經(jīng)成為一種主要的全球衛(wèi)生流行病,在我國糖尿病的死亡率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)[4]。其中糖尿病慢性創(chuàng)面易造成預(yù)后不良和截肢,并且治愈后復(fù)發(fā)率也高達(dá)30%,因此提高糖尿病慢性創(chuàng)面的治療水平非常重要。但因?yàn)槠渲委熇щy,臨床上以預(yù)防為主治療為輔。治療前檢測(cè)潰瘍性質(zhì)來制訂合適方案,控制和降低血糖的同時(shí),通過改善血液循環(huán)、控制感染、徹底清創(chuàng)、高壓氧療等多學(xué)科協(xié)同治療來促進(jìn)創(chuàng)面愈合[5]。

成纖維細(xì)胞功能活動(dòng)旺盛,細(xì)胞質(zhì)嗜弱堿性,具有明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動(dòng),在創(chuàng)面修復(fù)過程中起到重要作用[6]。受損部位成纖維細(xì)胞可與新生毛細(xì)血管結(jié)合,形成肉芽組織[7]。研究表明,成纖維細(xì)胞在生長過程中通過分泌大量外泌體來傳遞生物學(xué)信息,調(diào)控細(xì)胞的生長[8]。

另外有研究結(jié)果表明,外泌體可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合[9]。在炎性期,過度的炎癥反應(yīng)會(huì)影響創(chuàng)面的愈合,甚至?xí)?dǎo)致多器官衰竭,慢性皮膚損傷中,巨噬細(xì)胞(macrophages,Mφs)積聚,促炎因子釋放增加[10],Mφs可分為M1型和M2型,M1型釋放各種促炎因子,M2型可以下調(diào)炎癥反應(yīng)[11],并且促進(jìn)創(chuàng)面愈合。目前研究發(fā)現(xiàn)外泌體可以促使M1型Mφs向M2型Mφs轉(zhuǎn)變[12],同時(shí)還能分泌多種細(xì)胞因子抑制淋巴細(xì)胞,從而減輕炎癥反應(yīng)。外泌體可以誘導(dǎo)血管的生成,外泌體中的miRNA-125a可以抑制血管生成抑制因子的表達(dá),這些在血管生成中發(fā)揮非常重要的作用,通過改善血液循環(huán)來促進(jìn)慢性創(chuàng)面的愈合。同樣研究表明,外泌體中許多效應(yīng)分子miRNA也參與到修復(fù)過程。微小 RNA(miRNA)作為內(nèi)源性調(diào)控性RNA,廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等病理生理過程。其中miR-21是人類癌癥和其他疾病中最頻繁上調(diào)的miR,其可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡和上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化。根據(jù)研究表明miR-21通過基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)和MMP-3的上調(diào)來促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增生[13],外泌體在瘢痕修復(fù)中也起到重要作用,可以抑制瘢痕膠原纖維的增生,通過醫(yī)療技術(shù)進(jìn)展甚至可以做到無瘢痕修復(fù)[14]。

最近20年來,在治療糖尿病慢性創(chuàng)面,皮膚再生醫(yī)療技術(shù)(MEBO/MEBT)已經(jīng)成為比較成熟的醫(yī)療技術(shù)。在本次實(shí)驗(yàn)中,通過MEBO干預(yù)成纖維細(xì)胞,收集上清液提取外泌體。Western blotting檢測(cè)到外泌體標(biāo)記蛋白TSG101、CD81在各組中均有表達(dá),初步證明提取的確實(shí)是外泌體懸液,而在BCA實(shí)驗(yàn)中,MEBO干預(yù)后的成纖維細(xì)胞分泌的外泌體含量增加,中濃度組和對(duì)照組相比有顯著差異。

本實(shí)驗(yàn)的研究表明,MEBO可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌外泌體,對(duì)慢性創(chuàng)面的愈合起到積極的作用,但MEBO促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌外泌體的機(jī)制尚未闡明,仍然需要進(jìn)一步的研究。