徐媛媛,周安邦,黃光京,陳思蓉,吳標(biāo)良

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,廣西百色 533000;2.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,廣西百色 533000)

糖尿病慢性創(chuàng)面是由長(zhǎng)期糖脂代謝紊亂等全身因素及創(chuàng)面周圍神經(jīng)病變、血管病變和感染等局部因素共同導(dǎo)致的難治性創(chuàng)面[1-2]。近來(lái),研究者們發(fā)現(xiàn)血管新生過(guò)程受阻導(dǎo)致中斷會(huì)使糖尿病慢性創(chuàng)面血液供應(yīng)不足,嚴(yán)重影響創(chuàng)面機(jī)化進(jìn)程,最終致使糖尿病慢性創(chuàng)面難以愈合[3],miR-126a-3p曾被稱為miR-126-3p或miRNA-126,作為特異性內(nèi)皮功能生物標(biāo)志物,能動(dòng)員造血干細(xì)胞并促進(jìn)血管新生[4-6]。諸多研究證實(shí),皮膚原位再生醫(yī)療技術(shù)(moist exposed burn therapy/moist exposed burn ointment,MEBT/MEBO)可調(diào)控炎癥與免疫因子的分泌,加快成纖維細(xì)胞和新生毛細(xì)血管的增殖,抑制瘢痕組織的形成,在臨床治療糖尿病慢性創(chuàng)面中取得了良好療效[7-9]。然而,基于miR-126a-3p調(diào)控研究MEBT/MEBO促進(jìn)創(chuàng)面愈合機(jī)制十分罕見(jiàn),因此,筆者從miR-126a-3p角度進(jìn)一步探討 MEBT/MEBO 促進(jìn)糖尿病慢性創(chuàng)面愈合的分子機(jī)制,為 MEBT/MEBO 的臨床推廣提供更豐富的理論鋪墊。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器濕潤(rùn)燒傷膏(MEBO,汕頭市美寶制藥有限公司);鏈脲佐菌素 (Streptozotocin,STZ)(北京索萊寶科技有限公司);三氯乙醛水合物(上海麥克林生化科技股份有限公司);miR-126a-3p、U6引物(廣州復(fù)能基因有限公司);光學(xué)顯微鏡[尼康儀器(上海)有限公司];微量紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)[天根生化科技(北京)有限公司];伯樂(lè)T100 PCR儀(美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad公司);羅氏LightCycler96 1.0系統(tǒng)(德國(guó)羅氏診斷有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物將72 只7周齡,體重240～280 g,SPF級(jí)Wistar雄性大鼠作為受試對(duì)象。該動(dòng)物購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)：SCXK[湘]2019-0014)并喂養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,環(huán)境清潔,溫度23～25 ℃,喂養(yǎng)普通飼料,飲用清潔水源,隔天更換墊料。該實(shí)驗(yàn)方案已獲得右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：2018051501)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型構(gòu)建適應(yīng)飼養(yǎng)1 周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn),隨機(jī)將所有在養(yǎng)的大鼠分配到對(duì)照組、模型組及MEBO組,每組24只。其中,模型組和MEBO組大鼠參照董方等人[10]實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠建模方法,禁食16小時(shí)后腹腔注射 STZ 45 mg/kg,3天后觀察大鼠一般情況并測(cè)量空腹血糖,出現(xiàn)多飲、多食、多尿等典型糖尿病癥狀并且血糖大于16.7 mmol/L則表明糖尿病模型構(gòu)建成功。此時(shí)參照趙京禹等[11]全層皮膚缺損法構(gòu)建大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型。將大鼠腹腔注射5%三氯乙醛水合物7 mL/kg麻醉,用印章在右側(cè)背部印出直徑為20 mm的圓形標(biāo)記,并沿標(biāo)記用無(wú)菌剪刀剪除其全層皮膚,建成糖尿病大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型。對(duì)照組大鼠正常進(jìn)食飲水,腹腔注射5%三氯乙醛水合物7 mL/kg麻醉,用印章在右側(cè)背部印出直徑為20 mm的圓形標(biāo)記,并沿標(biāo)記用無(wú)菌剪刀剪除其全層皮膚,建成急性創(chuàng)面模型。

1.3.2 創(chuàng)面處理及血糖控制創(chuàng)面造模構(gòu)建后立即給大鼠換藥,早晚各1次;選用濃度為 0.02%呋喃西林抑菌溶液給各組大鼠清創(chuàng);MEBO組大鼠依次覆蓋 2 層MEBO紗布(0.2 g/cm2)及2層無(wú)菌干紗布并包扎固定;模型組和對(duì)照組覆蓋2層生理鹽水紗布及2層無(wú)菌干紗布并包扎固定。糖尿病大鼠若血糖值大于33.3 mmol/L則予以長(zhǎng)效胰島素皮下注射,每天2次,每次2～4 IU/kg,將血糖控制在16.0 mmol/L左右。

1.3.3 動(dòng)物及創(chuàng)面肉眼觀每天觀察且記錄所有在養(yǎng)大鼠一般情況及創(chuàng)面愈合情況。造模首次給藥后,分別于治療后第1天、第11天和第18天,隨機(jī)在每組中抽取8只大鼠,固定后將刻度尺放置于大鼠創(chuàng)面邊緣,并且用相機(jī)拍攝創(chuàng)面,將采集的圖像上傳至Image J軟件并測(cè)量創(chuàng)面面積,利用公式計(jì)算創(chuàng)面愈合率。愈合率=(初始面積-未愈面積)/初始面積×100%。

1.3.4 創(chuàng)面組織標(biāo)本采集及處理分別于治療后第1天、第11天和第18天,每組隨機(jī)選取8只大鼠,按上述方式麻醉大鼠后,距創(chuàng)緣 0.5 cm 處采集造模區(qū)整個(gè)創(chuàng)面及周圍組織,而后將大鼠過(guò)量麻醉處死。將采集到的組織樣品分為2份,一份放入無(wú)酶凍存管中并標(biāo)記,迅速置于液態(tài)氮?dú)庵兴賰?后保存到-80 ℃冰箱。另一份放入包埋盒中并標(biāo)記,迅速浸泡于4%多聚甲醛固定液中。

1.3.5 創(chuàng)面組織病理學(xué)檢測(cè)及血管計(jì)數(shù)將各組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠組織標(biāo)本固定18小時(shí),再經(jīng)梯度脫水、透明、浸蠟,并包埋制成蠟塊備用。依次切片、烤片、脫蠟、水化后進(jìn)行HE(hematoxylin and eosin)染色;鏡下觀察大鼠創(chuàng)面組織的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞形態(tài)數(shù)量及毛細(xì)血管分布并行血管計(jì)數(shù)。

1.3.6 創(chuàng)面組織miR-126a-3p表達(dá)水平檢測(cè)取第18天的模型組及MEBO組凍存標(biāo)本置于經(jīng)滅菌及冷卻的研缽內(nèi),邊研磨邊加液氮,研成粉末狀為止,然后轉(zhuǎn)移至液氮冷卻的EP管中暫存,按照 Trizol法提取總RNA,并取1 μL滴加到紫外分光光度計(jì)樣品孔測(cè)定其濃度及純度,將濃度大于500 ng/μL,A260/280比值在1.9～2.0內(nèi)且A260/230比值大于2.0 的總RNA作為逆轉(zhuǎn)錄模板,按照All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit 2.0(廣州復(fù)能基因有限公司,QP115)說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后以cDNA為模板進(jìn)行qPCR。最終通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算miR-126a-3p相對(duì)于U6表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物一般情況及創(chuàng)面肉眼觀察結(jié)果成模后,對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)尚佳,進(jìn)食飲水、大小便及活動(dòng)均無(wú)異常;模型組及MEBO組大鼠全身狀態(tài)均欠佳,兩組大鼠均萎靡不振,嗜睡,多飲,多食,多尿,活動(dòng)少,消瘦,毛發(fā)干枯凌亂無(wú)光澤。治療后第 1 天,各組大鼠創(chuàng)面感染癥狀均不嚴(yán)重,但均晦暗,淤血,有少許出血、滲液及水腫,無(wú)新鮮肉芽腫生長(zhǎng)。第 11 天,對(duì)照組大鼠創(chuàng)面紅潤(rùn)潔凈,大片狀鮮紅肉芽組織生成;模型組大鼠創(chuàng)面仍嚴(yán)重血肉模糊,污穢潮濕,肉芽組織幾乎不可見(jiàn)。MEBO組大鼠創(chuàng)面較模型組清潔干燥,輕度水腫,少許粉紅色肉芽顆粒形成。第 18 天,對(duì)照組大鼠創(chuàng)面已經(jīng)愈合,且有毛發(fā)生長(zhǎng),毛發(fā)下可見(jiàn)條狀瘢痕形成;模型組大鼠創(chuàng)面見(jiàn)少許粉紅色肉芽顆粒形成。MEBO組大鼠創(chuàng)面見(jiàn)成片鮮紅色新生肉芽組織。見(jiàn)圖1。

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)3組大鼠創(chuàng)面愈合率對(duì)比治療后第11天及第18天,各組創(chuàng)面愈合率從大到小排列均是對(duì)照組、MEBO組、模型組,多重比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)。并且,治療后第18天各組大鼠創(chuàng)面愈合率均高于第 11 天,對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)。見(jiàn)表1。

2.3 病理形態(tài)學(xué)結(jié)果及新生毛細(xì)血管數(shù)量治療后第 1 天,光鏡下可見(jiàn)各組創(chuàng)面均出現(xiàn)鱗狀上皮帶狀壞死,大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),主要是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),血管結(jié)構(gòu)不完整,出血嚴(yán)重。治療后第 11 天,鏡下見(jiàn)對(duì)照組創(chuàng)面壞死組織被溶解吸收,炎癥細(xì)胞消退,上皮細(xì)胞增生,大量新生毛細(xì)血管形成,成纖維細(xì)胞增生,形態(tài)不規(guī)則且排列不整齊;模型組創(chuàng)面仍有較多壞死組織,炎細(xì)胞浸潤(rùn)及出血均未明顯減輕;MEBO 組創(chuàng)面炎癥浸潤(rùn)較模型組輕,散在新生毛細(xì)血管及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。治療后第18天,對(duì)照組創(chuàng)面再生出上皮組織,毛細(xì)血管管腔閉鎖,大量膠原纖維蛋白整齊排列于創(chuàng)面底部。模型組創(chuàng)面炎癥浸潤(rùn)較前減輕,散在新生毛細(xì)血管及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng);MEBO 組創(chuàng)面壞死組織基本被吸收,炎癥細(xì)胞消退,上皮細(xì)胞增生,較多新生毛細(xì)血管形成,形態(tài)不規(guī)則成纖維細(xì)胞增生(圖2)。治療后第18天模型組和MEBO組毛細(xì)血管數(shù)量相對(duì)于治療后第1天均明顯增加(P<0.001),但MEBO組毛細(xì)血管數(shù)量增加比模型組更明顯(P<0.001)。見(jiàn)表2。

2.4 創(chuàng)面組織miR-126a-3p表達(dá)水平治療后第 18 天,模型組和MEBO 組大鼠創(chuàng)面均有相當(dāng)數(shù)量新生毛細(xì)血管生成,取第18天模型組及MEBO組凍存大鼠創(chuàng)面組織標(biāo)本行qPCR實(shí)驗(yàn),檢測(cè)創(chuàng)面組織中miR-126a-3p的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明,與模型組相比,MEBO組創(chuàng)面組織中miR-126a-3p表達(dá)量顯著增加(P<0.001)。見(jiàn)圖3。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)3組大鼠創(chuàng)面愈合情況對(duì)比圖

表1 不同時(shí)間點(diǎn)3組大鼠創(chuàng)面愈合率對(duì)比

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)3組大鼠創(chuàng)面組織HE染色圖(Bar=50 μm)

表2 不同時(shí)間點(diǎn)模型組和MEBO組大鼠毛細(xì)血管數(shù)量對(duì)比

注：***表示P<0.001

3 討 論

血管新生在創(chuàng)面的及時(shí)有效修復(fù)中扮演著十分關(guān)鍵的角色,新生的血管網(wǎng)形成,可給創(chuàng)面運(yùn)送豐富的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)[12]。目前研究發(fā)現(xiàn),miR-126a-3p參與調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的血管再生和動(dòng)員,是內(nèi)皮細(xì)胞的功能和血管穩(wěn)態(tài)的特異性生物標(biāo)志物[4-6]。MEBO為 MEBT/MEBO的主要治療藥物,其通過(guò)調(diào)控創(chuàng)面炎癥及免疫因子分泌,細(xì)胞增殖,新生血管形成及抑制瘢痕增生從而促進(jìn)創(chuàng)面的無(wú)瘢痕修復(fù),并在糖尿病足等多種慢性潰瘍的臨床治療中取得一定療效[13-14]。本研究試圖通過(guò)肉眼觀察大鼠創(chuàng)面大體病變,HE染色鏡下了解創(chuàng)面組織病理形態(tài)及對(duì)新生毛細(xì)血管計(jì)數(shù),qPCR檢測(cè)組織miR-126a-3p表達(dá)量,進(jìn)一步探討MEBT/MEBO 促進(jìn)糖尿病慢性創(chuàng)面血管新生的分子機(jī)制。

miRNA(microRNA,微小RNA)是一種內(nèi)源性長(zhǎng)度為22～25 nt的小RNA分子[15],它能夠通過(guò)RISC復(fù)合體及其他RNA結(jié)合蛋白來(lái)調(diào)節(jié)mRNA的功能[16]。miRNA最常見(jiàn)的結(jié)合位點(diǎn)是靶向mRNA的3’-UTR。miRNA的表達(dá)失衡將會(huì)加快或者延緩血管新生進(jìn)而影響糖尿病慢性潰瘍愈合[17]。例如,在糖尿病小鼠創(chuàng)面模型中,分別抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-受體2 mRNA的miR15b 和miR200b均異常上調(diào),抑制血管生成并延緩了糖尿病創(chuàng)面愈合。相反,抗miR15b和抗miR200b治療改善了創(chuàng)面血管組織生長(zhǎng)狀況,加快了修復(fù)過(guò)程[18]。miR-126a-3p被歸類為血管相關(guān)miRNA,能夠特異性靶向萌芽相關(guān)蛋白1(sprouty-related protein1,SPRED-1)及3-磷酸激酶調(diào)節(jié)蛋白2(phosphatidylinositol-3-kinase regulatory subunit 2,PIK3R2)[19]。研究發(fā)現(xiàn),miR-126a-3p 缺乏可導(dǎo)致血管破裂出血,提示miR-126a-3p在維持血管內(nèi)皮功能穩(wěn)定、血管壁完整、血管新生及創(chuàng)面愈合中發(fā)揮重要作用,被認(rèn)為是一種高度特異性促血管新生標(biāo)志物[20];miR-126a-3p 還能調(diào)控 PIK3R2/PI3K/AKT 通路,促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)及血管形成[21]。王琳[22]研究揭示,MEBT/MEBO可通過(guò)上調(diào)糖尿病足潰瘍患者血清外泌體中miR-126a-3p的表達(dá)量,促進(jìn)創(chuàng)面新生血管形成,改善糖尿病足潰瘍創(chuàng)面的愈合質(zhì)量。由此可見(jiàn),miR-126a-3p 可能是個(gè)非常有潛力的糖尿病慢性創(chuàng)面治療靶點(diǎn)。

在本研究中,比較治療后第11和第18天的創(chuàng)面愈合率,發(fā)現(xiàn)對(duì)照組大鼠愈合速度明顯快于模型組和MEBO組,而MEBO組大鼠愈合速度又明顯快于模型組。此外,HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠創(chuàng)面愈合質(zhì)量明顯優(yōu)于MEBO組和模型組,而MEBO組大鼠愈合質(zhì)量又明顯優(yōu)于模型組。治療后第11天,對(duì)照組大鼠創(chuàng)面炎癥細(xì)胞大幅消退,大量新生毛細(xì)血管形成,成纖維細(xì)胞及膠原纖維蛋白也開(kāi)始增加,并在第18天完全再生出皮膚組織,而MEBO 組大鼠創(chuàng)面炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)仍然嚴(yán)重,且只有少量毛細(xì)血管萌芽及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng),而模型組的則更少。治療18天后MEBO組新增的毛細(xì)血管數(shù)量明顯多于模型組。治療后第18天,MEBO組創(chuàng)面組織中miR-126a-3p表達(dá)量也顯著多于模型組。可見(jiàn),與正常大鼠相比,糖尿病大鼠創(chuàng)面更加難以愈合,而MEBO可以加速糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合速度并改善創(chuàng)面愈合質(zhì)量。這可能與糖尿病大鼠創(chuàng)面miR-126a-3p表達(dá)不足,而MEBO可以刺激miR-126a-3p表達(dá)增加進(jìn)而促進(jìn)血管新生有關(guān)。

綜上所述,MEBT/MEBO 可能通過(guò)提高創(chuàng)面組織中miR-126a-3p表達(dá)水平誘導(dǎo)血管新生,從而促進(jìn)糖尿病慢性創(chuàng)面愈合。