譚歡歡, 姜 佳, 劉金亮, 張 淵, 郭旭昊,魏江橋, 錢 樂, 徐建強, 劉圣明

(河南科技大學 園藝與植物保護學院 植物保護系，河南 洛陽 471023)

由禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum引起的小麥赤霉病 (Fusariumhead blight，F(xiàn)HB) 是世界流行性病害，近年來已成為威脅我國小麥生產(chǎn)的最主要病害之一[1-2]。該病不僅嚴重影響小麥的產(chǎn)量，而且降低小麥的品質(zhì)[3-4]，其產(chǎn)生的多種衍生真菌毒素及次生代謝物質(zhì)，嚴重威脅著人類和動物的健康[5]。小麥赤霉病不僅在我國長江中、下游地區(qū)普遍發(fā)生，而且近幾年來在黃河及其附近流域也常有發(fā)生，并有逐漸向北擴展蔓延的趨勢[2,6-7]。由于生產(chǎn)上缺乏高抗或免疫赤霉病的小麥品種[8]，化學防治仍是防控小麥赤霉病的重要措施[9-10]。自20 世紀70 年代以來，我國一直使用多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑來防治小麥赤霉病。然而，由于其被長期大量使用且作用靶標單一，病原真菌極易對其產(chǎn)生抗性，從而導致藥劑防效下降或喪失[5]。

丙硫菌唑 (prothioconazole) 是拜耳公司研發(fā)的一種新型三唑硫酮類殺菌劑，2004 年在德國上市，不僅具有良好的內(nèi)吸性、優(yōu)異的保護性、治療性和鏟除性能，且持效期長，其作用機制為抑制真菌甾醇生物合成中C-14 的脫甲基化，進而影響真菌細胞膜的功能[11]。丙硫菌唑具有廣譜的殺菌活性，對許多真菌病害都具有良好的殺菌效果[12]，尤其是對小麥赤霉病的防治效果顯著且增產(chǎn)明顯[11,13]。自2019 年1 月丙硫菌唑在我國獲批登記用于小麥赤霉病等的防治以來，尚未發(fā)現(xiàn)禾谷鐮孢菌對其產(chǎn)生抗性的報道，且先前的研究發(fā)現(xiàn)禾谷鐮孢菌對其有較低的抗藥性風險[14]。鑒于此，本研究采用菌絲生長速率法測定了2019—2021 年從河南省11 個地區(qū)采集并分離得到的278 株禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑的敏感性，旨在持續(xù)性監(jiān)測河南省禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑的敏感性水平以及田間是否有抗性群體的產(chǎn)生，為今后田間抗藥性監(jiān)測及合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試藥劑：95%丙硫菌唑 (prothioconazole) 原藥 (山東海利爾化工有限公司)。

供試培養(yǎng)基：PSA 培養(yǎng)基 (馬鈴薯200 g，瓊脂17 g，蔗糖20 g，用去離子水定容至1000 mL)。

綠豆湯培養(yǎng)基 (綠豆30 g，用去離子水定容至1000 mL)。

WA (water-agar) 培養(yǎng)基 (瓊脂17 g，用去離子水定容至1000 mL)。

供試菌株的培養(yǎng)及鑒定：2019—2021 年在河南省不同地區(qū)采集小麥赤霉病病穗樣本，用無菌鑷子將染病麥?；蛩牍Ｔ跓o水乙醇里浸泡5～10 s，然后用無菌水沖洗3 次，以無菌定性濾紙吸干水分后在含質(zhì)量濃度為100 μg/mL 硫酸鏈霉素的PSA 平板上培養(yǎng)。待培養(yǎng)基長出粉紅色菌落后，打取菌餅轉(zhuǎn)入3% 綠豆湯培養(yǎng)基中，置于搖床上，于25 ℃、120 r/min、12 h 光照/12 h 黑暗的條件下進行搖培，5 d 后在WA 培養(yǎng)基上劃線挑單孢。利用禾谷鐮孢菌特異性引物 (Fg-F，5′-TTC TTTGACATCTGTTCAACCCA-3′，F(xiàn)g-R，5′-ACAGATGACAAGATTCAGGCACA-3′，280 bp)進行分子鑒定，明確其所屬種為禾谷鐮孢菌F.graminearum[15]，將分離得到的菌株在PSA 斜面上4 ℃條件下保存。

1.2 禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑的敏感性測定

采用菌絲生長速率法[16]測定2019—2021 年采集的禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑的敏感性。用丙酮將丙硫菌唑原藥溶解并配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的母液，再用丙酮將母液逐級稀釋成至0.3125、0.625、1.25、2.5 和5 mg/mL，等量加入PSA 培養(yǎng)基中 (每200 mL PSA 中加入200 μL)，制成藥劑最終質(zhì)量濃度分別為0.3125、0.625、1.25、2.5 和5 μg/mL 的含藥平板 (直徑為9 cm)。以含相同質(zhì)量濃度丙酮的平板為對照。將供試菌株在PSA 平板上25 ℃培養(yǎng)3 d 后，打取直徑為5 mm 的菌餅并接種于培養(yǎng)皿中央。每處理3 次重復。置于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)3 d，采用十字交叉法測量各菌株菌落直徑，并按公式 (1) 計算各藥劑處理下菌絲生長抑制率。

式中：I為菌絲生長抑制率，%；D0為對照菌落直徑，cm；Dt為處理菌落直徑，cm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS v7.05 數(shù)據(jù)處理軟件處理數(shù)據(jù)，得出藥劑抑制菌絲生長的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r) 和有效抑制中濃度 (EC50)，采用顯著性最小差異法 (Least-Significant Difference，LSD，P＜ 0.05)進行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2019—2021 年河南省禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑的敏感性

由圖1 可以看出：供試278 株禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑的敏感性頻率直方圖為單峰曲線，呈近似正態(tài)分布，表明尚無田間抗藥性群體產(chǎn)生。各菌株EC50值在0.609～3.868 μg/mL 之間，近80%菌株的EC50值分布在0.800～2.400 μg/mL，最大值為最小值的6.35 倍，平均EC50值為(1.741 ±0.690) μg/mL。

圖1 供試278 株禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑的頻率分布Fig.1 The frequency distribution of EC50 values of 278 F.graminearum strains to prothioconazole

2.2 不同年份間禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑的敏感性差異

結(jié)果 (表1) 表明：不同年份間，禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑的敏感性水平無顯著性差異，其中：2020 年的83 株菌為最不敏感，平均EC50值為(1.894 ± 0.652) μg/mL；2021 年的104 株菌株最為敏感，平均EC50值為(1.643 ± 0.701) μg/mL；2019 年的91 株菌株較為敏感，平均EC50值為(1.715 ± 0.695) μg/mL。每一年的平均EC50值與3 年的平均值間均無顯著差異，表明2019—2021年禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑的敏感性水平無顯著變化。2019 年菌株間敏感性差異最大，EC50最大值是最小值的6.35 倍，平均值低于2019—2021 年菌株平均水平。2020 年菌株間敏感性差異最小，EC50最大值是最小值的4.46 倍，平均值高于2019—2021 年菌株平均水平。

表1 不同年份間禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑的敏感性Table 1 Sensitivity of F.graminearum to prothioconazole in different years

2.3 不同地區(qū)間禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑的敏感性差異

不同地區(qū)間，禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑的敏感性水平有顯著性差異。由表2 數(shù)據(jù)可以看出：濟源地區(qū)的菌株最不敏感，開封地區(qū)的菌株最敏感。焦作市菌株間敏感性差異最大，EC50最大值是最小值的6.21 倍；新鄉(xiāng)市菌株間敏感性差異最小，EC50最大值僅是最小值的1.75 倍。

表2 不同地區(qū)間禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑的敏感性Table 2 Sensitivity of F.graminearum to prothioconazole in different regions

3 結(jié)論與討論

近年來，有關(guān)禾谷鐮孢菌對三唑類殺菌劑的敏感性研究報道較多。張銘等測定了采自不同省份的100 株小麥赤霉病菌對葉菌唑的敏感性，結(jié)果顯示，供試菌株的EC50值在0.04～0.51 μg/mL之間，平均值為(0.18 ± 0.09) μg/mL，且敏感性頻率分布呈近似正態(tài)分布，由此建立了敏感性基線[17]。徐建強等采用菌絲生長速率法測定了采自河南省不同縣 (市) 共113 株小麥赤霉病菌對戊唑醇的敏感性，結(jié)果顯示，供試菌株對戊唑醇的EC50值范圍在0.010～0.237 μg/mL，平均值為(0.057 ± 0.041) μg/mL，敏感性頻率分布圖顯示，超80% 的菌株的敏感性頻率分布呈近似正態(tài)分布，因此可將此部分菌株的平均EC50值(0.041 ±0.016) μg/mL 作為小麥赤霉病菌對戊唑醇的敏感性基線[18]。本研究采用菌絲生長速率法測定了河南省各地區(qū)禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑的敏感性，結(jié)果顯示：河南省在2019—2021 收集的278 株菌株的平均EC50值為(1.741 ± 0.690) μg/mL，其敏感頻率分布圖為單峰曲線，呈近似正態(tài)分布，表明無田間抗藥性群體產(chǎn)生。而且，與先前建立的河南省禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑的敏感性基線(1.776 ± 0.667) μg/mL 一致，表明2019—2021年禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑的敏感性水平無變化[14]。通過比較不同年份的菌株可知，2020 年菌株最不敏感，平均EC50值為(1.894 ± 0.652) μg/mL；2021 年菌株最敏感，為(1.643 ± 0.701) μg/mL。通過比較不同地區(qū)的平均EC50值可知，各地區(qū)間禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑的敏感性水平有顯著性差異，其中濟源市的菌株最不敏感，開封市的菌株最敏感。由于取樣各采集地對于丙硫菌唑或其他三唑類殺菌劑的用藥歷史和用藥水平并不清楚，推斷測定結(jié)果中呈現(xiàn)的不同區(qū)域間的敏感性差異可能是與各地赤霉病流行及發(fā)生程度、用藥次數(shù)和用藥量有關(guān)。此外，新鄉(xiāng)市和駐馬店市兩地的菌株間敏感性差異小可能與其樣本數(shù)較少有關(guān)，為進一步完善研究，我們后續(xù)將增加菌株采集的數(shù)量，持續(xù)性監(jiān)測這兩個地區(qū)以及省內(nèi)其他地區(qū)禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑的敏感性。

丙硫菌唑不僅具有較高的殺菌活性，而且能夠有效抑制由赤霉病產(chǎn)生的各種毒素，是我國用于防控小麥赤霉病的主要藥劑[13]。吳佳文等通過田間試驗與室內(nèi)測定發(fā)現(xiàn)，其單劑 (48%丙硫菌唑懸浮劑 (SC) 施藥劑量 (有效成分，下同) 288 g/hm2)及復配劑 (40% 丙硫 ? 戊唑醇SC 施藥劑量240 g/hm2) 對小麥赤霉病均有良好的防治效果，藥后25 d 的防效為89.64%～91.71%[19]。此外，他們還發(fā)現(xiàn)48%丙硫菌唑SC 有效成分252、288 g/hm2處理組中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 (DON) 的檢出量明顯低于空白對照，對DON 具有很強的抑制效果[19]。馬勇等測定了田間條件下施用丙硫菌唑單劑及其復配劑對小麥赤霉病的防治效果。結(jié)果顯示，25%丙硫菌唑SC 在有效成分 187.5 g/hm2下對小麥赤霉病的防治效果達76.38%，15%丙硫 ?戊唑醇SC 在270 g/hm2下的防治效果達75.12%，均能有效控制小麥赤霉病[20]。

本研究在實驗室已建立的河南省禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑的敏感性基線的基礎(chǔ)上，持續(xù)監(jiān)測了2019—2021 年間河南省禾谷鐮孢菌對其敏感性水平變化。結(jié)果顯示，尚未在田間發(fā)現(xiàn)抗性菌株，且敏感性水平基本一致?？紤]到殺菌劑對病害的作用效果在自然條件下要受品種、氣候等其他因素的影響，室內(nèi)試驗得出的結(jié)果僅可作為理論依據(jù)，田間藥效試驗還有待于下一步研究。同時，為延緩禾谷鐮孢菌對丙硫菌唑抗藥性的產(chǎn)生和發(fā)展，應(yīng)在小麥的生長季節(jié)中控制其使用次數(shù)，建議與其他不同作用機制的殺菌劑交替或復配使用。