姚靜遠, 單 宇, 魯正熹, 吳君芝, 王湘瑩, 王曉明, 馮 煦, 陳 雨,①

〔1. 南京中醫(yī)藥大學, 江蘇 南京210023; 2. 江蘇省中國科學院植物研究所(南京中山植物園) 江蘇省植物資源研究與利用重點實驗室 江蘇省中藥材生態(tài)種植與高值化利用工程研究中心, 江蘇 南京 210014;3. 江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學院, 江蘇 南京 210029; 4. 湖南省林業(yè)科學院, 湖南 長沙 410004〕

灰氈毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.)為忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬屬(LoniceraLinn.)藤本植物，為“山銀花”中藥材的主要來源植物之一[1]，其主要成分為酚酸類、皂苷類、環(huán)烯醚萜類以及黃酮類化合物[2-5]，其中，酚酸類成分作為灰氈毛忍冬主要藥用成分之一，具有抗病毒、抗腫瘤、保肝、抗氧化、抗炎和抗菌[2]等藥理活性。本研究通過對灰氈毛忍冬花蕾體積分數(shù)70%乙醇提取物進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析，根據(jù)酚酸類物質(zhì)的質(zhì)譜特征碎片離子峰和紫外吸收光譜特征峰，從該提取物中鑒定到若干未知酚酸類衍生物，并對其中的酚酸類化學成分進行進一步的分離和結(jié)構(gòu)測定，以期為深入開發(fā)利用灰氈毛忍冬酚酸類成分提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

灰氈毛忍冬品種‘花瑤晚熟’(‘Huayao Serotino-matura’)花蕾于2020年7月采自湖南隆回縣，人工栽培，并經(jīng)江蘇省中國科學院植物研究所田梅助理研究員鑒定?；覛置潭ɡ俨烧蠓侄鄬又糜?0 ℃烘箱內(nèi)干燥20 h，備用。

主要儀器：ZF-20D暗箱式紫外分析儀(鄭州龍翔儀器有限公司)；Bruker AV-300/500核磁共振光譜儀(瑞士Bruker公司)；Agilent 1100高效液相色譜儀，Agilent 1100 LC/MSD SL液相質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；Shimadzu LC-20 AR半制備型高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)。

主要試劑：柱層析硅膠(青島海洋化工有限公司)，RP-18(日本YMC公司，12 nm)，Sephadex LH-20(美國Pharmacia公司)，柱色譜試劑均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)，高效液相色譜試劑均為色譜純(美國TEDIA公司)。

1.2 方法

1.2.1 化合物分離 取8 kg樣品，用體積分數(shù)70%乙醇回流提取3次，每次3 h；提取液合并后減壓濃縮至無醇味，經(jīng)D101型大孔樹脂柱分離，依次用超純水、體積分數(shù)30%乙醇、體積分數(shù)70%乙醇和體積分數(shù)95%乙醇洗脫得到Fr.Ⅰ(1 200 g)、Fr.Ⅱ(132 g)、Fr.Ⅲ(600 g)和Fr.Ⅳ(30 g)4個部分。Fr.Ⅱ部分經(jīng)RP-18反相柱層析(填料600 g)分離，依次用體積分數(shù)10%乙醇、體積分數(shù)20%乙醇、體積分數(shù)30%乙醇和體積分數(shù)95%乙醇洗脫，合并組分相似的洗脫液，濃縮后得Fr.Ⅱ-A、Fr.Ⅱ-B(24 g)、Fr.Ⅱ-C(32 g)和 Fr.Ⅱ-D 4個部分。運用RP-8反相柱層析和半制備型高效液相色譜儀分離等方法，從Fr.Ⅱ-B部分分離得到化合物1(250 mg)、化合物2(1.5 g)、化合物3(70 mg)和化合物4(40 mg)，從Fr.Ⅱ-C部分分離得到化合物5(72 mg)、化合物6(40 mg)、化合物7(62 mg)、化合物8(54 mg)和化合物9(68 mg)。將所得到的化合物的理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻數(shù)據(jù)對比，確定化合物結(jié)構(gòu)。

1.2.2 高效液相條件 Agilent Eclipse CDS-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美國Agilent公司)，柱溫30 ℃，流動相為甲醇-體積分數(shù)0.4%乙酸的混合溶液(體積比 15∶85)，流速0.8 mL·min-1，檢測波長330 nm。

2 結(jié) 果

化合物1：淺黃色粉末(甲醇)，薄層層析(TLC)紫外光(波長365 nm)下顯藍色熒光，高效液相檢測與咖啡酸標準品保留時間相同(tR=31.45 min)，故鑒定為咖啡酸(caffeic acid)。

化合物2：灰白色粉末(甲醇)，TLC紫外光(波長365 nm)下顯藍色熒光，噴三氯化鐵試液顯污綠色。ESI-MSm/z：353[M-H]-，相對分子質(zhì)量354，分子式C16H18O9。1H-NMR(C5D5N，500 MHz)δ：7.95(1H，d，J=15.9 Hz，H-7′)，7.46(1H，d，J=2.1 Hz，H-2′)，7.13(1H，d，J=8.1 Hz，H-5′)，7.03(1H，dd，J=8.1，2.1 Hz，H-6′)，6.55(1H，d，J=15.9 Hz，H-8′)，6.20(1H，m，H-3)，4.76(1H，m，H-5)，4.30(1H，dd，J=8.3，3.1 Hz，H-4)，2.93～2.68(4H，m，H-2，6)；13C-NMR(C5D5N，125 MHz)δ：177.2(C-7)，167.2(C-9′)，147.6(C-4′)，145.9(C-7′)，145.7(C-3′)，126.9(C-1′)，121.9(C-6′)，116.7(C-5′)，115.8(C-8′)，115.5(C-2′)，76.0(C-1)，73.6(C-4)，72.3(C-3)，71.2(C-5)，39.3(C-2)，38.8(C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[6]基本一致，故鑒定為綠原酸(chlorogenic acid)。

化合物3：淺黃色粉末(甲醇)，TLC紫外光(波長365 nm)下顯藍色熒光，噴三氯化鐵試液顯污綠色。高效液相檢測與4-O-咖啡?？鼘幩針藴势繁Ａ魰r間相同(tR=22.95 min)，故鑒定為4-O-咖啡?？鼘幩?4-O-caffeoylquinic acid)。

化合物4：白色粉末(甲醇)，TLC紫外光(波長365 nm)下顯藍色熒光，噴三氯化鐵試液顯污綠色。ESI-MSm/z：353[M-H]-，相對分子質(zhì)量354，分子式C16H18O9。1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ：7.46(1H，d，J=15.9 Hz，H-7′)，7.01(1H，d，J=2.1 Hz，H-2′)，6.96(1H，dd，J=8.1，2.1 Hz，H-6′)，6.76(1H，d，J=8.1 Hz，H-5′)，6.18(1H，d，J=15.9 Hz，H-8′)，5.17(1H，m，H-5)，4.82(1H，m，H-3)，3.86(1H，m，H-4)，2.02～1.85(4H，m，H-2，6)；13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ：175.9(C-7)，165.9(C-9′)，148.1(C-4′)，145.5(C-7′)，144.2(C-3′)，125.6(C-1′)，120.9(C-6′)，115.7(C-5′)，115.0(C-8′)，114.5(C-2′)，72.8(C-1)，72.2(C-4)，70.9(C-3)，67.2(C-5)，38.9(C-2)，35.1(C-6)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[7]基本一致，故鑒定為5-O-咖啡?？鼘幩?5-O-caffeoylquinic acid)。

化合物5：淡黃色粉末(甲醇)，TLC紫外光(波長365 nm)下顯藍色熒光，噴三氯化鐵試液顯污綠色。ESI-MSm/z：515[M-H]-，相對分子質(zhì)量516，分子式C25H24O12。1H-NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ：7.46，7.44(each 1H，d，J=15.6 Hz，H-7′，H-7″)，7.04～6.93(4H，m，H-2′，H-2″，H-6′，H-6″)，6.73，6.72(each 1H，d，J=8.1 Hz，H-5′，H-5″)，6.23，6.18(each 1H，d，J=15.9 Hz，H-8′，H-8″)，5.41(1H，m，H-5)，4.93(1H，m，H-3)，3.75(1H，m，H-4)，2.19(2H，m，Heq-2，6)，1.96(2H，m，Hax-2，6)。13C-NMR(DMSO-d6，75 MHz)δ：175.7(C-7)，165.9(C-9′，C-9″)，148.4(C-4′，C-4″)，145.5(C-3′，C-3″)，145.2(C-7′，C-7″)，125.5(C-1′，C-1″)，121.3(C-6′，C-6″)，115.7(C-5′，C-5″)，114.7(C-2′，C-2″)，113.9(C-8′)，113.5(C-8″)，73.5(C-1)，72.6(C-5)，68.3(C-4)，64.2(C-3)，38.6(C-2)，35.6(C-6)，以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[8-9]基本一致，故鑒定為3，5-O-二咖啡?？鼘幩?3,5-O-dicaffeoylquinic acid)。

化合物6：淡黃色粉末(甲醇)，TLC紫外光(波長365 nm)下顯藍色熒光，噴三氯化鐵試液顯污綠色。ESI-MSm/z：515[M-H]-，相對分子質(zhì)量516，分子式C25H24O12。1H-NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ：7.49，7.43(each 1H，d，J=5.9 Hz，H-7′，H-7″)，7.02，7.01(each 1H，d，J=2.1 Hz，H-2′，H-2″)，6.98，6.95(each 1H，dd，J=2.1，8.2 Hz，H-6′，H-6″)，6.74(2H，d，J=8.2 Hz，H-5′，H-5″)，6.24，6.14(each 1H，d，J=15.9 Hz，H-8′，H-8″)，5.36(1H，m，H-3)，5.11(1H，d，J=6.1 Hz，H-4)，4.37(1H，dd，J=7.7，3.0 Hz，H-5)，2.17(2H，m，H-2)，2.04(1H，m，Heq-6)，1.92(1H，m，Hax-6)；13C-NMR(DMSO-d6，75 MHz)δ：174.5(C-7)，165.9，165.4(C-9′，C-9″)，145.5(C-3′，C-3″)，148.4(C-4′，C-4″)，145.4(C-7′，C-7″)，125.4(C-1′，C-1″)，121.4(C-6′)，121.3(C-6″)，115.7(C-5′，C-5″)，114.8(C-2′，C-2″)，113.8(C-8′)，113.6(C-8″)，73.4(C-1)，73.1(C-4)，67.5(C-5)，66.1(C-3)，37.4(C-2)，37.0(C-6)，以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[10]基本一致，故鑒定為3，4-O-二咖啡?？鼘幩?3,4-O-dicaffeoylquinic acid)。

化合物7：淡黃色粉末(甲醇)，TLC 紫外光(波長365 nm)下顯藍色熒光，噴三氯化鐵試液顯污綠色。ESI-MSm/z：515[M-H]-，相對分子質(zhì)量516，分子式C25H24O12。1H-NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ：7.48，7.43(each 1H，d，J=15.8 Hz，H-7′，H-7″)，7.06，7.03(each 1H，d，J=1.8 Hz，H-2′，H-2″)，7.01，6.98(each 1H，dd，J=1.7，8.3 Hz，H-6′，H-6″)，6.77，6.76(each 1H，d，J=8.1 Hz，H-5′，H-5″)，6.24，6.16(each 1H，d，J=15.9 Hz，H-8′，H-8″)，5.24(1H，m，H-5)，5.15(1H，m，H-4)，3.82(1H，m，H-3)，2.10(2H，m，Heq-2，6)，1.94(2H，m，Hax-2，6)；13C-NMR(DMSO-d6，75 MHz)δ：175.5(C-7)，166.1(C-9′)，165.6(C-9″)，148.3(C-4′)，148.2(C-4″)，145.5(C-3′，C-3″)，145.0(C-7′)，144.6(C-7″)，125.6(C-1′)，125.5(C-1″)，121.3(C-6′)，121.1(C-6″)，115.8(C-5′)，115.7(C-5″)，114.8(C-2′，C-2″)，114.7(C-8′，C-8″)，72.5(C-1)，70.1(C-4,C-5)，67.8(C-3)，36.2(C-2)，34.8(C-6)，以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[11]基本一致，故鑒定為4，5-O-二咖啡?？鼘幩?4,5-O-dicaffeoylquinic acid)。

化合物8：淡黃色粉末(甲醇)，TLC紫外光(波長365 nm)下顯藍色熒光，噴三氯化鐵試液顯污綠色。ESI-MSm/z：543[M-H]-，545[M+H]+，相對分子質(zhì)量544，分子式C27H28O12。1H-NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ：7.51，7.42(each 1H，d，J=15.8 Hz，H-7′，H-7″)，7.04，7.02(each 1H，d，J=1.9 Hz，H-2′，H-2″)，6.98，6.95(each 1H，dd，J=2.1，8.1 Hz，H-6′，H-6″)，6.75(2H，d，J=8.1 Hz，H-5′，H-5″)，6.26，6.13(each 1H，d，J=15.9 Hz，H-8′，H-8″)，5.27(1H，m，H-3)，4.96(1H，dd，J=6.6，3.0 Hz，H-4)，4.09(1H，d，J=6.1 Hz，H-5)，4.04(2H，m，-CH2CH3)，2.26(2H，m，H-2)，2.01(1H，m，Heq-6)，1.89(1H，m，Hax-6)，1.15(3H，t，-CH2CH3)。13C-NMR(DMSO-d6，75 MHz)δ：172.8(C-7)，165.8(C-9′)，165.2(C-9″)，148.6(C-4′)，148.5(C-4″)，145.6(C-3′)，145.5(C-3″)，145.4(C-7′，C-7″)，125.4(C-1′)，125.2(C-1″)，121.4(C-6′)，121.3(C-6″)，115.7(C-5′，C-5″)，114.8(C-2′)，114.7(C-2″)，113.8(C-8′)，113.3(C-8″)，73.1(C-1)，72.2(C-4)，67.7(C-5)，65.4(C-3)，60.5(C-8)，37.6(C-2)，36.1(C-6)，13.8(C-9)，以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[12]基本一致，故鑒定為3，4-O-二咖啡?？鼘幩嵋阴?3,4-O-dicaffeoylquinic acid ethyl ester)。

化合物9：淡黃色粉末(甲醇)，TLC紫外光(波長365 nm)下顯藍色熒光，噴三氯化鐵試液顯污綠色。ESI-MSm/z：543[M-H]-，545[M+H]+，相對分子質(zhì)量544，分子式C27H28O12。1H-NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ：7.51，7.43(each 1H，d，J=15.8 Hz，H-7′，H-7″)，7.04～6.93(4H，m，H-2′，H-2″，H-6′，H-6″)，6.77(2H，d，J=8.1 Hz，H-5′，H-5″)，6.25，6.13(each 1H，d，J=15.9 Hz，H-8′，H-8″)，5.20(1H，m，H-5)，5.08(1H，m，H-4)，4.07(2H，m，-CH2CH3)，3.85(1H，m，H-3)，2.06(2H，m，Heq-2，6)，1.96(2H，m，Hax-2，6)，1.15(3H，t，-CH2CH3)。13C-NMR(DMSO-d6，75 MHz)δ：173.1(C-7)，165.9(C-9′)，165.2(C-9″)，148.5(C-4′)，148.3(C-4″)，145.6(C-3′，C-3″)，145.2(C-7′)，144.9(C-7″)，125.6(C-1′)，125.3(C-1″)，115.8(C-5′)，115.7(C-5″)，121.3(C-6′)，121.1(C-6″)，114.7(C-2′)，114.6(C-2″)，114.5(C-8′)，113.6(C-8″)，72.4(C-1)，70.9(C-4)，69.9(C-5)，66.7(C-3)，60.3(C-8)，34.7(C-2)，34.4(C-6)，13.9(C-9)，以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[13]基本一致，故鑒定為4，5-O-二咖啡?？鼘幩嵋阴?4,5-O-dicaffeoylquinic acid ethyl ester)。

本研究從灰氈毛忍冬花蕾乙醇提取物中分離得到9個酚酸類化合物，豐富了灰氈毛忍冬中的酚酸類成分。其中，化合物4、5、6、7、8和9均為首次從灰氈毛忍冬中分離獲得。