曾 燁，馬 慶，孫楷填，黃志標(biāo)，張洪勝，謝文波，韓正洲

（1.華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518110；2.廣東藥科大學(xué)，廣東 云浮 527300）

三叉苦為蕓香科植物三椏苦［Evodia lepta（Spreng.）Merr.］的干燥莖及帶葉嫩枝。將三叉苦全年采收，洗凈，趁鮮切成段或片，干燥，具有清熱解毒、行氣止痛、燥濕止癢等功效，可用于治療高熱不退、咽喉腫痛、熱毒瘡腫、風(fēng)濕痹痛、濕火骨痛、胃脘痛、跌打腫痛等，外用治療皮膚濕熱瘡疹、皮膚瘙癢、痔瘡等［1］。

三叉苦為中成藥999 感冒靈顆粒、三九胃泰主要原料藥材之一，其因清熱解毒功效具有廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)，年使用量約2 萬(wàn)t。三叉苦野生資源主要分布在中國(guó)廣東、廣西、海南、福建、貴州、臺(tái)灣及云南南部等地區(qū)。三叉苦主要依靠野生資源，而其需求量逐年增加，野生資源又逐漸銳減，供需矛盾日益凸顯。為解決野生資源匱乏的問題，廣東省、廣西壯族自治區(qū)等地開展了數(shù)萬(wàn)畝的三叉苦產(chǎn)業(yè)化種植，其種植技術(shù)逐漸規(guī)范化。為了確保優(yōu)良種子繁育和藥材質(zhì)量的穩(wěn)定，本研究開展了不同生長(zhǎng)年限三叉苦的種子和藥材質(zhì)量研究，以期為后續(xù)三叉苦種子種苗繁育、規(guī)范化和生態(tài)種植、科研及流通中的質(zhì)量控制提供科學(xué)參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

不同生長(zhǎng)年限的三叉苦種子和藥材均由華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)業(yè)化種植基地提供，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院院長(zhǎng)詹若挺鑒定為蕓香科植物三椏苦的三叉苦種子和藥材。三叉苦對(duì)照藥材來自中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)121682-201301）。

1.2 試劑

甲醇（分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司）；去離子水（廣州屈臣氏有限公司）；95%乙醇（分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司）；TTC（青島捷世康科技有限公司）；環(huán)己烷（分析純，東莞市喬科化學(xué)有限公司）；乙酸乙酯（分析純，西安天茂化工有限公司）。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 千粒重 隨機(jī)取2 份三叉苦，每份1000 粒，放在天平上稱重，精確到0.1 g，2 份試樣平均值的誤差允許范圍為5%，不超過5%的則取平均值為該樣品的千粒重，超過5%的則再數(shù)第3 份試樣稱重，取平均值作為該樣品千粒重。

1.3.2 種子活力 采用TTC 法測(cè)定種子活力，每個(gè)批次隨機(jī)數(shù)取100 粒凈度分析后充分混合凈種子，3 次重復(fù)。用去離子水浸泡4 h 以上，將泡好的種子用手術(shù)刀均勻切成兩瓣，選留其中較完整的一瓣（有胚）放入培養(yǎng)皿中，將配置好的1%TTC 溶液倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕搖動(dòng)幾下，使種子浸入藥液里。浸藥后，保持在30 ℃恒溫箱中，3 h 后觀察染色情況，充分著色后，倒出藥液，用清水沖洗種子，然后把種子放在吸濕紙上，立即檢查。著色為有活力種子，不著色為無(wú)活力種子。根據(jù)著色數(shù)計(jì)算百分率，取2 組平均值，代表所測(cè)種子活力。計(jì)算公式為種子活力=A∕100×100%（A為被染色的種子數(shù)，2 次重復(fù)間最大容許差距不得超過5%，若超過則再分析第3 次重復(fù)，直至達(dá)到要求，取差值小的2 次計(jì)算測(cè)定結(jié)果，平均百分率取整數(shù)）。

1.3.3 種子發(fā)芽率 種子經(jīng)表面消毒后，隨機(jī)取100 粒種子均勻置于已經(jīng)消毒的墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，于25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，播種的第5 天記錄種子發(fā)芽數(shù)，第7 天計(jì)算發(fā)芽指數(shù)，第12 天發(fā)芽結(jié)束計(jì)算發(fā)芽率，計(jì)算公式如下。

1.3.4 鮮重、干重 在基地隨機(jī)收集5 株長(zhǎng)勢(shì)一致的三叉苦植株，用自來水清洗干凈后切片晾干，測(cè)定植株鮮重，然后置入牛皮紙袋放入烘箱中，先在105 ℃烘30 min，再在60 ℃下烘至恒重，取出冷卻30 min 后稱干重。

1.3.5 浸出物 精密稱量供試品2～4 g，置于250 mL錐形瓶中，精密加稀乙醇（取95%乙醇529 mL 用水稀釋到1000 mL）至50 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放置冷卻后取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用干燥濾器過濾，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中，計(jì)算供試品中水溶性浸出物的含量（%）［2，3］。

1.3.6 總灰分 將三叉苦藥材樣品粉碎，過二號(hào)篩，混合均勻后，取三叉苦藥材樣品3～5 g，置熾灼至恒重的坩堝中，稱定重量（精確至0.01 g），緩緩熾熱，注意避免燃燒，至完全炭化時(shí)，逐漸升高溫度至500～600 ℃，使其完全灰化并至恒重，根據(jù)殘?jiān)亓坑?jì)算三叉苦藥材中總灰分的含量（%）［2，3］。

1.3.7 薄層鑒別 取樣品粉末1 g ，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取三叉苦對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按照薄層色譜法（《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版通則0502）試驗(yàn)，吸取上述2 種溶液各2～5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-乙醇-三乙胺（7∶4∶1∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，再進(jìn)行單因素方差分析，方差齊性檢驗(yàn)則采用LDS 法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長(zhǎng)年限三叉苦種子質(zhì)量指標(biāo)比較

從表1 可以看出，不同生長(zhǎng)年限的三叉苦雌株所結(jié)種子的千粒重和空殼率沒有顯著差異，而其種子活力和發(fā)芽率有顯著差異，隨著生長(zhǎng)年限的增加，其種子活力和發(fā)芽率有顯著增加。當(dāng)三叉苦植株生長(zhǎng)到三年生時(shí)，其種子活力和發(fā)芽率均達(dá)到最高，分別為80%和25%，說明三叉苦植株在生長(zhǎng)到3年時(shí)，其雌雄株達(dá)到成熟狀態(tài)。隨著生長(zhǎng)年限的繼續(xù)增加，其種子活力和發(fā)芽率的差異均不顯著。建議在種植3年以上種源基地開始采收三叉苦種子，其種子活力和發(fā)芽率較高。

表1 不同生長(zhǎng)年限三叉苦種子質(zhì)量指標(biāo)比較

2.2 不同生長(zhǎng)年限三叉苦藥材生長(zhǎng)指標(biāo)比較

從表2 可以看出，三叉苦植株隨著生長(zhǎng)年限的增加，其生長(zhǎng)指標(biāo)如株高、近地面直徑、主莖干重均呈不斷增加的趨勢(shì)；三叉苦植株從三年生到四年生的過程中生長(zhǎng)最為旺盛；從四年生到五年生的過程中生長(zhǎng)開始減慢；五年生時(shí)主莖干重達(dá)最大值，為5.75 kg∕株；隨機(jī)采集的野生三叉苦植株主莖干重為4.55 kg∕株，低于產(chǎn)業(yè)化基地規(guī)范化種植的產(chǎn)量。

表2 不同生長(zhǎng)年限三叉苦植株生長(zhǎng)指標(biāo)比較

2.3 不同生長(zhǎng)年限三叉苦藥材理化指標(biāo)比較

從表3 可以看出，不同生長(zhǎng)年限三叉苦藥材和野生三叉苦藥材浸出物含量、總灰分含量均符合《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)第三冊(cè)（2019年版）》中三叉苦項(xiàng)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)（浸出物≥4%，總灰分＜5.0%），其浸出物含量明顯高于廣東省藥典標(biāo)準(zhǔn)；不同生長(zhǎng)年限三叉苦藥材浸出物含量隨著生長(zhǎng)年限的增加而有一定的減少，二年生三叉苦藥材浸出物含量最高，為10.94%，五年生三叉苦藥材浸出物含量最低，為6.67%；野生三叉苦植株浸出物含量低于不同生長(zhǎng)年限的三叉苦藥材，為6.25%。不同批次藥材的總灰分和初加工工藝有一定的關(guān)系。自建基地生產(chǎn)的藥材嚴(yán)格按照初加工方法進(jìn)行烘干，其總灰分均在2.0%以下。野生藥材一般是切片后直接晾曬，其總灰分偏高，為2.5%。

表3 不同生長(zhǎng)年限三叉苦浸出物和總灰分含量比較

2.4 不同生長(zhǎng)年限三叉苦藥材的薄層鑒別

從圖1 可以看出，不同生長(zhǎng)年限的三叉苦藥材和野生三叉苦藥材薄層鑒別均符合《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)第三冊(cè)（2019年版）》中三叉苦項(xiàng)規(guī)定的薄層鑒別標(biāo)準(zhǔn)，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，均顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)。說明不同生長(zhǎng)年限的三叉苦藥材和野生三叉苦藥材的質(zhì)量均為合格。但是結(jié)合表2和表3 的數(shù)據(jù)，三叉苦生長(zhǎng)到三年生以上后，其產(chǎn)量和質(zhì)量均較高，所以建議產(chǎn)業(yè)化推廣種植3年后采收。

圖1 不同生長(zhǎng)年限三叉苦藥材的薄層鑒別

3 小結(jié)與討論

三叉苦為雌雄異株的蕓香科植物，不同生長(zhǎng)年限的三叉苦種子活力和發(fā)芽率有顯著差異，隨著生長(zhǎng)年限的增加，其種子活力和發(fā)芽率有顯著增加。當(dāng)三叉苦植株長(zhǎng)到三年生時(shí)，其種子活力和發(fā)芽率均達(dá)到最高，建議在種植3年以上種源基地開始采收。

不同生長(zhǎng)年限的三叉苦藥材和野生三叉苦藥材浸出物含量、總灰分、薄層鑒別等指標(biāo)均符合《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)第三冊(cè)（2019年版）》中三叉苦項(xiàng)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。但是在產(chǎn)業(yè)化推廣種植過程中，需要結(jié)合藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量均達(dá)到最大化。結(jié)合本試驗(yàn)的研究結(jié)果，三叉苦到3年生以上后，其產(chǎn)量和質(zhì)量均較高。同時(shí)產(chǎn)業(yè)化推廣種植三年生以上的三叉苦可以達(dá)到野生三叉苦的產(chǎn)量，且質(zhì)量更優(yōu)于野生資源，所以建議產(chǎn)業(yè)化推廣種植3年以上再采收。

三叉苦藥材是三九胃泰、999 感冒靈等中成藥的主要原料，市場(chǎng)需求量較大。主要是收集野生資源來供應(yīng)市場(chǎng)需求，多年的采收導(dǎo)致野生三叉苦資源逐年減少。為此，大力推廣三叉苦產(chǎn)業(yè)化、規(guī)范化、生態(tài)化種植迫在眉睫。國(guó)家相關(guān)部門也出臺(tái)了很多中藥材種植的政策措施和制訂了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，其目的是大力推廣人工栽培技術(shù)。

資源調(diào)研顯示，三叉苦在廣東省和廣西壯族自治區(qū)野生資源分布廣泛，同時(shí)國(guó)家對(duì)林下經(jīng)濟(jì)扶持力度較大，可以考慮在適宜的林下或者間伐部分高大喬木，采用林下種植或生態(tài)種植，使三叉苦的生長(zhǎng)有一定的光照環(huán)境［4-8］。生態(tài)種植即在三叉苦原生環(huán)境中適度間伐低矮灌木和高大喬木，然后再補(bǔ)充一定數(shù)量的三叉苦植株，使其資源量群落達(dá)到平衡的狀態(tài)；林下種植即在適宜產(chǎn)區(qū)仿原生態(tài)的種植模式，以林地自然環(huán)境資源為基礎(chǔ)，在不影響林木前提下，利用自然條件進(jìn)行合理種植［9-11］。