李丹 吳偉東 王瑛 古佳升 桃卓嫣 方明星 費松

【摘 要】目的 探討不同濃度β-葡聚糖對大鼠皮膚組織毛囊生長及VEGF表達的影響。方法 選取SPF級Wistar大鼠18只隨機分為3期實驗，各6只，于背部劃分4個部位，根據注射不同濃度的試劑分為4組，對照組注射1.00 ml，實驗組A注射0.75 ml生理鹽水+0.25 mlβ-葡聚糖，實驗組B注射0.50 ml生理鹽水+0.50 mlβ-葡聚糖，實驗組C注射1.00 mlβ-葡聚糖，分別于注射7、14、28 d后處死大鼠，取其注射部位組織制成切片，經HE染色后觀察毛囊生長狀況，qRT-PCR法檢測組織VEGF表達水平。結果 第7、14和28天大鼠皮膚均未見明顯腫塊、炎癥和壞死等不良反應，經解剖后未見大鼠皮下出現(xiàn)組織壞死、炎癥反應和血管栓塞等不良反應；第7天各實驗組HE染色切片結果較對照組均未見明顯變化；第14、28天各實驗組毛囊生長活躍，毛囊內的毛乳頭細胞增大，巨噬細胞浸潤、膠原纖維增生和新生血管形成；各實驗組7 d后毛囊生長情況和VEGF表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；14、28 d后各實驗組毛囊生長較對照組活躍，且VEGF表達水平升高（P<0.05）；且隨著β-葡聚糖濃度升高效果越確切。結論 β-葡聚糖可提高大鼠皮膚組織的VEGF表達水平，促進大鼠毛囊生長，且高濃度β-葡聚糖效果更佳。

【關鍵詞】β-葡聚糖；毛乳頭細胞；毛囊

中圖分類號：TQ658.5 文獻標識碼：A 文章編號：1004-4949（2023）02-0006-05

Effects of β-glucan on Rat Hair Follicles

LI Dan1， WU Wei-dong1， WANG Ying2， GU Jia-sheng1， TAO Zhuo-yan1， FANG Ming-xing1， FEI Song1

（1.Department of Cardiothoracic Surgery， Guangzhou Red Cross Hospital of Jinan University， Guangzhou 510000， Guangdong， China； 2.Guangzhou Xiaomanyao Medical Equipment Co.， Ltd.， Guangzhou 510000， Guangdong， China）

【Abstract】Objective To investigate the effects of different concentrations of β-glucan on hair follicle growth and VEGF expression in rat skin tissue. Methods Eighteen SPF Wistar rats were selected and randomly divided into three phases， with 6 rats in each group. Four parts were divided on the back. According to the injection of different concentrations of reagents， the rats were divided into four groups. The control group was injected with 1.00 ml of normal saline， the experimental group A was injected with 0.75 ml of normal saline+0.25 ml of β-glucan， the experimental group B was injected with 0.50 ml of normal saline+0.50 ml of β-glucan， and the experimental group C was injected with 1.00 ml of normal saline β-glucan. The rats were sacrificed at 7， 14 and 28 days after injection， and the tissues at the injection site were taken and made into slices. The growth of hair follicles was observed after HE staining， and the expression level of VEGF in tissues was detected by qRT-PCR. Results On the 7th， 14th and 28th day， no obvious mass， inflammation， necrosis and other adverse reactions were found in the skin of rats. After dissection， no adverse reactions such as tissue necrosis， inflammatory reaction and vascular embolism were found in the subcutaneous tissue of rats. On the 7th day， there was no significant change in the results of HE staining in each experimental group compared with the control group. On the 14th and 28th day， the hair follicles of each experimental group grew actively， the dermal papilla cells in the hair follicles increased， macrophage infiltration， collagen fiber hyperplasia and neovascularization formed； there was no significant difference in hair follicle growth and VEGF expression between the experimental groups and the control group on the 7th day （P>0.05）. On the 14th and 28th day， the growth of hair follicles in each experimental group was more active than that in the control group， and the expression level of VEGF was increased （P<0.05）. And with the increase of β-glucan concentration， the effect is more accurate. Conclusion β-glucan can increase the expression level of VEGF in rat skin tissue and promote the growth of rat hair follicles， and the effect of high concentration β-glucan is better.

【Key words】β-glucan； Dermal papilla cells； Hair follicles

目前脫發(fā)的治療方式有外用米諾地爾等藥物、植發(fā)和富血小板血漿局部注射等方式[1]。但現(xiàn)有治療方法的療效差異較大，無法滿足患者的治療期望，存在一定的局限性。因此需要開發(fā)效果更好的治療方法和藥物。β-葡聚糖是以葡萄糖為單糖組成的同型多糖，能激活免疫系統(tǒng)、活化巨噬細胞[2，3]，誘導巨噬細胞分泌VEGF等生長因子[4，5]，促進膠原纖維和血管生成。毛發(fā)起源于毛囊，臨床認為[6]，保護毛囊免受活性氧損傷和促進血管生成是維持毛囊生長的兩種基本機制；且高糖環(huán)境有利于毛發(fā)生長相關基因的表達和毛發(fā)生長[7]。由于β-葡聚糖能通過激活巨噬細胞誘導巨噬細胞分泌VEGF，也能通過組蛋白去乙酰化酶5誘導血管生成[8]，其分解中間產物葡萄糖能為毛乳頭細胞提供高糖環(huán)境，上述機制均與調控毛囊生長相關?；诖耍狙芯客ㄟ^對比不同濃度β-葡聚糖對大鼠毛囊生長狀態(tài)和組織VEGF表達水平，探討β-葡聚糖對大鼠毛囊生長的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取SPF級Wistar大鼠18只，周齡6周，體重（200±20）g（均購自南方醫(yī)科大學實驗動物管理中心）。動物實驗符合動物倫理，倫理號（穗紅醫(yī)院輪審2022-011-01），本實驗按照《國立衛(wèi)生研究院實驗動物護理與使用指南》進行。大鼠在室溫（25±2）℃，相對濕度（50±5）%，12 h明暗交替的環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，飼養(yǎng)7 d。

1.2 試劑與儀器 β-葡聚糖（廣州碩譜生物科技有限公司）；無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；二甲苯（天津市富宇精細化工有限公司）；伊紅染液、蘇木素染液；中性樹膠（谷歌生物科技有限公司）；顯微鏡（上海通灝光電科技有限公司）；攤烤片機（湖北安立信醫(yī)療實業(yè)有限公司）；脫水機（武漢俊杰電子有限公司）；包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；實時熒光定量PCR儀（美國伯樂公司）；VEGF和GADPH引物（廣州伯信生物科技有限公司）。

1.3 實驗分組 18只大鼠按編號后采用完全隨機抽樣法分為3期實驗，各6只，分別為7 d 1期實驗、14 d 2期實驗和28 d 3期實驗，大鼠背部各選取4個注射點，注射間隔1 cm以上，各點注射劑量均為1 ml，注射試劑分組與細胞分組相同，見表1。

1.4 方法

1.4.1試劑注射 18只大鼠禁食12 h、禁水4 h后，稱重，采用7%水合氯醛（0.03 ml/kg）腹腔注射麻醉。麻醉成功后對大鼠背部皮膚進行備皮，選取脊柱旁兩側約2 cm皮下組織為注射中心點，以注射點中心劃分1.5 cm寬度的正方形區(qū)域使用記號筆標注，1只大鼠背部脊柱兩側分別標注4個區(qū)域。消毒后各部位注射1 ml材料，注射后予以輕度按摩使材料分布更均勻。注射完成后常規(guī)飼養(yǎng)，于7、14、28 d后分別采用脊髓脫臼法處死對應實驗期組大鼠，去除大鼠背部毛發(fā)后拍照記錄，對標記筆標注的注射區(qū)域用手術刀切開皮膚全層并拍照記錄，使用蚊式鉗鈍性分離剩余的注射材料及周圍組織，保持包膜完整。

1.4.2蘇木精-伊紅染色法 剪取皮膚組織，10%甲醛溶液中固定48 h。流水洗去甲醛后將包埋塊置于網兜中，放入70%乙醇過夜。第2天依次放入80%、90%、100%A、100%B乙醇浸泡各1 h，二甲苯A、二甲苯B各浸泡30 min，至組織塊呈現(xiàn)棕黃色或暗紅色透明狀，放入水浴機石蠟缸A、B、C各1.5 h（60 ℃），包埋塊和包埋模具放入包埋儀b中至少30 min，包埋后關閉水浴箱，使用萊卡切片機切片，厚度為4 μm，45 ℃攤片，烤片機75 ℃烤片60 min。將石蠟切片放入染色盒，用二甲苯A、B、C各脫蠟5 min。依次置于100%、95%、80%、70%酒精中，5 min/次，入蒸餾水2次，5 min/次。蘇木素染核1 min，流水沖洗干凈，0.1%鹽酸酒精分化10 s，入蒸餾水放置10 min。0.5%伊紅染色1 min，流水沖洗干凈，入蒸餾水3 min，取出玻片放在通風櫥里晾干。用中性樹膠對晾干的組織切片進行封片。在光學顯微鏡下找到目標部位，拍照。

1.4.3毛囊狀態(tài)評價 選取切片組織毛囊所處部位的3個視野拍照并記錄。若選取視野下可見總毛囊數(shù)量低于10個，則舍棄該視野，選取另一個視野，計算處于生長期的毛囊占總毛囊的比例，結果取平均值。

1.4.4 qRT-PCR法檢測VEGF的表達 利用Trizol試劑從組織中提取總RNA，NanoDrop檢測RNA濃度及純度，使用qRT-PCR檢測VEGF水平。反應條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)。VEGF相對表達量以GADPH為內參照，前引物GTTCGAGGAAAGGGAAAGGGTC，后引物GCGAGTCTGTGTTTTTGCAGGA，GADPH前引物GGCATCCTGACCCTGAAGTA，后引物GGGGTGTTGAAGGTCTAAA，采用2-ΔΔCt法對細胞中VEGF的表達水平進行相對定量分析。實驗重復3次。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件處理本研究數(shù)據，計量資料以（x-±s）表示，組間比較采用單因素方差分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠皮膚和皮下大體觀 第7、14和28天大鼠皮膚均未見明顯腫塊、炎癥和壞死等不良反應，經解剖后未見大鼠皮下出現(xiàn)組織壞死、炎癥反應和血管栓塞等不良反應，見圖1。

2.2 大鼠皮膚HE染色切片結果 第7天各實驗組較對照組均未見明顯變化；第14、28天各實驗組毛囊生長活躍，毛囊內的毛乳頭細胞增大，巨噬細胞浸潤、膠原纖維增生和新生血管形成，見圖2。

2.3 各組大鼠毛囊生長狀態(tài)評價 第7天各實驗組毛囊生長情況與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；第14、28天各實驗組生長期毛囊比例高于對照組，C組比例最高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；各實驗組生長期毛囊比例均呈上升趨勢，見表2。

2.4 各組大鼠組織VEGF水平比較 為了避免切片鏡下選取引起的誤差，本研究檢測了大鼠真皮組織中的VEGF的表達水平。除對照組外，各實驗組VEGF表達水平均呈上升趨勢，第7天表達水平組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；第14、28天各實驗組VEGF表達水平均高于對照組，且實驗組C的表達水平最高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖3。

3 討論

毛囊是一個結構復雜且非?；钴S的器官。毛囊的生長受到胰島素樣生長因子-1、腫瘤生長因子-β和VEFG等的調控[6]。毛囊基底部的毛乳頭細胞和角質形成細胞是毛囊周期調節(jié)的關鍵參與者[7-9]，其中毛乳頭細胞是一種特殊的毛發(fā)間充質成分，內含有毛細血管。毛乳頭細胞分泌的各種生長因子能夠調控毛囊生長，在毛發(fā)的形態(tài)發(fā)生和再生生長中起著非常重要的作用[10]。毛囊周期分為生長期、休止期和為脫落期，約90%的毛發(fā)處于生長期，其余10%處于休止期和脫落期。調節(jié)毛乳頭細胞的活躍狀態(tài)、可促進毛囊從休止期進入生長期，調控毛囊生長。

葡聚糖根據糖苷鍵連接的類型不同分為α-葡聚糖和β-葡聚糖。α-葡聚糖中包括具有代表性的血漿替代品右旋糖酐[11]。β-葡聚糖的活性較α-葡聚糖更活躍，β-葡聚糖具有調節(jié)血脂和血糖、降低膽固醇、抗腫瘤、調節(jié)免疫功能、調節(jié)腸道菌群等活性，能減少傷口炎癥并促進傷口愈合[12]，或作為藥物載體傳輸特定藥物靶向治療疾病[13]，在治療銀屑病上也有較大的潛力[14]。此外，β-葡聚糖還能促進毛囊生長[15]。β-葡聚糖可被免疫活性細胞膜上的受體識別，激活包括巨噬細胞在內的免疫細胞，誘導巨噬細胞分泌VEGF。高糖環(huán)境使糖酵解介導的組蛋白乙?；黾?，引起增加毛發(fā)誘導基因的表達和毛干的延長?？紤]到VEGF在毛發(fā)生長周期中介導血管生成中起著重要作用，以及視野選取可能引起的一定誤差，因此本研究檢測了組織的VEGF表達水平。本實驗結果顯示，各實驗組第7天毛囊生長情況和VEGF表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；第14、28天各實驗組毛囊生長較對照組活躍，且VEGF表達水平升高（P<0.05）；且隨著β-葡聚糖濃度升高效果越確切，說明β-葡聚糖激活巨噬細胞分泌VEGF，引起VEGF水平升高，VEGF進一步作用于毛囊，誘導毛囊進入生長期或維持和促進毛囊生長，同時β-葡聚糖代謝產生的葡萄糖為毛乳頭細胞提供了有利的高糖環(huán)境，毛乳頭細胞代謝活躍分泌包括VEGF在內的各種生長因子營養(yǎng)毛囊細胞，并促進毛發(fā)誘導基因的表達和毛干的延長。大鼠毛囊生長周期較短，約為28 d[16]，因此在第14、28天已經可見差異，注射β-葡聚糖后可見毛囊和血管生長。本實驗不足之處在于僅驗證了不同濃度的β-葡聚糖對大鼠毛囊的生長和皮膚組織的VEGF表達產生的影響，沒有檢測其他可能參與調控毛乳頭細胞或毛囊的生長因子，β-葡聚糖與毛乳頭細胞和毛囊的關系仍需進一步研究。

綜上所述，β-葡聚糖可提高大鼠真皮層的VEGF表達水平，并提供高糖環(huán)境，促進毛囊毛發(fā)生長，且全濃度的β-葡聚糖效果更佳。

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編輯 劉雯