摘" 要" 病原微生物作為自然界中對(duì)人畜都能引起致病性的一類微小生物體，對(duì)人類健康造成了巨大威脅，極容易引起在全球范圍內(nèi)的大流行，能夠快速、精準(zhǔn)、高效的檢測(cè)出病原微生物，是擺在廣大醫(yī)學(xué)工作者面前亟待解決的課題. 本文從免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)及病原微生物代謝學(xué)檢測(cè)技術(shù)三大方面綜述了病原微生物的檢測(cè)方法，旨在為能夠快速、有效的檢測(cè)出病原微生物提供參考.

關(guān)鍵詞" 病原微生物；免疫學(xué)；分子生物學(xué)；檢測(cè)技術(shù)；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)" R914.5" " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼" A

微生物在自然界中廣泛分布，屬于形體微小、種類及數(shù)量繁多的一類低等生物體，其中，對(duì)人和動(dòng)物能夠產(chǎn)生致病性的一類微生物，稱為病原微生物. 近年來，由病原微生物引起的疾病，如禽流感（H7N9）、非典型肺炎（SARS）以及目前仍在全球肆虐的新型冠狀病毒（2019-nCoV）等所感染的疾病，傳染性都極強(qiáng)，通常能夠造成世界性的大流行[1-4]，因此在對(duì)病原微生物的檢測(cè)方面，務(wù)必要做到精準(zhǔn)、快速、高效和簡(jiǎn)便. 有效的病原微生物檢測(cè)方法，能夠在很大程度上提高檢測(cè)的時(shí)效性、精準(zhǔn)性，在醫(yī)學(xué)、食品等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用.

本文對(duì)病原微生物的不同檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了概括總結(jié)，同時(shí)對(duì)不同檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了分析對(duì)比，以期為進(jìn)一步開發(fā)新的病原微生物檢測(cè)技術(shù)奠定基礎(chǔ).

1" 病原微生物免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

病原微生物的免疫學(xué)的檢測(cè)技術(shù)，主要是通過抗原與抗體的相關(guān)反應(yīng)，將食品、藥品以及傳染病中涉及到的病原微生物檢測(cè)出來.

1.1" 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA），是通過將抗原或者抗體吸附在相關(guān)載體上，同時(shí)用一些酶對(duì)其標(biāo)記，與吸附在載體上的抗原或者抗體進(jìn)行結(jié)合，形成一些免疫復(fù)合物，與此同時(shí)，分析被酶分解的相關(guān)底物顏色信號(hào)的改變，對(duì)其實(shí)現(xiàn)定量或定性分析[5-7]. ELISA檢測(cè)具有時(shí)間短、特異性高以及靈敏度非常強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)然，亦伴隨一些重復(fù)性較差、檢測(cè)過程較為繁雜等弊端[8-11].

近年來，通過特殊的光電磁等新型材料的問世，對(duì)新型ELISA檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)帶來了機(jī)遇. 基于新型材料的改良的ELISA中，Jiang等人通過構(gòu)建辣根過氧化物酶介導(dǎo)的反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)聚合物AuNPs的聚集狀態(tài)[12]. 通過圖1可以看出，通過過氧化物的調(diào)節(jié)，對(duì)碘化物進(jìn)行氧化，生成相應(yīng)的碘單質(zhì)，誘導(dǎo)金納米粒子的聚集，顏色由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色.

基于新型熒光納米材料的改變，有研究提出了熒光免疫的設(shè)計(jì)，進(jìn)而開發(fā)了改進(jìn)型ELISA及熒光免疫測(cè)定法（FELISA）. XU等[13]研究開發(fā)了通過CAT調(diào)節(jié)的熒光轉(zhuǎn)換方法，用于測(cè)定伏馬毒素B1（FB1），如圖2所示，通過H2O2對(duì)巰基丙酸介導(dǎo)CdTe的熒光點(diǎn)進(jìn)行淬滅，在檢測(cè)中，通過調(diào)節(jié)H2O2的濃度，進(jìn)行對(duì)被測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)[14].

此外，基于電化學(xué)免疫分析、光熱效應(yīng)、表面增強(qiáng)拉曼散射、化學(xué)發(fā)光免疫分析等設(shè)計(jì)的ELISA測(cè)定方法，在病原微生物檢測(cè)上得到了非常廣泛的應(yīng)用，同時(shí)由于這些方法的簡(jiǎn)便、靈活，且能夠用于痕量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，展現(xiàn)出了非常大的應(yīng)用前景.

1.2" 免疫磁珠分離技術(shù)（IMBS）

免疫磁珠分離技術(shù)，是通過以免疫學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合活性蛋白質(zhì)，且被磁鐵吸引，從而將抗體與磁鐵結(jié)合，使得磁鐵成為相應(yīng)載體，進(jìn)而形成抗原-抗體-磁珠復(fù)合物，形成的復(fù)合物在外在磁力的作用下，產(chǎn)生力學(xué)變化，達(dá)到與其它物質(zhì)分離，能夠特異性的分離抗原的方法[15]. 此方法現(xiàn)已經(jīng)涉及到微生物、生化、藥理以及病例等各個(gè)領(lǐng)域，在免疫學(xué)檢測(cè)及生物學(xué)檢測(cè)等方面應(yīng)用廣泛[16-17].

有研究顯示[18]，通過使用IMBS分離技術(shù)能夠有效檢測(cè)出豬肉中的志賀氏菌等病原微生物. 亦有報(bào)道利用IMBS分離技術(shù)，從污染菌的試樣中，富集了李斯特菌[19]. 現(xiàn)在關(guān)于免疫磁珠分離技術(shù)能夠與多種微生物檢測(cè)技術(shù)結(jié)合，能夠有效實(shí)現(xiàn)對(duì)食源性病原微生物的快捷、高靈敏度的檢測(cè)[20]. IMSB結(jié)合PCR技術(shù)、電化學(xué)技術(shù)以及培養(yǎng)基分離技術(shù)等，實(shí)現(xiàn)了高效、精準(zhǔn)等特點(diǎn)的高通量篩選，且能夠?qū)崿F(xiàn)在4 h以內(nèi)，快速確定病原微生物的檢測(cè)[21-23]，特別是在布氏桿菌、大腸桿菌的檢測(cè)上效果較好. 免疫磁珠分離技術(shù)在微生物等領(lǐng)域得到有效應(yīng)用的同時(shí)，亦有一定的不足之處，在操作過程中涉及到陽性分選法及陰性分選法，在陽性分選法中，需要對(duì)特異性的靶細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，可能引起細(xì)胞活化，在陰性分選法時(shí)，會(huì)需要多種抗體來標(biāo)記不需要的細(xì)胞.

2" 病原微生物分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

近年來，分子生物相關(guān)檢測(cè)技術(shù)在病原微生物檢測(cè)上的應(yīng)用突飛猛進(jìn)，在很大程度上解決了病原微生物檢測(cè)時(shí)限長(zhǎng)、精準(zhǔn)性不高等問題，為病原微生物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展指引了研究方向.

2.1" 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)技術(shù)（PCR）

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種擴(kuò)增DNA片段的特殊技術(shù)，可以看成是一種特殊的分子生物技術(shù)中的DNA復(fù)制技術(shù)，能夠?qū)⑽⒘康腄NA片段大幅度增加. PCR反應(yīng)的特點(diǎn)主要表現(xiàn)在特異性強(qiáng)、靈敏度高以及簡(jiǎn)便快速等方面. 同時(shí)，PCR技術(shù)在病原微生物的檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用也非常廣泛. 有研究顯示[24]，利用多重PCR擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)在低溫儲(chǔ)存的肉類食品進(jìn)行了病原微生物的檢測(cè). 亦有實(shí)驗(yàn)表明[25]，在檢測(cè)蝦米中沙門氏菌的實(shí)驗(yàn)中，PCR檢測(cè)技術(shù)，比傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)所用的時(shí)間大大降低. Agarwal A等[26-27]通過PCR方法檢測(cè)出了食品中的致病微生物沙門氏菌. 同樣，Kim J等[28-29]通過多重PCR方法，檢測(cè)小麥中的病原微生物的污染情況，發(fā)現(xiàn)了鼠傷寒沙門氏菌以及大腸桿菌等，此方法具有很高的特異性，且對(duì)難以辨別的病原微生物具有較好的識(shí)別，當(dāng)然PCR檢測(cè)方法亦有一定的局限性，如只能檢測(cè)微生物的存在，在微生物產(chǎn)生的毒素檢測(cè)方面效果較差，同時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽性或者假陰性結(jié)果.

2.2" 核酸探針檢測(cè)技術(shù)

核酸探針技術(shù)主要是通過核苷酸堿基對(duì)互補(bǔ)的原理，用特異的基因探針對(duì)不同堿基對(duì)，進(jìn)行特異性的識(shí)別，從而檢測(cè)被測(cè)序列. 核酸檢測(cè)探針，一般主要分為傳統(tǒng)及功能化的核酸探針，傳統(tǒng)核酸檢測(cè)探針主要包括克隆探針等[30]，而功能化的探針包括核酶及核酸適配體等. 核酸檢測(cè)技術(shù)在病原體檢測(cè)的應(yīng)用上起到了非常重要的作用.

構(gòu)建雙標(biāo)熒光團(tuán)適配體核酸探針，能夠更好的提高定量檢測(cè)限. 有研究提出了一種基于核酸適配子的赭曲霉毒素A熒光生物傳感器的檢測(cè)方法. 它由核糖核酸酶H輔助的循環(huán)反應(yīng)導(dǎo)致信號(hào)的顯著放大，這使得檢測(cè)下限為0.08 ng/mL. 利用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)赭曲霉毒素A對(duì)赭曲霉毒素B和黃曲霉毒素B1具有較高的選擇性. 在實(shí)際樣品中使用不同濃度的赭曲霉毒素A對(duì)紅酒樣品進(jìn)行了定量驗(yàn)證，回收率范圍為96.1%～107.5%. 該核酸適配子在食品工業(yè)中具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，并且可以通過替代識(shí)別核酸適配子的序列，將其擴(kuò)展到其他毒素的檢測(cè)中[31]. Zhu等人構(gòu)建了基于單壁碳納米管（SWCNTs）的適配體檢測(cè)探針，利用單壁碳納米管的過氧化物酶樣活性和非特異性DNA序列對(duì)這種活性的影響，通過將3種DNA序列（mDNA）進(jìn)行修飾，構(gòu)建了一種比色探針，最終，我們實(shí)現(xiàn)了12例臨床腫瘤患者溶解血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的精確定量，具有良好的臨床應(yīng)用前景[32].

2.3" 基因芯片檢測(cè)技術(shù)

生物芯片又稱基因芯片，是通過微加工技術(shù)，將數(shù)以萬計(jì)一定序列的DNA片段固定在硅片的表面，形成規(guī)律性的DNA探針序列，基因芯片能夠?qū)Σ煌蛄械奈⑸飿悠愤M(jìn)行檢測(cè)，在病原微生物領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用.

有研究顯示[33]，通過基因芯片技術(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌、志賀氏菌等進(jìn)行檢測(cè)，在短時(shí)間（＜8 h）內(nèi)，就能夠得到精準(zhǔn)的檢測(cè)結(jié)果. 亦有研究報(bào)道[34]，將奇異變形桿菌及大腸埃希菌等，同時(shí)進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，在極低的檢測(cè)濃度下，亦能進(jìn)行有效的檢測(cè).

生物基因芯片檢測(cè)技術(shù)是一種微量分析技術(shù)，具有重復(fù)性好、精準(zhǔn)、快速等特點(diǎn)，在臨床研究中亦有很好的應(yīng)用[35].

3" 病原微生物代謝學(xué)檢測(cè)技術(shù)

3.1" 三磷酸腺苷（ATP）生物發(fā)光技術(shù)

ATP生物發(fā)光檢測(cè)法，主要是通過ATP與熒光素酶復(fù)合物結(jié)合，用來測(cè)定食品、醫(yī)藥等中的微生物的總數(shù). 由于每種微生物細(xì)胞中的ATP的具體含量值是一定的，所以供試樣品中的ATP含量與微生物的數(shù)量呈正比，這種測(cè)定技術(shù)能夠在15 s內(nèi)測(cè)定出結(jié)果，靈敏度極高.

有研究報(bào)道[36]，將果蔬切成片狀，制作成供試品的菌液體，檢測(cè)試樣中的ATP的含量，進(jìn)而換算出細(xì)菌數(shù)量，間接性的測(cè)定果蔬中有無病原微生物. 若供試樣品中含有很多非細(xì)胞性的ATP時(shí)，此檢測(cè)方法的應(yīng)用范圍可能受到較大程度的限制[37]. 一般來說，ATP發(fā)光技術(shù)檢測(cè)微生物，可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)、穩(wěn)定、快速檢測(cè)微生物總數(shù)的需求，但設(shè)備比較昂貴，對(duì)儀器的清洗保養(yǎng)要求特別高. 檢測(cè)時(shí)需要預(yù)處理，去除胞外游離的ATP.

3.2" 電阻抗技術(shù)

電阻抗技術(shù)病原微生物檢測(cè)的應(yīng)用中，主要是對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)、脂肪以及碳水化合物的含量進(jìn)行測(cè)量，通過將大分子物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)變成小分子，提高檢測(cè)培養(yǎng)基的導(dǎo)電性變化，改變電阻大小，進(jìn)而測(cè)定其中有無微生物存在，通過此技術(shù)能夠有效測(cè)定樣品中的病原微生物的數(shù)量，在測(cè)定酵母菌、霉菌以及沙門氏菌方面得到了很好的應(yīng)用[38-40]. 此方法與傳統(tǒng)的測(cè)定方法相比，具有時(shí)間短、特異性強(qiáng)以及重現(xiàn)性好等特點(diǎn)[41-42]. 有研究通過對(duì)電阻抗方法與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電阻抗方法共檢測(cè)出119種病原微生物，而傳統(tǒng)的方法僅僅檢測(cè)出92種病原微生物. 當(dāng)然，電阻抗技術(shù)的應(yīng)用還有一些缺陷. 主要是其不能在污染的標(biāo)本中，把可能存在的病原菌同污染菌加以區(qū)別，同時(shí)不能用于較少菌數(shù)的檢測(cè)，而且樣品中不能使用防腐劑，且其在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的過程中工作量較大[43].

3.3" 放射測(cè)量技術(shù)

放射測(cè)量技術(shù)的病原微生物檢測(cè)原理，主要是通過微生物在生長(zhǎng)繁殖的過程中，代謝產(chǎn)生二氧化碳. 通過碳水化合物，把放射性的14 C標(biāo)記原子引入其中，在病原微生物代謝時(shí)，產(chǎn)生放射性的二氧化碳，接著通過測(cè)量14 C標(biāo)記的二氧化碳的量，間接的判定病原微生物的數(shù)量，放射量與菌數(shù)成正比，此測(cè)定方法具有時(shí)效性高、精準(zhǔn)度高等優(yōu)點(diǎn)[44]. 有研究報(bào)道[45]，通過放射量技術(shù)對(duì)食品中的微生物進(jìn)行檢測(cè). 一般來說，放射量檢測(cè)技術(shù)，對(duì)操作人員的要求較高，因在其應(yīng)用過程中，使用了放射性的物質(zhì)，使用上受到了較大限制，目前在大腸桿菌、酵母菌的檢測(cè)項(xiàng)目中應(yīng)用較多.

4" 展望

良好的病原微生物檢測(cè)方法，能夠在很大程度上提高檢測(cè)的高效性，在流行病學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用. 目前針對(duì)仍在全球范圍內(nèi)大流行的新型冠狀病毒的有效檢測(cè)，就顯得尤為重要，其檢測(cè)方法主要包括核酸檢測(cè)（全基因測(cè)序技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等）、免疫檢測(cè)（血清學(xué)檢測(cè)、ELISA、膠體金免疫層析技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法等）、醫(yī)學(xué)影像生物學(xué)檢測(cè)等[46-47].

本文通過闡述病原微生物不同檢測(cè)方法，分析了各種檢測(cè)方法的特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)，同時(shí)分析對(duì)比了不同的檢測(cè)方法之間的差異，詳見表1，旨在為進(jìn)一步開發(fā)新的病原微生物檢測(cè)技術(shù)奠定基礎(chǔ). 隨著人們對(duì)病原微生物的深入了解，依據(jù)微生物特點(diǎn)研發(fā)的各種檢測(cè)設(shè)備儀器，將會(huì)在醫(yī)藥學(xué)、食品行業(yè)等病原微生物檢測(cè)領(lǐng)域廣泛運(yùn)用，為人類健康發(fā)展保駕護(hù)航.

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Research Progress of Pathogenic Microorganism Detection Technology

YIN Wei1， 2， 3， HU Qi2， LI Xinzhang2， ZHANG Shuang3， FAN Gaofu1

（1. School of Bioengineering， Hefei Vocational and Technical College， Hefei 238000， Anhui， China;

2. Chemical Composition Extraction， Separation and Identification Center of Nantong Rui Feng

New Material Technology Co Ltd， Nantong 226000， Jiangsu， China;

3. Department of Polymer Science and Engineering， University of Science and Technology of China，

Chinese Academy of Sciences Key Laboratory of Material Chemistry， Hefei 230026， Anhui， China）

Abstract" Pathogenic microorganisms， as a kind of tiny organisms that can cause pathogenicity to both humans and animals in nature， pose a great threat to human health and are very likely to cause a global pandemic. It is an urgent issue for the majority of medical workers to detect pathogenic microorganisms quickly， accurately and efficiently. This article reviews the detection methods of pathogenic microorganisms from three aspects： immunological detection technology， molecular biological detection technology and pathogenic microbial metabolism detection technology， in order to provide reference for the rapid and effective detection of pathogenic microorganisms.

Keywords" pathogenic microorganisms; immunology; molecular biology; detection technology; research progress