姚梅英 高羅晴 劉欣 王躍群 吳秀山 李永青

摘 要：WBP11是WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白家族的一員，參與前體mRNA剪接過程，是重要的剪接因子。斑馬魚作為重要的模式生物之一，其基因組中含有人類WBP11的同源基因wbp11。為了研究WBP11在脊椎動(dòng)物早期發(fā)育過程中的作用機(jī)制，利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了斑馬魚wbp11基因敲除品系。首先，在wbp11基因的第二個(gè)外顯子上設(shè)計(jì)基因敲除靶位點(diǎn)，體外轉(zhuǎn)錄合成sgRNA，通過顯微注射技術(shù)對(duì)斑馬魚進(jìn)行基因敲除，得到F0代嵌合體斑馬魚。隨后，將嵌合體斑馬魚與野生型斑馬魚雜交，所得到的F1代斑馬魚進(jìn)行基因型鑒定，篩選出其中的雜合子斑馬魚，并對(duì)雜合子斑馬魚的缺失條帶進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示其為wbp11基因的2種缺失突變。讓同種突變的F1代雜合子斑馬魚自交，對(duì)得到的后代F2進(jìn)行基因型鑒定，篩選獲得了純合子斑馬魚，表明wbp11基因敲除品系構(gòu)建成功。經(jīng)顯微鏡白光成像觀察發(fā)現(xiàn)，受精后48 h的斑馬魚出現(xiàn)心包水腫、心臟線性化、骨骼彎曲畸形，這可能是由于wbp11基因突變引起剪接機(jī)制異常所導(dǎo)致的。此研究為探究WBP11基因在脊椎動(dòng)物的早期發(fā)育中的作用機(jī)制開辟了道路。

關(guān)鍵詞：斑馬魚；wbp11；CRISPR/Cas9；基因敲除；雜合子

中圖分類號(hào)：Q341；Q812 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.03.004

Construction of Zebrafish wbp11 Gene Knockout Line

YOU Shiqi1， CHEN Yu2， 3， YANG Xueting1， LI Yunxuan1， QIAO Qing1， LUO Ying1，

YAO Meiying1， GAO Luoqing1， LIU Xin1， WANG Yuequn1， WU Xiushan1， 3， LI Yongqing1?

（1. The Center for Heart Development， State Key Laboratory of Freshwater Fish Development Biology， Hunan Normal University， Changsha 410081， China; 2. Guangdong Cardiovascular Institute， Guangdong Provincial Peoples Hospital， Guangdong Academy of Medical Sciences， Guangzhou 510100， China; 3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenesis， Targeted Prevention and Treatment of Heart Disease， Guangzhou 510100， China）

Abstract： As a member of the WW domain binding protein family， WBP11 is an important splicing factor involved in the pre-mRNA splicing process. Zebrafish， one of the notable model organisms， contains orthological homologous gene wbp11 in its genome. In order to study the mechanism of WBP11 in the early development in vertebrates， a knockout strain of wbp11 in zebrafish was constructed using CRISPR/Cas9 technology. Firstly， gene knockout target sites were designed on the second exon of wbp11 gene， and sgRNA was synthesized by transcription in vitro. After microinjection technology， F0 generation chimeric zebrafish with wbp11-knockout was obtained. Then， the F1 generation zebrafish by crossing chimeric zebrafish with wild-type zebrafish were identified by genotype， and heterozygous zebrafish were screened out. The sequencing results for exact bands of heterozygous zebrafish showed that there were two strains with different sequence deletion. Heterozygous zebrafish of the F1 generation of the same strain were self-crossed. The homozygous zebrafish was screened out via genotyping， meaning the wbp11 gene knockout strain was successfully constructed. The zebrafish with 48 hours post fertilization showed pericardial edema， heart linearization and skeletal curvature obversed by microscopic white light imaging. These defections may be resulted from the abnormal splicing mechanism caused by the deletion of wbp11 gene. This study opens the way to explore the mechanism of WBP11 gene in the early development in vertebrates.

Key words： zebrafish; wbp11; CRISPR/Cas9; gene knockout; heterozygote

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（3）： 217-225）

WW結(jié)構(gòu)域又被稱為Rsp5或 WWP domain，是由30～40個(gè)氨基酸所組成的結(jié)構(gòu)緊密的三股反平行β折板結(jié)構(gòu)域［1］。WW結(jié)構(gòu)域具有特異專一性，能夠與富含脯氨酸序列（XPPXY）的蛋白質(zhì)分子（P：脯氨酸，Y：酪氨酸，X：任意氨基酸）作用，廣泛存在于真核生物中，在蛋白質(zhì)降解、轉(zhuǎn)錄和RNA剪接等多種細(xì)胞功能的調(diào)控中發(fā)揮重要作用［2］。而WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白家族，顧名思義，它們識(shí)別并結(jié)合含有WW結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。其家族成員WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白11（WW domain binding protein 11，WBP11），參與前體mRNA剪接過程［3］。真核生物mRNA成熟前需要在細(xì)胞核中經(jīng)過前體mRNA的剪接加工過程，即前體mRNA在剪接復(fù)合體的作用下，通過精確識(shí)別移除內(nèi)含子并把外顯子進(jìn)行拼接而得到成熟的mRNA，成熟mRNA再轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核在核糖體被翻譯成蛋白質(zhì)［4］?；虻募艚邮侵匾霓D(zhuǎn)錄后調(diào)控，對(duì)于基因的差異表達(dá)、組織器官的發(fā)育調(diào)控以及正常功能的維持具有重要的生理意義［5-7］。WBP11與 E3泛素連接酶PRP19（pre-mRNA processing factor 19）剪接體復(fù)合物相關(guān)，并共定位于富含剪接因子的核斑點(diǎn)［8-10］。該復(fù)合物是一種動(dòng)態(tài)剪接核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）復(fù)合物，負(fù)責(zé)去除非編碼片段、外顯子連接（編碼片段）和調(diào)節(jié)前體mRNA的可變剪接［11-13］。

目前對(duì)于WBP11基因的功能研究非常少。已有研究顯示，在人類和小鼠中，WBP11基因突變會(huì)導(dǎo)致人類出現(xiàn)多種先天性異常，包括先天性心臟病、椎體異常、食道異常、腎臟異常等，該基因突變的小鼠也表現(xiàn)出類似的先天性異常，但未發(fā)現(xiàn)有心臟畸形［14］。對(duì)于WBP11基因在其中的作用機(jī)制還未有研究，也不清楚WBP11突變體在心臟發(fā)育中的不同表現(xiàn)是由于物種差異還是其他原因所致。而作為重要模式生物的斑馬魚wbp11基因是人類和小鼠WBP11基因的直系同源基因，因此，我們首次使用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)斑馬魚的wbp11基因進(jìn)行特異性敲除，以獲得wbp11基因缺陷的突變體斑馬魚，從而為進(jìn)一步探究wbp11基因突變對(duì)斑馬魚早期的生長(zhǎng)發(fā)育所造成的影響以及其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)使用的AB品系野生型斑馬魚（Barchydanio rerio var）由本實(shí)驗(yàn)室繁殖飼養(yǎng)，水溫約28.5℃，采取14 h光照/10 h黑暗光周期，pH值維持在6.8～7.5。斑馬魚胚胎置于E3 Buffer，在28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，4～6 d開始喂食草履蟲（Paramoecium caudatum），12 d開始草履蟲和豐年蝦（Artemia salina）混合喂養(yǎng)，15 d轉(zhuǎn)移到養(yǎng)殖系統(tǒng)中，直至3個(gè)月性成熟，成魚早中晚各喂食1次。

研究所用儀器與試劑：多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀，移液器和分光光度計(jì)（Eppendorf公司）；斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛生科技發(fā)展有限公司）；離心機(jī)（Fresco生物）；凝膠成像分析系統(tǒng)（Tanon公司）；恒溫培養(yǎng)搖床（HZQ-A）（江蘇太倉(cāng)儀器設(shè)備）；表型分析多倍顯微鏡（奧林巴斯公司）；倒置熒光體視鏡（蔡司公司）；拉針儀（narishige）；pH計(jì)（320-S）（Barnstead）；顯微注射儀（PLI-100A）（Harvard Apparatus）；精度分析天平（舜宇恒平）；DEPC水（0.1% DEPC溶于去離子水中）；E3 Buffer（5 mol/L NaCl溶液60 mL，1 mol/L KCl溶液10 mL，1 mol/L MgSO4 20 mL，CaCl2 2.94 g，甲基藍(lán)精粉1.00 g，去離子水定容至600 mL）；LB培養(yǎng)基（luria-bertani medium，肉湯培養(yǎng)基）（胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，固體培養(yǎng)基則再加15 g瓊脂，去離子水定容至1 L）；2.0%瓊脂糖膠（2 g瓊脂糖，100 mL去離子水）；TrueCut? Cas9 蛋白（Thermo Fisher）；T7轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司）；pMD?18-T Vector Cloning Kit（寶生生物公司）；RNA提取試劑盒（迅捷生物公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（蘭博利德公司）；純化試劑盒（OMEGA公司）。

1.2 設(shè)計(jì)sgRNA靶位點(diǎn)

在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中找到斑馬魚wbp11基因組序列（Gene ID： 402950），并通過Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)wbp11基因組進(jìn)行分析，選擇靶位點(diǎn)。靶位點(diǎn)引物序列與T7啟動(dòng)子序列以及guide RNA（gRNA）骨架連接，以帶有g(shù)RNA骨架的p42250酶切后的產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增wbp11 sgRNA。用primer 5.0軟件根據(jù)sgRNA的位置設(shè)計(jì)鑒定引物和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）引物。本試驗(yàn)涉及的引物序列見表1。

1.3 靶位點(diǎn)sgRNA的PCR擴(kuò)增與回收

p42250質(zhì)粒經(jīng)Bsa I酶切線性化后純化作為擴(kuò)增模板，構(gòu)建50 μL的PCR體系（其中2×buffer 25 μL，sgRNA-F/sgRNA-R均2 μL，線性化的p42250模板2 μL，dNTP各1 μL，ddH2O補(bǔ)齊至50 μL）進(jìn)行擴(kuò)增，依照Rapid Taq Master Mix設(shè)置常規(guī)PCR程序，退火溫度為60℃，延伸時(shí)間為15 s，設(shè)置30～35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用純化試劑盒回收。

1.4 sgRNA的轉(zhuǎn)錄合成與純化回收

純化后的sgRNA產(chǎn)物利用T7轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，全程注意RNA-free操作，取1 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（200 V）快速檢測(cè)，確認(rèn)轉(zhuǎn)錄成功后進(jìn)行RNA純化，并測(cè)定其濃度。

1.5 顯微注射

注射的前天晚上，喂食10 min后將雌魚和雄魚按1：1或2：1的比例放入雜交缸中，用擋板隔開，10 h暗處理后，光照20 min，抽出擋板并給予強(qiáng)光刺激，在產(chǎn)卵后10 min后開始收集1細(xì)胞時(shí)期的胚胎，并排列在注射皿上注射sgRNA和Cas9蛋白的混合樣品（注射配比體系分別為100 ng/μL、250 ng/μL），之后將胚胎置于E3 Buffer中，28.5℃恒溫培養(yǎng)，每天換水2次并及時(shí)處理死胚胎，以免滋生霉菌。

1.6 斑馬魚基因組提取與鑒定

3個(gè)月性成熟后，分別剪取未注射的野生型（wild-type，WT）斑馬魚和注射魚成魚的尾鰭，使用堿裂解法提取斑馬魚基因組，魚尾鰭置于1.5 mL EP管中，加入90 μL濃度為50 mmol/L NaOH，沸水浴10 min，振蕩離心；加入10 μL（1/10 NaOH）pH=8.0的Tris-HCl，1 200 r/min離心5 min；吸取上清作為PCR模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。

1.7 TA克隆

將純化后的目的PCR產(chǎn)物與pMD18-T連接，在1.5 mL的EP管中營(yíng)造反應(yīng)體系（其中pMD18-T Vector 1 μL，模板1～3 μL，Solution Ⅰ 5 μL，ddH2O補(bǔ)齊至10 μL），16℃處理2 h或4℃過夜，轉(zhuǎn)化涂布LB氨芐固體培養(yǎng)基平板并在37℃培養(yǎng)12～16 h。

1.8 qRT-PCR

利用試劑盒提取受精后48 h（48 hours post fertilization，48 hpf）斑馬魚的總RNA，隨后將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照說明書提供的體系與程序進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，選取gapdh作為內(nèi)參基因，將wbp11基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，再利用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.9 顯微鏡觀察

分別收集48 hpf的WT和顯微注射的斑馬魚幼魚，使用一次性吸管轉(zhuǎn)移幼魚至載玻片，在蔡司倒置熒光顯微鏡下觀察，可用注射器針頭撥動(dòng)使幼魚側(cè)邊身體向上，拍攝記錄斑馬魚的機(jī)體發(fā)育情況。

2 結(jié)果分析

2.1 wbp11基因敲除靶位點(diǎn)的確定

首先，根據(jù)在NCBI和Ensembl網(wǎng)站的信息分析發(fā)現(xiàn)，wbp11基因包含9個(gè)外顯子，第一個(gè)外顯子序列太短，無法設(shè)計(jì)基因敲除靶位點(diǎn)，因此選擇位于wbp11基因編碼序列的第二個(gè)外顯子設(shè)計(jì)敲除靶位點(diǎn)。其上游引物命名為sgRNA-F，下游引物命名為sgRNA-R，靶位點(diǎn)長(zhǎng)20 bp（圖1）。

2.2 wbp11基因敲除sgRNA的合成

以純化的線性化p42250質(zhì)粒片段為PCR模板擴(kuò)增目的片段，純化PCR產(chǎn)物后進(jìn)行RNA體外轉(zhuǎn)錄，純化后的sgRNA片段為100 bp左右，與預(yù)期相符（圖2）。

2.3 wbp11基因敲除有效性鑒定及F0代突變等位基因嵌合體成年斑馬魚的篩選

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的敲除靶位點(diǎn)為20 bp，鑒定引物在野生型斑馬魚中擴(kuò)增出的目的片段大小為378 bp，理論上敲除后的目的條帶在358 bp左右，但由于CRISPR/Cas9產(chǎn)生的靶位點(diǎn)切口會(huì)觸發(fā)斑馬魚體內(nèi)的修復(fù)機(jī)制來進(jìn)行修復(fù)，并且這種修復(fù)是隨機(jī)的、不確定的，因此小于378 bp的條帶都是陽(yáng)性結(jié)果。電泳結(jié)果如圖3所示：泳道1、3只有378 bp單一條帶，為野生型；泳道2、4除了目的條帶，還出現(xiàn)了比目的條帶小且較近的亮度微弱的條帶，說明敲除是有效的。

將F0代胚胎培養(yǎng)至3個(gè)月性成熟后，進(jìn)行鑒定。部分瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖4所示：泳道1、2、7只有378 bp的單一條帶，無敲除效果；但是泳道3、4、5、6、8、9中在目的條帶的下方還出現(xiàn)了一條亮度微弱的條帶，顯示敲除成功，獲得F0代突變等位基因嵌合體斑馬魚。

2.4 wbp11突變等位基因的TA克隆和Sanger測(cè)序分析及wbp11突變等位基因雜合斑馬魚的篩選

由于F0代的成魚是嵌合體，所產(chǎn)生的基因突變不一定能夠遺傳給后代，因此，需要進(jìn)一步的鑒定wbp11突變等位基因雜合胚胎即F1代胚胎的遺傳有效性。部分鑒定結(jié)果如圖5所示：泳道1在目的條帶下面還有一條與目的條帶亮度均等的條帶，顯示為雜合胚胎；泳道2、3、4、5、6、7、8、9、10、11只有目的條帶，顯示為未突變胚胎。這表明F0產(chǎn)生的突變能夠穩(wěn)定遺傳。

待F1代斑馬魚長(zhǎng)至3個(gè)月后進(jìn)行鑒定。部分鑒定結(jié)果如圖6所示：泳道1、2、3、4、5、6、10、13、15只有野生型條帶，顯示為野生型斑馬魚；泳道7、8、9、11、12、14除了目的條帶之外，還有一條小于野生型且亮度均等的條帶，顯示為雜合子斑馬魚。

為了確認(rèn)wbp11基因敲除的條帶的實(shí)際大小，本試驗(yàn)將上述顯示敲除成功的雜合子（泳道7、8、9、11、12、14）的缺失條帶送往公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。測(cè)序結(jié)果比對(duì)顯示：泳道7、9為同一種類型缺失，缺失片段為27 bp（圖7a）；而泳道8、11、12、14為另一種類型缺失，缺失片段也為27 bp（圖7b），只是缺失的位點(diǎn)不同。最終在F1代斑馬魚中篩選出了2種不同類型的基因突變品系。

缺失片段均為27 bp，對(duì)缺失序列進(jìn)行了序列分析，如圖8所示，2個(gè)突變品系缺失27 bp后，均能導(dǎo)致后續(xù)翻譯移碼，蛋白質(zhì)不能正常翻譯。這表明構(gòu)建的敲除品系缺失為有效缺失。

2.5 wbp11基因突變體純合子的篩選及mRNA

表達(dá)量的檢測(cè)

為了構(gòu)建完整的斑馬魚基因敲除品系，將上述F1成魚進(jìn)行雜交得到F2代，并鑒定篩選其中的純合突變體斑馬魚。以突變品系1為例，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖9所示，泳道4、5、6、8、9、10、11、15、18為野生型斑馬魚，而泳道1、3、7、12、13、14、16、17、19、20為wbp11基因突變等位基因雜合斑馬魚，泳道2、21為wbp11突變等位基因純合斑馬魚。此21條wbp11突變等位基因雜合斑馬魚自交所產(chǎn)生的F2后代中有9條野生型、10條突變雜合斑馬魚和2條突變純合斑馬魚，表明wbp11基因敲除品系構(gòu)建成功。

隨后檢測(cè)了wbp11基因在野生型斑馬魚和突變品系1純合突變斑馬魚中的表達(dá)量，結(jié)果如圖10所示，純合突變斑馬魚wbp11基因的表達(dá)量極其低下，表明基因敲除成功。

2.6 wbp11基因突變純合斑馬魚呈現(xiàn)心臟、骨骼畸形

2種突變品系所表現(xiàn)出來的缺陷表型高度一致，選取突變品系1的wbp11-/-和野生型斑馬魚進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)該基因的突變導(dǎo)致胚胎發(fā)育到48 hpf時(shí)出現(xiàn)明顯異常。白光成像側(cè)面圖（圖11）顯示，wbp11-/-斑馬魚出現(xiàn)心臟線性化、心包水腫、骨骼彎曲等畸形。

3 討論

已有研究顯示，WBP11基因敲低影響非洲爪蟾胚胎的早期發(fā)育，其中胚層標(biāo)記WNT8、FGF4和CDX4的表達(dá)減少［15］。但對(duì)于WBP11基因在早期發(fā)育中的作用機(jī)制還未有報(bào)道。另有研究顯示，人類WBP11基因突變會(huì)導(dǎo)致先天性心臟病的發(fā)生，而小鼠的wbp11突變純合子胚胎出生后致死，雜合突變體胚胎出現(xiàn)脊椎、腎臟和食道的缺陷，腦部體積減少，但未觀察到心臟畸形［14］。因此，無法通過小鼠模型來研究wbp11基因的突變對(duì)于小鼠心臟發(fā)育的影響。而斑馬魚作為模式生物，所產(chǎn)下的胚胎光學(xué)透明，可以定時(shí)定點(diǎn)地觀察特定發(fā)育窗口期間斑馬魚胚胎的心臟形態(tài)、血液流動(dòng)等發(fā)育情況［16-18］。并且，斑馬魚基因與人類基因具有70%的同源性［19-20］，除了研究胚胎發(fā)育外，還能夠利用斑馬魚模型建立如肝癌發(fā)生［21］、遺傳性肌肉疾病［22］、神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?3］、心血管疾?。?4-25］等多種人類疾病模型。因此，選擇利用斑馬魚構(gòu)建wbp11基因敲除品系，能為人類先天性心臟疾病提供可能的疾病動(dòng)物模型，也能為查明WBP11基因在不同脊椎動(dòng)物中是否發(fā)揮不同作用提供研究材料。

CRISPR/Cas9技術(shù)由于其簡(jiǎn)便、高效，已廣泛應(yīng)用于基因敲除品系的構(gòu)建［26-27］。本試驗(yàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除效率高、能穩(wěn)定遺傳的特點(diǎn)構(gòu)建了斑馬魚wbp11基因敲除品系。在構(gòu)建品系的過程中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)0代嵌合體測(cè)交后代中出現(xiàn)少量心臟畸形的胚胎。鑒定結(jié)果顯示，畸形胚胎均為wbp11基因雜合突變體。檢測(cè)F1代自交后代時(shí)，其野生型：雜合子：純合子的比例約為5：5：1，較正常情況下1：2：1的比例相差較遠(yuǎn)，顯示雜合子和純合子成魚的數(shù)量都明顯較少。但在前期并未觀察到胚胎或幼魚大量死亡，也未發(fā)現(xiàn)純合致死現(xiàn)象，推測(cè)可能是由于在胚胎發(fā)育早期，斑馬魚是通過擴(kuò)散作用從水中吸收氧氣，而不是依賴心血管提供氧氣，即使是心血管嚴(yán)重異常的斑馬魚也能在整個(gè)胚胎發(fā)育和幼魚階段存活［28］，直到發(fā)育后期，wbp11基因突變對(duì)斑馬魚早期胚胎發(fā)育所造成的影響才顯現(xiàn)出來。因此并未在早期發(fā)現(xiàn)大量的胚胎死亡，但隨著幼魚的進(jìn)一步發(fā)育，幼魚死亡數(shù)量增多，所得到的純合子和雜合子成魚數(shù)量均不符合孟德爾遺傳定律。

48 hpf時(shí)期的斑馬魚心房、心室發(fā)育完成，可自由游泳，此時(shí)能更好地觀察斑馬魚的心臟和骨骼形態(tài)［29］。在wbp11基因敲除的2個(gè)突變品系中，均觀察到48 hpf的斑馬魚幼魚出現(xiàn)心包水腫、心臟線性化、骨骼彎曲等畸形，這表明，wbp11基因突變干擾了斑馬魚的早期胚胎發(fā)育，尤其是心臟發(fā)育。由此推測(cè)，wbp11基因突變后，斑馬魚心臟和骨骼發(fā)育相關(guān)基因的RNA剪接受到了影響，從而造成某些重要基因無法正常的轉(zhuǎn)錄翻譯，繼而影響了心臟、骨骼的發(fā)育。但在斑馬魚中并未觀察到如小鼠一般的wbp11基因突變純合致死的情況，推測(cè)可能是因?yàn)閣bp11的主要功能是參與前體mRNA剪接，但組成剪接體并參與剪接的蛋白質(zhì)并非wbp11一種，機(jī)體的剪接機(jī)制并未完全廢除，可能在斑馬魚中存在某種還未發(fā)現(xiàn)的剪接代償機(jī)制。WBP11（wbp11）基因在不同物種中所表現(xiàn)出的缺陷表型不一致，也有可能是由于物種差異性所引起的。而對(duì)于wbp11如何影響斑馬魚的心臟、骨骼發(fā)育的作用機(jī)制，是否還影響了其他器官的發(fā)育以及機(jī)體的剪接機(jī)制是否出現(xiàn)異常還有待后續(xù)的深入研究。

總之，本試驗(yàn)所構(gòu)建的斑馬魚wbp11基因敲除品系為后續(xù)探究wbp11基因突變影響斑馬魚早期胚胎發(fā)育的作用機(jī)制打下了基礎(chǔ)。

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