朱旭東 楊蘭鋒 陳媛媛 侯澤豪,2 羅旖柔 熊澤浩 方正武,*

甜蕎基因克隆及抗旱功能解析

朱旭東1楊蘭鋒1陳媛媛1侯澤豪1,2羅旖柔1熊澤浩1方正武1,*

1長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院/ 主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 湖北荊州 434025;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081

SGT1 (suppressor of the G2 allele of skp1)作為skp1-4的抑制因子, 在植物的非生物脅迫響應(yīng)中具有重要作用。根據(jù)甜蕎干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析, 我們克隆出一個(gè)與甜蕎耐旱性狀相關(guān)的候選基因。生物信息學(xué)分析表明包含一個(gè)1086 bp開(kāi)放閱讀框(ORF), 編碼361個(gè)氨基酸, 具有3個(gè)(TPR、CS和SGS)保守結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析表明, FeSGT1與藜麥CqSGT1 (XP_021726759.1)、甜菜BvSGT1 (XP_010671588.1)和菠菜SoSGT1 (XP_021839743.1)親緣關(guān)系較近。亞細(xì)胞定位初步顯示FeSGT1蛋白定位于細(xì)胞膜上。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫24 h內(nèi)表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。在鹽、低溫(4℃)脅迫和ABA處理下,基因表達(dá)在12 h達(dá)到高峰, 24 h后開(kāi)始下降。在擬南芥中過(guò)表達(dá)基因發(fā)現(xiàn), 在干旱和鹽脅迫下, 轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)芽率、根長(zhǎng)、鮮重和存活率顯著提高, 丙二醛(MDA)和過(guò)氧化氫(H2O2)含量明顯降低, 而過(guò)氧化氫酶(CAT)活性顯著升高。過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐旱和耐鹽能力, 為深入研究基因調(diào)控甜蕎抗旱分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

甜蕎;; 轉(zhuǎn)基因擬南芥; 抗旱性

蕎麥?zhǔn)橇慰?Polygonaceae)蕎麥屬()的一種藥食兩用型作物, 具有生育期短、抗逆性強(qiáng)和適應(yīng)性廣等特點(diǎn)[1], 但其根系不發(fā)達(dá), 因此, 干旱成為了制約蕎麥生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素之一[2]。目前已報(bào)道的甜蕎耐旱基因主要包括轉(zhuǎn)錄因子、離子轉(zhuǎn)運(yùn)類基因和分子伴侶三大類。研究表明, CBF/DREB轉(zhuǎn)錄因子家族基因受干旱脅迫誘導(dǎo), 在干旱脅迫下可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的萌發(fā)率, 并通過(guò)介導(dǎo)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱性[3]。Na+/H+交換系統(tǒng)NHX家族基因可通過(guò)調(diào)節(jié)蘆丁的生物合成途徑增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因蕎麥的耐旱和耐鹽性[4]。此外, 研究發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下HSP70和HSP90伴侶蛋白的積累, 能夠保護(hù)甜蕎花的正常發(fā)育, 提高植株的耐旱性[5]。因此, 挖掘耐旱基因?qū)ε嘤齼?yōu)良抗逆性蕎麥品種和解析蕎麥響應(yīng)干旱脅迫的分子調(diào)控機(jī)制具有重要的意義。

干旱、高鹽等非生物脅迫是影響作物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的重要因素[6]。干旱導(dǎo)致植物脫水和滲透失衡[7], 干擾土壤養(yǎng)分有效性[8]。鹽脅迫主要導(dǎo)致植物發(fā)生生理干旱和離子毒害[9-10]。因此, 滲透應(yīng)激和氧化應(yīng)激成為了干旱和鹽脅迫的常見(jiàn)防御機(jī)制。干旱引起的滲透應(yīng)激有利于最大限度地減少氣孔和角質(zhì)層的水分流失和最大限度地增加水分吸收[11]。在鹽脅迫中, 滲透調(diào)節(jié)在維持滲透穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[12]。此外, 基因表達(dá)調(diào)控作為植物逆境響應(yīng)的一部分, 也涉及大量基因轉(zhuǎn)錄水平的變化[13]。SGT1作為一類共伴侶蛋白[14-15], 與、、和等抗逆基因形成蛋白復(fù)合物, 主要參與SCF E3泛素連接酶依賴的信號(hào)通路、LRR蛋白的折疊以及介導(dǎo)植物對(duì)生長(zhǎng)素(IAA)和茉莉酸(JA)等激素的反應(yīng), 在植物的非生物脅迫響應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用[16]。

SGT1在真核生物中高度保守, 參與調(diào)控著絲粒的裝配, 并調(diào)節(jié)泛素對(duì)靶蛋白的修飾, 位于不同應(yīng)激反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)的交叉位置上, 參與不同應(yīng)激相關(guān)調(diào)控基因的信號(hào)傳導(dǎo)途徑[17]。研究發(fā)現(xiàn)植物SGT1蛋白一般由5個(gè)結(jié)構(gòu)域組成: SGT1特異性基序(SGS)、四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域(TPR)、兩個(gè)可變區(qū)域(VR1和VR2)和CS基序[14]。其中, SGS基序與HSP70相互作用[18], TPR區(qū)與HSP90發(fā)生互作[19], CS基序則可以和RAR1的CHORDⅡ基序發(fā)生互作[20], 從而在蛋白折疊和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮調(diào)控作用。研究表明, SGT1能夠增強(qiáng)植物的抗氧化系統(tǒng)和調(diào)節(jié)滲透平衡[17]。在甘藍(lán)中發(fā)現(xiàn)BolSGT1與HSC70-1、ATHSP90.1、SRFR1、PBS2、RPM1和AFB5等調(diào)控因子構(gòu)成一個(gè)相互作用網(wǎng)絡(luò), 提高了植株對(duì)高溫、低溫、干旱、鹽和ABA脅迫適應(yīng)性[21]。在水稻中發(fā)現(xiàn)可參與褪黑激素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), 提高了等抗氧化系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá), 從而改善干旱脅迫適應(yīng)性[22]。在大豆中SGT1蛋白與RAR1和HSP90之間相互作用, 參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的滲透穩(wěn)態(tài), 提高了植株的耐旱和耐鹽性[23]。在擬南芥中SGT1與胞質(zhì)熱激同源蛋白70(HSC70)結(jié)合, 參與蛋白質(zhì)的組裝和折疊, 從而增強(qiáng)了植株的高溫耐受性[24]。SGT1還參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育[17]。在番茄中, 用VIGS (virus- induced gene silencing)沉默基因后, 導(dǎo)致植株株高變矮, 根尖莖分生組織壞死[25]。而這種現(xiàn)象是由于突變體植株中生長(zhǎng)素(IAA)和茉莉酸(JA)等植物激素的生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被破壞[26]。SGT1還通過(guò)調(diào)節(jié)SCF E3連接酶等26S蛋白酶體介導(dǎo)的信號(hào)通路, 來(lái)參與到植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中[27-28]。本研究根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組分析[29], 從甜蕎中克隆到一個(gè)響應(yīng)干旱脅迫的基因, 在確定了該基因的亞細(xì)胞定位及干旱脅迫下的表達(dá)模式后, 通過(guò)在擬南芥中超表達(dá)基因來(lái)進(jìn)一步探討該基因的抗旱性功能, 為深入研究基因參與調(diào)控甜蕎抗旱分子機(jī)制, 挖掘新耐旱基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 FeSGT1基因克隆與序列分析

使用EASY spin plant RNA Extraction Kit (Aidlab, 中國(guó))試劑盒從甜蕎品種西農(nóng)9976葉片中提取總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa, 日本)合成第一鏈cDNA。以Fes_sc0000108.1.g000012.aua.1序列為參考序列設(shè)計(jì)特異性引物(表1)擴(kuò)增的全長(zhǎng)編碼區(qū)。在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在線網(wǎng)站中進(jìn)行blast比對(duì), 確定序列的同源性。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索不同植物SGT1蛋白序列, 使用MEGA 7.0軟件(Kumar, STempe, 美國(guó))構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。使用DNAMAN軟件(Lynnon Biosoft, San Ramon, 美國(guó))進(jìn)行SGT1的多序列比對(duì)分析。最后使用Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)在線網(wǎng)站分析FeSGT1蛋白的3D結(jié)構(gòu)。

1.2 亞細(xì)胞定位

利用雙酶切的方法將無(wú)終止密碼子的的CDS序列融合到GFP的N端區(qū)域。將重組質(zhì)粒PHZM27--通過(guò)農(nóng)桿菌(GV3101)侵染法轉(zhuǎn)化到煙草葉片中。以空PHZM27質(zhì)粒為對(duì)照。轉(zhuǎn)化的煙草植株在24℃下培養(yǎng)2～3 d后, 使用激光共聚焦顯微鏡(TCS SP8, 徠卡, 德國(guó))觀察煙草葉片中的綠色熒光信號(hào)。

1.3 非生物脅迫下的定量分析

甜蕎(西農(nóng)9976)種子經(jīng)0.1% HgCl2消毒5 min, 用蒸餾水洗滌3次后, 在玻璃培養(yǎng)皿(直徑15 cm, 每培養(yǎng)皿30株)中水培生長(zhǎng)。在16 h/8 h (光/暗, 25℃/ 15℃)的光周期和60%的相對(duì)濕度條件下, 將萌發(fā)的幼苗轉(zhuǎn)移到人工氣候培養(yǎng)箱條件下繼續(xù)培養(yǎng)(寧波科技有限公司, 中國(guó)寧波)。對(duì)培養(yǎng)15 d的甜蕎幼苗進(jìn)行脅迫處理, 將幼苗分別置于4℃的人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行低溫處理, 將幼苗分別轉(zhuǎn)移到含有15% PEG-6000、200 μmol L–1ABA和200mmol L–1NaCl溶液中進(jìn)行干旱、ABA和鹽處理[30], 在處理后的0、3、6、12、24和48 h進(jìn)行取樣, 立即用液氮冷凍, 并在–80℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

提取不同脅迫處理的樣品的總RNA, 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用Primer 5.0設(shè)計(jì)的qRT- PCR特異性引物,(HQ398855.1)作為內(nèi)參基因(表1)。使用TB Green (TaKaRa)試劑盒在CFX 96實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(BioRad, 美國(guó))上進(jìn)行qRT-PCR分析。PCR擴(kuò)增體積為20 μL, 含約100 ng cDNA模板, 每條引物0.6 μL, PCR混合液10 μL (2×)。反應(yīng)程序?yàn)?在95℃ 30 s; 95℃ 10 s (40×); 55℃ 30 s。設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù), 使用2–??Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列匯總

1.4 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性植株鑒定

利用雙酶切的方法將的全長(zhǎng)CDS融合到空載體pBI121 (BD Biosciences Clontech)中。構(gòu)建的35S::重組質(zhì)粒和pBI121空質(zhì)粒(WT)分別通過(guò)農(nóng)桿菌浸花法轉(zhuǎn)化到野生型擬南芥(Columbia-0)中, 共侵染2次, 每次間隔7 d, 待成熟后收獲種子。種子經(jīng)消毒滅菌后, 播種在含有35 μg mL–1卡那霉素(kanamycin)的固體1/2 MS培養(yǎng)基上, 4℃培養(yǎng)3 d后, 轉(zhuǎn)移到25℃的光周期為16 h光照/8 h黑暗的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d, 移栽到土壤中。設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行PCR鑒定來(lái)篩選陽(yáng)性植株(表1)。最后選擇3個(gè)過(guò)表達(dá)純合T3轉(zhuǎn)基因品系(OE株系)和用pBI121空質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因的純合T3株系作為野生型(WT)對(duì)照進(jìn)行后續(xù)的生理生化分析。

1.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的非生物脅迫處理

將3個(gè)OE株系和WT的T3代種子播種在添加200 mmol L–1甘露醇、300 mmol L–1甘露醇、100 mmol L–1NaCl和125 mmol L–1NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。種子先在4℃放置72 h后轉(zhuǎn)移到25℃ (60%相對(duì)濕度)的光周期為16 h光照/8 h黑暗的人工培養(yǎng)箱中。待胚根從種皮伸出1 mm時(shí)開(kāi)始統(tǒng)計(jì)發(fā)芽情況, 共統(tǒng)計(jì)5 d, 并計(jì)算發(fā)芽率。為了進(jìn)行根生長(zhǎng)試驗(yàn), 將5日齡的幼苗轉(zhuǎn)移到添加200 mmol L–1甘露醇、300 mmol L–1甘露醇、100 mmol L–1NaCl和125 mmol L–1NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d, 然后測(cè)量總根長(zhǎng)和鮮重。以1/2MS培養(yǎng)基為對(duì)照, 所有實(shí)驗(yàn)包含3個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。

選擇3周齡的OE株系和WT擬南芥植株進(jìn)行盆栽條件下的干旱和鹽脅迫處理。干旱脅迫通過(guò)于22℃生長(zhǎng)條件下為期2周不澆灌進(jìn)行, 并計(jì)算各株系的存活率。鹽脅迫則使用250 mmol L–1NaCl溶液灌溉3周齡的幼苗, 每周澆灌100 mL, 直到分別在WT和OE株系植物之間觀察到顯著差異, 照相并統(tǒng)計(jì)存活率, 所有實(shí)驗(yàn)包含3個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。

1.6 MDA、CAT和H2O2的檢測(cè)

分別在干旱處理2周和鹽處理1周后, 對(duì)擬南芥葉片進(jìn)行取樣。擬南芥葉片中的MDA、H2O2含量和CAT活性按照試劑盒(Cominbio, 中國(guó)蘇州)分別進(jìn)行檢測(cè)。每次測(cè)量包括3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 FeSGT1基因鑒定及序列比對(duì)分析

采用同源克隆技術(shù), 獲得的全長(zhǎng)CDS序列, 包含一個(gè)1086 bp的開(kāi)放閱讀框, 編碼361個(gè)氨基酸, 與CqSGT1 (XP_021726759.1)具有77.41%相似性, 將其命名為, GenBank登錄號(hào)為MW145503。根據(jù)預(yù)測(cè)的氨基酸序列分析, FeSGT1包含3個(gè)(TPR、CS和SGS)保守結(jié)構(gòu)域(圖1-A)。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示, FeSGT1蛋白與藜麥SGT1 (XP_ 021726759.1)、甜菜SGT1 (XP_010671588.1)和菠菜SGT1 (XP_021839743.1)親緣關(guān)系較近(圖1-B)。FeSGT1的3D結(jié)構(gòu)顯示僅存在多個(gè)α-螺旋和β鏈結(jié)構(gòu)(圖1-C)。

2.2 亞細(xì)胞定位分析

為了研究FeSGT1的亞細(xì)胞定位, 將含有FeSGT1-GFP融合蛋白的重組質(zhì)粒通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)方法侵染煙草葉片, 使用激光共聚焦顯微鏡觀察葉片中綠色熒光蛋白的表達(dá)。GFP蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上表達(dá), 而僅在細(xì)胞膜中檢測(cè)到FeSGT1-GFP融合蛋白的綠色熒光信號(hào)(圖2), 表明FeSGT1定位在細(xì)胞膜上。

圖1 甜蕎FeSGT1的鑒定和結(jié)構(gòu)分析

A: FeSGT1與其他植物SGT1蛋白的多重比對(duì); B: FeSGT1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析; C: FeSGT1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

A: multiple alignment of FeSGT1 with other plant SGT1 proteins; B: Phylogenetic tree analysis of FeSGT1 protein; C: 3D structure analysis of FeSGT1 protein.

2.3 FeSGT1基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式分析

通過(guò)qRT-PCR分析基因在低溫(4℃)、鹽(200 mmol L–1NaCl)、干旱(15% PEG-6000)脅迫和200 μmol L–1ABA處理下的表達(dá)模式。結(jié)果顯示, 干旱、鹽、低溫和ABA均誘導(dǎo)了的表達(dá)(圖3-A, B)。干旱脅迫下,在甜蕎葉片中的轉(zhuǎn)錄水平在24 h內(nèi)緩慢增加, 且幅度很小, 48 h后逐漸降低(圖3-A)。在鹽、低溫和ABA處理下, 轉(zhuǎn)錄在12 h達(dá)到峰值, 24 h后開(kāi)始下降(圖3-A)。然后, 根部中的轉(zhuǎn)錄水平與葉中存在較大差異。在根部中, 干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄在48 h內(nèi)持續(xù)增加, 48 h的表達(dá)量為對(duì)照的20.8倍。在鹽脅迫和ABA處理下, 轉(zhuǎn)錄水平在3 h達(dá)到峰值, 6 h后持續(xù)下降, 且轉(zhuǎn)錄水平低于對(duì)照。而低溫脅迫下, 根部中的轉(zhuǎn)錄情況與葉片中大致相同。推測(cè)參與了不同的脅迫應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路, 并在增強(qiáng)植物的抗非生物脅迫方面發(fā)揮作用。

圖2 FeSGT1的亞細(xì)胞定位

FeSGT1蛋白在煙草葉片中的亞細(xì)胞定位。綠色表示GFP信號(hào), 紅色表示葉綠體自身熒光。

Subcellular localization of FeSGT1 protein in tobacco leaves. The green indicates GFP signals, and the red indicates chloroplast autofluorescence.

*、**分別表示在0.05和0.01概率水平差異顯著。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD (= 3)

* and ** indicate significantly different at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively. The error bars indicate ± SD (= 3).

2.4 過(guò)表達(dá)FeSGT1增強(qiáng)擬南芥的耐旱性

選擇3個(gè)獨(dú)立的過(guò)表達(dá)純合T3轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行干旱脅迫下的表型分析。結(jié)果表明, WT與OE株系的發(fā)芽率無(wú)顯著差異(圖4-A, B)。在200 mmol L–1甘露醇處理下, WT和OE株系的萌發(fā)均受到抑制, 但轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)率顯著高于WT (圖4-A, B)。300 mmol L–1甘露醇處理對(duì)WT和OE系的發(fā)芽率的抑制程度更大。其中, OE株系第5天的發(fā)芽率約為85%, 顯著高于WT的發(fā)芽率(約56%) (圖4-A, B)。根系生長(zhǎng)測(cè)定發(fā)現(xiàn), 對(duì)照組的根長(zhǎng)和鮮重均無(wú)顯著差異(圖4-C, D)。在200 mmol L–1甘露醇處理下, WT和OE株系植株的生長(zhǎng)均受到抑制; 然而, OE株系比WT表現(xiàn)出更小的生長(zhǎng)抑制, 具有更長(zhǎng)的根和更高的鮮重(圖4-C, D)。在300 mmol L–1甘露醇中的結(jié)果與200 mmol L–1甘露醇處理結(jié)果相似, 但擬南芥植株的生長(zhǎng)受到更為嚴(yán)重的抑制(圖4-C, D)。

A: 干旱脅迫下WT和OE株系的種子萌發(fā)分析。B: 干旱脅迫下WT和OE株系的發(fā)芽率; 計(jì)算后5 d的發(fā)芽率。C: 干旱脅迫下WT和OE株系的根長(zhǎng)測(cè)定。D: 干旱脅迫下WT和OE株系的總根長(zhǎng)和鮮重; *表示在0.05概率水平差異顯著。

A: seed germination assays of WT and OE lines under drought stress. B: the germination rates of WT and OE lines under drought stress; the germination rate was calculated for the next 5 days. C: root length assays of WT and OE lines under drought stress. D: The total root lengths and fresh weights of WT and OE lines under drought stress; * indicates significantly different at the 0.05 probability level.

為了檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱性, 將3周齡的擬南芥盆栽植株進(jìn)行干旱處理。結(jié)果表明, 干旱處理前, WT與OE株系在形態(tài)上無(wú)顯著差異。干旱處理后, 轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性顯著提高, 而WT植株嚴(yán)重枯萎, 轉(zhuǎn)基因植株的存活率顯著高于WT (圖5-A, B)。通過(guò)對(duì)過(guò)表達(dá)擬南芥中MDA和H2O2的含量以及CAT的活性進(jìn)行測(cè)定, 發(fā)現(xiàn)OE株系的MDA和H2O2含量及CAT活性顯著高于WT (圖5-C, D, E)。

圖5 FeSGT1基因的異位表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性

A: 干旱脅迫下3周齡WT和OE株系的表型分析。B: 復(fù)水7 d后WT和OE株系在干旱條件下的存活率。C～E: 對(duì)照和干旱處理下WT和OE株系的MDA (C) H2O2(D)含量和CAT (E)活性。*、**分別表示在0.05 和0.01概率水平差異顯著。

A: phenotypes of 3-week-old WT and OE lines under drought stress. B: the survival rates of WT and OE lines under drought condition was monitored 7 days after rewatering. C–E: the physiological indicators of WT and OE lines under normal and drought treatments, including MDA (C), H2O2(D) contents, and CAT (E) activities. * and ** indicate significantly different at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

2.5 過(guò)表達(dá)FeSGT1增強(qiáng)擬南芥的耐鹽性

在1/2 MS培養(yǎng)基上進(jìn)行了鹽脅迫的發(fā)芽和根生長(zhǎng)試驗(yàn), 鹽處理下的OE株系表現(xiàn)出比WT更長(zhǎng)的根和更高的鮮重(圖6)。在土壤中鹽處理1周后, 植物表現(xiàn)出生長(zhǎng)遲緩。當(dāng)鹽處理持續(xù)2周時(shí), 植物葉片變黃并死亡, 但WT植物表現(xiàn)出更嚴(yán)重的過(guò)敏癥狀(圖7-A, B)。對(duì)鹽脅迫下過(guò)表達(dá)擬南芥葉片中MDA和H2O2的含量以及CAT的活性測(cè)定, 結(jié)果表明, OE株系的MDA、H2O2含量和CAT活性均顯著高于WT (圖7-C, D, E)。

圖6 鹽處理下FeSGT1轉(zhuǎn)基因植株表型分析

A: 鹽脅迫下WT和OE株系的種子萌發(fā)分析。B: 鹽脅迫下WT和OE株系的發(fā)芽率; 計(jì)算后5 d的發(fā)芽率。C: 鹽脅迫下WT和OE株系的根長(zhǎng)測(cè)定。D: 鹽脅迫下WT和OE株系的總根長(zhǎng)和鮮重; *表示在0.05概率水平差異顯著。

A: seed germination assays of WT and OE lines under salt stress. B: the germination rates of WT and OE lines under salt stress; the germination rate was calculated for the next 5 days. C: root length assays of WT and OE lines under salt stress. D: the total root lengths and fresh weights of WT and OE lines under salt stress; * indicates significantly different at the 0.05 probability level.

圖7 FeSGT1基因的異位表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性

A:鹽脅迫下3周齡WT和OE株系的表型分析。B: WT和OE株系在鹽脅迫下的存活率。C～E: 對(duì)照和鹽處理下WT和OE株系的MDA (C)、H2O2(D)含量和CAT (E)活性。*表示在0.05概率水平差異顯著。

A: phenotypes of 3-week-old WT and OE lines under salt stress. B: the survival rates of WT and OE lines under salt stress. C–E: the physiological indicators of WT and OE lines under normal and salt treatments, including MDA (C), H2O2(D) contents, and CAT (E) activities; * indicates significantly different at the 0.05 probability level.

3 討論

SGT1作為脅迫感應(yīng)途徑中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件, 廣泛參與植物受體調(diào)節(jié)、信號(hào)誘導(dǎo)、重折疊和維持蛋白平衡以應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫[17]。在前期對(duì)甜蕎干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析中, 我們發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下被顯著誘導(dǎo)[29]。本研究從甜蕎中克隆了基因, 其具有家族特有的TPR、CS和SGS結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位情況顯示, FeSGT1蛋白定位于細(xì)胞膜上, 這與SGT1蛋白在小麥[31]內(nèi)的亞細(xì)胞定位結(jié)果類似。在甜蕎苗期基因的表達(dá)受低溫(4℃)、鹽、干旱和ABA脅迫的誘導(dǎo)。組織特異性分析表明在植物早期發(fā)育階段起作用, 在根和葉有不同的表達(dá)量, 參與不同的發(fā)育階段。

近年來(lái), 研究表明SGT1作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)正調(diào)控因子在植物非生物脅迫應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用[17]。在擬南芥中基因通過(guò)與HSP90相互作用促進(jìn)IAA、JA等植物激素的生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), 從而正向調(diào)節(jié)植株的生長(zhǎng)和莖分生組織的發(fā)育[26], 提高了擬南芥植株的耐旱和耐鹽性[24,32]。其中HSP90是一類廣泛參與蛋白質(zhì)合成與降解, 維持滲透穩(wěn)態(tài)的伴侶蛋白[32]。在大豆中SGT1蛋白與RAR1和HSP90之間相互作用, 通過(guò)介導(dǎo)應(yīng)激防御信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的滲透穩(wěn)態(tài), 從而提高了大豆植株的耐旱和耐鹽性[27]。此外水稻的突變顯著抑制了抗氧化系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá), 參與褪黑激素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)改善了水稻植株的干旱脅迫適應(yīng)性[26]。這些研究證實(shí)了基因通過(guò)參與植物的氧化應(yīng)激和滲透應(yīng)激來(lái)提高植物的耐旱和耐鹽性。還有研究發(fā)現(xiàn)SGT1與SCF E3泛素連接酶的一部分skp1發(fā)生相互作用[23], 因此SGT1可能參與蛋白質(zhì)的泛素化, 而以泛素為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)降解途徑在植物抗旱性中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[34]。然而, 在植物耐旱性中, 能夠證明特定E3連接酶復(fù)合物和SGT1之間存在功能聯(lián)系的證據(jù)尚不充分。此外, SGT1可能是通過(guò)對(duì)JA和IAA等抗逆相關(guān)激素的積累或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的改變來(lái)參與植物的抗旱性[17]。多項(xiàng)研究表明參與了JA介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), 能夠調(diào)節(jié)JA誘導(dǎo)的基因表達(dá)[35-36], 而JA在一定程度上能減緩干旱脅迫對(duì)植株造成的傷害, 有效地提高植株的抗旱能力[36]。Gray等[26]發(fā)現(xiàn)擬南芥突變體因的突變, 改變了植株對(duì)生長(zhǎng)素的敏感性。而生長(zhǎng)素通常需要被生長(zhǎng)素運(yùn)輸抑制劑響應(yīng)蛋白(TIR1)激活后, 從而參與到26S蛋白酶體介導(dǎo)的Aux/IAA蛋白降解[38], 因此有可能在擬南芥中SGT1b與TIR1相互作用, 并協(xié)助Aux/IAAs的泛素化過(guò)程, 從而參與植物的耐旱性。但是SGT1是否作為JA、IAA等激素誘導(dǎo)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子, 參與植物耐旱性的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

SGT1缺失的植物表現(xiàn)出復(fù)雜的表型變化, 包括對(duì)非生物脅迫的抗性減弱和生長(zhǎng)缺陷[17]。為了進(jìn)一步確定SGT1在植物非生物脅迫中的作用, 本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出更強(qiáng)的干旱和鹽脅迫耐受性。生理指標(biāo)檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)其耐受性的提高是通過(guò)顯著提高CAT活性以及清除MDA和H2O2的能力實(shí)現(xiàn)的, 氧化損傷的減少降低了細(xì)胞損傷程度[39]。本研究結(jié)果表明在提高植物耐旱和耐鹽性中發(fā)揮著積極作用。此外, SGT1對(duì)植物生長(zhǎng)相關(guān)激素(如JA或IAA)的反應(yīng)中的調(diào)控機(jī)制, 以及SGT1是否與泛素化連接酶或HSP90伴侶蛋白相互作用以及如何作用等, 尚需進(jìn)一步研究。相較前人結(jié)果, 本研究證實(shí)了基因通過(guò)參與抗氧化調(diào)節(jié)來(lái)增強(qiáng)植物的耐旱和耐鹽性。為后續(xù)深入研究基因調(diào)控甜蕎抗旱分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

甜蕎基因的CDS序列全長(zhǎng)1086 bp, 其編碼蛋白定位于細(xì)胞膜。該基因受低溫、鹽、干旱和ABA脅迫誘導(dǎo)。異源過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱性和耐鹽性。

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Biological functional analysis of common buckwheat ()gene in enhancing drought stress resistance

ZHU Xu-Dong1, YANG Lan-Feng1, CHEN Yuan-Yuan1, HOU Ze-Hao1,2, LUO Yi-Rou1, XIONG Ze-Hao1, and FANG Zheng-Wu1, *

1College of Agriculture, Yangtze University / Hubei Center for Collaborative Innovation of Grain Industry, Jingzhou 434025, Hubei, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

SGT1 (Suppressor of the G2 Allele of skP1) is an inhibitor of skp1-4, which plays an important role in the abiotic stress response of plants. Based on the early transcriptomics and proteinomics analyses of common buckwheat under drought stress, agene was screened and cloned, which contained a 1086 bp open reading frame encoding 361 amino acids and 3 domains including TPR, CS, and SGS. Homologous protein comparison showed that FeSGT1 was closely related to CqSGT1 (XP_021726759.1), BvSGT1 (XP_010671588.1), and SoSGT1 (XP_021839743.1). Besides,gene encoded membrane localization protein. The relative expression levels revealed that FeSGT1 tended to be up-regulated within 24 hours of drought stress. The expression ofgene peaked at 12 hours and began to decline after 24 hours under salt, low temperature (4℃), and ABA treatments. Overexpression ofgene in transgenicnot only conferred drought and salt tolerance, but also significantly increased root length, fresh weight, and survival rate compared with the wild type (WT) plant, accompanied by the elevated activities of catalase (CAT), the lowered malonaldehyde (MDA) and H2O2contents, thus allowing plants to better adapt to adverse environments. Our results provided information in the exploring of the molecular regulation mechanism responding to drought tolerance in common buckwheat.

Common buckwheat ();; transgenic; drought resistance

10.3724/SP.J.1006.2023.21028

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31671755)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31671755).

方正武, E-mail: fangzhengwu88@163.com

E-mail: 202071604@yangtzeu.edu.cn

2022-04-18;

2022-09-05;

2022-09-15.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220913.1655.004.html

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