馬春敏 李維希 李芳軍 田曉莉,* 李召虎

陸地棉硝酸鹽轉(zhuǎn)運體基因家族鑒定及表達分析

馬春敏1李維希2李芳軍1田曉莉1,*李召虎1

1中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物化控研究中心, 北京 100193;2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室, 江蘇南京 210095

硝酸鹽轉(zhuǎn)運體(nitrate transporters, NRTs)在植物氮素吸收、利用和存儲等過程中發(fā)揮著重要作用。本研究利用HMM軟件和Blastp方法, 在陸地棉中, 鑒定出了106個GhNRT1/PTR (NPF) (Nitrate transporter 1 (NRT1)/Peptide Transporter (PTR) family (NPF))和14個GhNRT2 (Nitrate transporter 2 family)成員, 對它們的保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、理化性質(zhì)、亞細胞定位、保守基序、基因結(jié)構(gòu)、啟動子區(qū)順式作用元件和表達模式進行了分析。結(jié)果表明, GhNPF均具有典型的PTR2 (Peptide Transporter 2 family, 肽轉(zhuǎn)運蛋白)結(jié)構(gòu)域, 個別蛋白(GhNPF2.6bD、GhNPF4.1cA和GhNPF2.14aD)出現(xiàn)了2個PTR2和/或其他結(jié)構(gòu)域, 表明棉花NPF進化保守性較低; GhNRT2具有典型的MFS_1 (Major Facilitator Superfamily, 主要促進子超家族)單域。多數(shù)GhNRTs定位于細胞質(zhì)膜上, 為疏水性蛋白。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示GhNRTs可分為10個類群, 相同類群具有相似的基因結(jié)構(gòu)及基序分布。順式作用元件組成表明, 大部分的表達可能與植物激素、非生物脅迫和光反應(yīng)等相關(guān)。此外,不同亞類間的表達模式存在一定差異, 但同一亞類內(nèi)不同成員的表達模式相對保守;基因則主要在根中高表達。鹽脅迫處理后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn), 近1/5的基因表達量發(fā)生了顯著上調(diào)或下調(diào), 表明其可能參與棉花鹽脅迫應(yīng)答。選擇6個基因檢測其在根系、幼葉、功能葉和老葉中的表達對不同NO3–供應(yīng)水平的響應(yīng)發(fā)現(xiàn),和可能具有雙親和吸收NO3–的能力,則可能編碼高親和NO3-轉(zhuǎn)運蛋白; 三者在功能葉和老葉中可能參與NO3–卸載。這些結(jié)果與擬南芥等植物中的報道不同。上述研究結(jié)果為進一步揭示棉花硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的功能提供了參考, 為解析棉花氮素吸收和利用機制提供了初步依據(jù)。

陸地棉; 硝酸鹽轉(zhuǎn)運體; GhNPF; GhNRT2; 表達模式

氮素作為植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素, 是植物體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、輔酶、葉綠素等生物大分子的重要組成成分[1]。與有機氮相比, 植物更容易吸收利用土壤中的無機氮, 包括硝態(tài)氮(NO3–)和銨態(tài)氮[2], 其中又以NO3–為主。研究發(fā)現(xiàn), 參與NO3–吸收、轉(zhuǎn)運和存儲等過程的NO3–轉(zhuǎn)運體有4個基因家族, 分別為(nitrate transporter 1 (NRT1)/peptide transporter (PTR) family (NPF), NO3-轉(zhuǎn)運蛋白1/肽家族)、(nitrate transporter 2 family, NO3–轉(zhuǎn)運蛋白2)、(chloride channel, 氯離子通道)和/(slowly activating anion channel, 慢陰離子相關(guān)通道)[3], 其中作為參與氮素利用的關(guān)鍵基因已通過HMM或(和) Blastp在許多物種中得到鑒定, 擬南芥[4]、水稻[4]、小麥[5]分別有53個、93個、331個NPF, 楊樹[6]、蘋果[7]和菠菜[8]分別有79個、84個和67個NRT成員。

基因家族在氮素利用中發(fā)揮著廣泛且重要的作用。編碼雙親和性NO3-轉(zhuǎn)運蛋白, 主要在根尖附近的表皮、根成熟區(qū)皮層及內(nèi)皮層中表達; 還可通過感知NO3-信號參與植物的種子萌發(fā)和側(cè)根生長[9]。小麥中的、、和以及水稻中的、和均為的同源基因, 行使吸收NO3-的功能, 說明不同物種的NRT具有相似的保守序列及生理功能[10-12]。NPF4.6為組成型低親和性轉(zhuǎn)運體, 在根中介導(dǎo)NO3–內(nèi)流; 敲除的突變體植株中, 其NO3–吸收能力降低50%～70%[13]。而同為低親和性轉(zhuǎn)運體的NPF2.7則主要負責根系NO3-外流[14]。和在伴侶蛋白NRT3/NAR2 (nitrate transporter 3 (NRT3)/nitrate assimilation related protein 2 (NAR2) family)的參與下發(fā)揮高親和吸收活性[15]。菊花的CmNRT2與CmNAR2結(jié)合后激活其對NO3–的高親和吸收能力, 且表達豐度受NO3–誘導(dǎo)[16]。

部分基因參與NO3-在木質(zhì)部和韌皮部的裝載以及向葉片或種子的轉(zhuǎn)運。、參與根中NO3–向韌皮部的轉(zhuǎn)運, 其表達受氮饑餓誘導(dǎo)[17-18]。亞家族中表達上調(diào), 可以促進NO3–由根向冠的轉(zhuǎn)運[19]。而和均為根系向地上部轉(zhuǎn)運NO3–的負調(diào)控因子, 但可能是通過不同的作用機制實現(xiàn)的[20]。水稻和負責將根系中NO3–向地上部運輸[21-22]。和是根源性NO3–重新分配到新生組織所必需的[23]。主要在葉柄表達的調(diào)控著葉柄與葉片間的NO3–穩(wěn)態(tài)及葉片發(fā)育[24]。/負責將NO3–從老葉分配到幼葉, 以維持植物在缺氮條件下良好生長[25]。胚胎發(fā)育過程中, 需要依靠/向胚組織輸送NO3–[26]。擬南芥突變體胚胎的總氮水平顯著低于野生型, 說明影響胚中氮的積累[27]。

NRT也可直接或間接參與到其他離子(如K+、Na+、Cd2+、Cl–等)的吸收及轉(zhuǎn)運過程, 進而調(diào)節(jié)植物對非生物脅迫的耐受性。如NRT1.1/NPF6.3和NRT1.5/NPF7.3參與植物對K+的吸收利用[19,28]。擬南芥突變體中, NO3–、Na+和Cd2+含量在根中積累, 間接增強植物對鹽、干旱和Cd2+脅迫的耐受性[29]。在鹽脅迫下,突變體的木質(zhì)部汁液和地上部NO3–含量及生物量均降低, 表明可通過促進NO3–從根向地上部的運輸而提高植物的耐鹽性[30]。可介導(dǎo)木質(zhì)部Cl–裝載, 高濃度NaCl處理抑制的表達, 通過減少鹽脅迫下地上部Cl-的積累增強植物的耐鹽性[31]。此外,受鹽誘導(dǎo)表達, 并可促進根系Cl–的外排提高植物對鹽脅迫的耐受性[32]。

我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中氮肥利用率僅為30%～35%, 鑒定并通過NO3-轉(zhuǎn)運蛋白增強氮的吸收轉(zhuǎn)運是提高作物氮肥利用效率的重要手段[33-34]。棉花是重要的經(jīng)濟作物和紡織工業(yè)原料, 陸地棉是世界上種植最廣的栽培種, 占世界棉纖維產(chǎn)量的95%以上。但目前對棉花中基因的研究還很薄弱和零散, 僅見關(guān)于和的報道[35-36]。因此, 本文系統(tǒng)鑒定了陸地棉中的基因家族成員, 首先對其進行生物信息學(xué)分析(聚類、保守基序、染色體定位、順式調(diào)控元件等), 其次根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和實時熒光定量PCR (RT-PCR)探究了該家族不同成員的表達模式及對鹽脅迫、供氮水平的響應(yīng), 為進一步表征棉花NO3–轉(zhuǎn)運蛋白的功能提供依據(jù)和指導(dǎo), 也為提高棉花氮素利用效率奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 陸地棉GhNRTs成員的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

陸地棉(L)遺傳標準系TM-1的基因組和蛋白序列從CottonGFD (https:// cottonfgd.org/about/download.html)下載, 擬南芥()數(shù)據(jù)從TAIR上下載(https:// www.arabidopsis.org/)。參考PFAM數(shù)據(jù)庫中下載的NRTs蛋白保守結(jié)構(gòu)域 PF00854 (PTR 2)、PF07690 (MFS_1), 利用HMM在Score>300, E<3.5E-89的標準下預(yù)測了陸地棉NO3–轉(zhuǎn)運蛋白(http://pfam.xfam. org/)。為獲得陸地棉中較全的硝酸鹽轉(zhuǎn)運體, 以擬南芥硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白作為查詢序列, 采用Blastp進行搜索, 閾值為E<1e–200。之后融合HMM和Blastp的結(jié)果, 并利用在線NCBI上CDD數(shù)據(jù)庫分析確定GhNRTs蛋白的保守結(jié)構(gòu)域(https://www.ncbi.nlm.nih. gov/cdd), 保留含有正確且完整結(jié)構(gòu)域的成員。使用MEGA 7.0軟件的Clustal W比對60個擬南芥AtNRTs、120個陸地棉GhNRTs的氨基酸序列, 采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 選擇“p-distance”、“Complete Deletion”及以具有1000次重復(fù)的分析評估樹狀結(jié)構(gòu)。利用在線工具Evolview V3[37]美化系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2 陸地棉GhNRTs的理化性質(zhì)及亞細胞定位分析

使用 ProtParam[38]在線工具分析GhNRTs蛋白的分子量、等電點、氨基酸數(shù)目、不穩(wěn)定系數(shù)、以及親水性等理化性質(zhì)。同時, 借助WoLF PSORT[39]網(wǎng)站預(yù)測蛋白的亞細胞定位。

1.3 陸地棉GhNRTs的染色體定位

通過基因注釋文件查看在染色體上的位置, 使用MapChart軟件進行可視化[40]。

1.4 陸地棉GhNRTs的基序與基因結(jié)構(gòu)分析

從基因組注釋文件中提取基因結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。利用MEME[41]分析GhNRT蛋白的保守基序, 基序數(shù)量設(shè)置為10。使用TBtools[42]根據(jù)基因注釋文件中的內(nèi)含子、外顯子顯示基因結(jié)構(gòu)。

1.5 順式調(diào)控元件分析

為鑒定基因中的順式調(diào)節(jié)因子, 使用PlantCARE數(shù)據(jù)庫預(yù)測了基因翻譯起始位點上游2000 bp區(qū)域的順式調(diào)控元件, 借助TBtools[42]軟件對其可視化(http://bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html/)。

1.6 GhNRTs基因的組織表達及鹽脅迫應(yīng)答分析

陸地棉(L)遺傳標準系TM-1的根、莖、葉、花器官(花瓣、花托、花萼、苞片、花藥、花絲、雌蕊)、胚珠纖維混合物(–3～5 DPA)、胚珠(10～25 DPA)和纖維(10～25 DPA)的轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)下載于NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(PRJNA490626)。通過Cutadapt軟件對原始reads進行質(zhì)控, 去除測序接頭序列(https://github.com/ marcelm/cutadapt/)。利用HISAT2軟件把所有樣本的reads比對到‘TM-1’ NAU的基因組, 篩選唯一比對上的reads進行下游分析(https://www.psc.edu/resources/software /hisat-2/)。轉(zhuǎn)錄本的組裝和定量通過StringTie完成(https://ccb. jhu.edu/software/stringtie/index.shtml), 以FPKM (Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments)值作為標準化的表達量進行后續(xù)分析。

此外, 利用多個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了基因在苗期根系和葉片中的表達, 以期鑒定在根系和葉片中穩(wěn)定表達的。所用轉(zhuǎn)錄組除了上述TM-1的三葉期幼根和幼葉數(shù)據(jù), 還包括筆者課題組自有的3組陸地棉根系(Acala1517-08的子葉期1 cm胚根根尖[43]、欣試17的三葉期2 cm側(cè)根(未發(fā)表)、魯棉研22的三葉期5 cm側(cè)根[44])和3組陸地棉葉片(魯棉研22的二葉期幼葉(未發(fā)表)、魯棉研22的三葉期幼葉、欣試17的六葉期功能葉[45])數(shù)據(jù), 將其中基因的FPKM值進行l(wèi)og2標準化后, 使用TBtools軟件繪制基因表達熱圖。此外, 分析了欣試17品種三葉期2 cm側(cè)根中的基因?qū)?00 mmol L–1NaCl的響應(yīng)。

1.7 部分GhNRTs基因的實時熒光定量PCR

魯棉研22種子用去離子水浸種12 h, 露白后點于沙床, 避光萌發(fā)2 d后脫掉種殼, 次日子葉展開時移至含不同水平NO3–(1.39 mmol L–1和7.50 mmol L–1)的改良Hoagland營養(yǎng)液[46]中, 在光照培養(yǎng)室進行培養(yǎng)(28℃±2℃, 14 h光照, 10 h黑暗, 相對濕度為65%, 光照強度為400 μmol m–2s–1), 每3 d更換一次營養(yǎng)液。長至八葉期時, 將7.5 mmol L–1NO3–下生長的植株移至不含NO3–的營養(yǎng)液中進行饑餓(處理1, 編號為Control→Starvation, 簡稱C→S), 將1.39mmol L–1NO3–下生長的植株移至7.5 mmol L–1NO3–,一部分開始定時取樣(處理2, 編號為Low→Control, 簡稱L→C), 另一部分繼續(xù)培養(yǎng)5 d, 之后進行饑餓(處理3, 編號為Low→Control→Starvation, 簡稱L→C→S)。以上處理分別在0、24、48、72和120 h取根系、幼葉、功能葉(倒四葉)和老葉(第1～2葉)進行部分(根據(jù)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果選擇在根中高表達、葉中高表達和根、葉中同時高表達的各2個)的RT-PCR, 每處理每個時間點設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

使用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(擎科生物科技公司)提取樣品的總RNA, 用TRUEscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(艾德萊, 中國)進行反轉(zhuǎn)錄。利用SnapGene和Primer 5.0軟件設(shè)計擬定量基因的RT-PCR引物, 以為內(nèi)參(表1)。使用SYBR Green ProHS預(yù)混型qPCR試劑盒 II (艾科瑞, 中國)制備反應(yīng)體系: 7.5 μL SYBRGreen Premix ProHS qPCR Kit II、0.3 μL ROX Reference Dye (4 μmol L–1)、1.5 μL cDNA、前/后引物各0.3 μL和5.1 μL RNase free H2O。使用7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, 美國)進行RT-PCR, 擴增程序為: 95℃ 30 s, 95℃ 5 s, 60℃ 34 s, 40個循環(huán), 每個樣本設(shè)3個技術(shù)重復(fù)。通過2–ΔΔCt算法計算基因的相對表達量[47], 使用GraphPad Prism 8軟件繪制基因表達圖。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉GhNRTs成員的鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

結(jié)合HMM和Blastp分析, 在陸地棉中鑒定出121個基因。使用NCBI保守結(jié)構(gòu)域CDD數(shù)據(jù)庫對其進行分析, 剔除1條不包含完整PTR2基序的序列, 其余120個基因(106個, 14個)用于以下分析。

采用鄰接法對棉花GhNRTs蛋白及雙子葉模式植物擬南芥AtNRTs蛋白進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。參考擬南芥基因名稱, 依據(jù)同源關(guān)系命名棉花(圖1)。基于Léran等[4]的分類方法, 根據(jù)進化分支及基序結(jié)構(gòu)情況, 將陸地棉NRT蛋白分為10個聚類(圖1)。其中聚類V (NPF5亞類1)成員最多, 包含21個GhNRTs; GhNPF2與GhNPF1亞家族處于同一分支下, 兩者合為一類(I); GhNPF5. 10dA、GhNPF5. 10dD (NPF5亞類2)與其他NPF5成員同源性較低, 劃為IX類; 相似地, GhNPF6.1aA、GhNPF6.1bD (NPF6亞類2)劃為類群X。

對比GhNRTs與AtNRTs的保守結(jié)構(gòu)域(圖2)發(fā)現(xiàn), GhNPF都包含PTR2結(jié)構(gòu)域, 且GhNPF2.6bD、GhNPF4.1cA包含2個PTR2結(jié)構(gòu)域; 此外, GhNPF2.14aD還具有Epimerase、3Beta_HSD和NAD_binding_4 結(jié)構(gòu)域(圖2-A)。NRT2P亞家族(II)的成員均包含MFS_1單域(圖2-A), 這與AtNRT2保守結(jié)構(gòu)域一致(圖2-B)?？傮w而言, 與NRT2相比, NPF亞家族的進化保守性較低。

2.2 陸地棉GhNRTs成員的理化性質(zhì)及亞細胞定位分析

依據(jù)基序分布相似性, 從GhNRTs各亞類(相似亞類合并)中分別選取1～3個成員(共計40個)進行理化性質(zhì)分析。結(jié)果表明, 棉花GhNRTs蛋白的分子量相對較大, 多數(shù)為55～66 kD, 且NPF亞家族成員的蛋白分子量普遍大于NRT2亞家族的成員(表2)。此外, NPF亞家族中極少數(shù)蛋白如GhNPF2.6bA、GhNPF2.6bD和GhNPF4.1cA的分子量大于100 kD。大部分GhNRTs蛋白的等電點在8～10之間, 為堿性蛋白, 其中GhNRT2亞家族蛋白等電點在8.59～9.31, 接近AtNRT2.1的等電點(8.85)[48], 可能參與質(zhì)子的共轉(zhuǎn)運。少部分成員(GhNPF2.14aD、GhNPF7.1bA、GhNPF7.2aD、GhNPF7.3aA和GhNPF8.3bA)蛋白的等電點小于7, 為酸性蛋白。40個代表成員蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)在21.88～46.12之間, 其中7個蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)大于40, 為不穩(wěn)定性蛋白, 可能與其含有較多不穩(wěn)定的二肽結(jié)構(gòu)有關(guān)。40個代表成員的親水性均為正值, 位于0.149 (GhNPF5.10dA)～0.521 (GhNPF2.6bA)之間, 表明棉花NRT多為疏水性蛋白。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示, 40個代表成員蛋白定位于細胞質(zhì)膜上的概率最高, 表明這些蛋白可能參與NO3-跨膜轉(zhuǎn)運。

圖1 陸地棉NRT蛋白與擬南芥NRT蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

利用MEGA 7.0中的Clustal W比對陸地棉(120條)和擬南芥(60條)的NRT蛋白序列, 采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。紅色星表示陸地棉NRT, 綠色三角形表示擬南芥NRT。彩色圓點代表已被驗證的AtNRTs的底物, 匯總每個亞族的主要底物構(gòu)成外圓環(huán)。

The NRT protein sequences ofL. (120) and(60) were compared by Clustal W in MEGA 7.0, and the phylogenetic tree was constructed by adjacency method. Red star representsNRT, and green triangle representsNRT. The colored dot represents the substrates of AtNRTs that have been verified, and the main substrates of each subfamily are summarized to form the outer ring.

表2 陸地棉NRT蛋白的理化性質(zhì)及亞細胞定位預(yù)測

保留預(yù)測概率最高的細胞結(jié)構(gòu)為亞細胞定位結(jié)果, plas指細胞質(zhì)膜。

The cell structure with the highest prediction probability was the subcellular localizationt. plas refers to the plasma membrane.

2.3 陸地棉GhNRTs染色體定位分析

參照陸地棉TM-1的染色體長度和在染色體上的位置等信息發(fā)現(xiàn), 120個成員中有113個在染色體上明確定位(7個成員注釋為scaffold, 定位不明確)。由圖3可知, 陸地棉13對染色體上均有成員分布, 其中A亞基因組染色體上有54個, D亞基因組染色體上有59個。第5對和第3對染色體上分布的成員最多, 分別有18、17個; 其次為第7對和第13對染色體, 分別有11和12個。

2.4 基序及基因結(jié)構(gòu)分析

利用在線程序MEME分析陸地棉NRT蛋白間的保守基序, 并根據(jù)基因注釋文件顯示基因結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 多數(shù)NPF成員(95/106)都包含了motif 1～motif 10, 所有GhNRTs均包含motif 3 (圖4)。此外, motif 1～motif 10在NPF中的排列位置基本一致(圖4)。每種類型的GhNRTs都含有相似的motifs分布, 但部分同類成員也顯示出不同的結(jié)構(gòu), 如聚類I中GhNPF2.6亞類成員均不含motif 10, 而其余motif在成員GhNPF2.6bD中出現(xiàn)2次。除motif 8外, 其余motif在聚類IV的成員GhNPF4.1cA中均出現(xiàn)2次。聚類V中, motif 9存在于除GhNPF5.9亞類外的所有成員中。類群II (NRT2亞家族)僅含有motif 3, 且GhNRT2.5含有2個motif 3。表明同一亞類的NRT成員所含基序相對比較保守。

基因結(jié)構(gòu)分析顯示, I類的20個成員中有15個含有4個外顯子, 3個成員如和含有8個外顯子、含有7個外顯子(圖4)。聚類II中的基因含有2～4個外顯子; III、IX和X類成員均含有4個外顯子; IV類15個成員中的6個含有5個外顯子, 但個別成員如的外顯子多達11個; V類中2/3的成員(14/21)含有4個外顯子; VI (10/17)、VII (5/11)和VIII (6/12)類50%左右或以上的成員含有5個外顯子。

所含內(nèi)含子數(shù)在3～12個之間。將近一半的(59/120)成員含有5個內(nèi)含子, 32個成員含有6個內(nèi)含子, 16個成員含有4個內(nèi)含子, 6個成員(、、、)的內(nèi)含子數(shù)多于6個。此外, 包含3個內(nèi)含子的成員有7個, 且均屬于亞家族。

2.5 順式調(diào)控元件預(yù)測

為深入了解陸地棉家族基因的潛在功能, 對各基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游2000 bp的序列進行了順式調(diào)控元件的預(yù)測。在120個的啟動子區(qū)域共鑒定出113種順式調(diào)節(jié)元件, 本文篩選了常見的25種進行統(tǒng)計(圖5)。啟動子區(qū)域存在脫落酸(ABA)響應(yīng)元件ABRE的有91個, 存在茉莉酸甲酯(MeJA)響應(yīng)元件TGACG-motif和CGTCA-motif的分別有73個和72個, 存在乙烯(Ethylene)響應(yīng)元件ERE和抗氧化反應(yīng)元件ARE的分別有102個和98個, 存在光響應(yīng)因子元件G-box和GT1-motif的分別有82個和88個, 說明的表達可能受到各種植物激素和非生物脅迫的調(diào)節(jié)。

2.6 陸地棉GhNRTs的表達模式分析

利用公開釋放的RNA-seq數(shù)據(jù)庫分析了基因在棉花根、莖、葉、花器官(花瓣、花托、花萼、苞片、花藥、花絲、雌蕊)、胚珠纖維混合物(–3～5 DPA)、胚珠(10～25 DPA)和纖維(10～25 DPA)中的表達模式(圖6)。

圖6 GhNRTs基因在棉花不同器官和組織中的表達水平

每個基因?qū)?yīng)的FPKM數(shù)值log2標準化后繪制基因表達熱圖。DPA: 開花后天數(shù)。

The relative expression level of genes was drawn after the FPKM values normalized by log2corresponding to each gene. DPA: days post-anthesis.

圖7 不同轉(zhuǎn)錄組中的GhNRTs基因表達分析

使用每個基因?qū)?yīng)的FPKM數(shù)值log2標準化后繪制基因表達熱圖。R1: 1 cm胚根根尖; R2: 三葉期5 cm側(cè)根; R3: 三葉期2 cm側(cè)根; R4: 三葉期幼根; L1: 二葉期幼葉; L2、L3: 三葉期幼葉; L4: 六葉期功能葉。

The relative expression level of genes was plotted using the FPKM values normalized by log2corresponding to each gene. R1: 1 cm radicle tip; R2: 5 cm lateral root at 3 leaf stage; R3: 2 cm lateral root at 3 leaf stage; R4: young root at 3 leaf stage; L1: young leaf at 2 leaf stage; L2 and L3: young leaf at 3 leaf stage; L4: the functional leaf at 6 leaf stage.

I類中的在胚珠發(fā)育階段特異性高表達, 而在其他組織中均不表達;在花瓣、花萼、花藥、10～15 DPA胚珠、15～25 DPA纖維中表達量高, 表明其可能參與花器官的形成及纖維次生細胞壁的生物合成;在花萼、苞片、雌蕊中高表達;在莖中高表達。II類()中除外均在根中特異性高表達, 這與擬南芥基因除外(在種子中特異性表達)均在根中表達的結(jié)果一致[15,18,49-50]。III類基因中除外均在花器官中高表達。IV類中的在根、莖、花托和花萼中高表達, 而僅在根和莖中特異性高表達。V類中的基因表達模式比較多樣,在花萼、苞片和雌蕊中高表達,在根、莖中高表達,、和在根中表達, 此外在10～15 DPA胚珠、15 DPA纖維中高表達,在花瓣、花藥、花絲中高表達,在10～25 DPA胚珠、15～25 DPA纖維中表達量高。VI類中的多數(shù)基因在根、莖、葉和花器官中高表達,的部分基因可能還參與了胚珠發(fā)育過程。在水稻中的研究也發(fā)現(xiàn),/主要在根表皮和根的維管組織中表達,突變體表現(xiàn)出嚴重的生長缺陷和晚花, 而過表達則促進高產(chǎn)和早熟[51]。X類的在花器官、3～5 DPA子房、10～15 DPA胚珠、15～25 DPA纖維中表達量高。VII類中的在根中表達量高, 在其他組織中幾乎不表達;在根、花瓣、花藥、花絲中高表達;在花托、花藥中高表達。VIII類基因中的、和幾乎在所有組織中均有表達。與此類似, Zhao等[52]通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)/在水稻各組織中均高度表達。

此外, 為更確鑿地了解基因在棉花苗期根系和葉片中的表達, 以FPKM值>10為標準, 在公開的TM-1數(shù)據(jù)和自有的多組RNA-seq數(shù)據(jù)中共篩選出83個基因。分析結(jié)果表明, 大多數(shù)在不同轉(zhuǎn)錄組中的表達部位相似, 且與葉片相比, 在根中高表達的基因較多(圖7)。、、、、、、、和在4組根系數(shù)據(jù)中均高表達;、、、、、(除、)、、、和等在2組三葉期幼根中一致高表達。此外,、、、、、、、(除、、)和在葉片中高表達, 且在功能葉中表達量更高。

2.7 根系中GhNRTs對鹽脅迫的響應(yīng)

由圖8可知, 在200 mmol L–1NaCl處理下,基因的表達呈現(xiàn)不同的模式。、、的表達先降低(6 h)后升高;的表達則先升高(6 h)后降低;、的表達在處理12 h達到高峰后降低, 48 h后又恢復(fù)到處理前的水平;、受鹽誘導(dǎo)上調(diào)表達, 且在12 h后趨于穩(wěn)定;、、和等基因的表達則持續(xù)下調(diào)或波動下調(diào)。

圖8 GhNRTs基因?qū)?00 mmol L-1 NaCl脅迫的響應(yīng)

每個基因?qū)?yīng)的FPKM數(shù)值log2標準化后繪制基因表達熱圖。R: 三葉期側(cè)根2 cm; CK: 對照。

The relative expression level of genes was drew after the FPKM values normalized by log2for each gene. R: lateral root 2 cm at 3 leaf stage; CK: treatment.

2.8 部分GhNRTs表達對NO3–水平的響應(yīng)

以正常NO3–處理下(亦即NO3–饑餓處理0 h)棉花(八葉期)根中的表達量為1, 該基因及其他基因在各部位和各處理下的表達量均與其比較進行定量。與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果(圖7)一致,在根中的表達量高于葉片,和在葉片中的表達量高于根系,在根和葉片中(幼葉除外)的表達均較高(圖9)。和的定量與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果有所不同, 其中在根系和葉片中的表達量相似(圖9-B), 而轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中該基因在根中表達較高(圖7);在葉片中的表達多數(shù)情況下高于根系(圖9-F), 而轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中該基因在根和葉片中均高表達(圖7); 這些差異可能與苗齡不同有關(guān)。

(圖9)

采用2–ΔΔCt算法計算基因的相對表達量。將C→S處理0 h根中的相對表達量設(shè)為1。C→S: 7.5 mmol L–1→0 mmol L–1NO3–; L→C: 1.39 mmol L–1→7.5 mmol L–1NO3–; L→C→S: 1.39 mmol L–1→7.5 mmol L–1→0 mmol L–1NO3–; R: 根; YL: 幼葉; ML: 成熟葉/功能葉(倒四葉); OL: 老葉(第1～2葉)。柱上“*”表示各部位不同時間點之間差異達0.05顯著水平。

The relative expression level of genes was calculated by 2–ΔΔCt. The relative expression ofin roots treated with C→S for 0 h was set to 1. C→S: 7.5 mmol L–1→0 mmol L–1NO3–; L→C: 1.39 mmol L–1→7.5 mmol L–1NO3–; L→C→S: 1.39 mmol L–1→7.5 mmol L–1→0 mmol L–1NO3–; R: root; YL: young leaf; ML: mature leaf/functional leaf (Leaf 4 counted from top); OL: the old leaf (leaf 1–2 counted from below). The “*” above the bars indicates significant difference at< 0.05 among the different time points of each part.

當供氮水平從正常(7.5 mmol L–1NO3–)轉(zhuǎn)為NO3–饑餓時(C→S, L→C→S),在根中隨時間推移逐漸或波動上調(diào); 但當植株從低氮(1.39 mmol L–1NO3–)下轉(zhuǎn)為正常供氮(L→C)后24 h, 該基因迅速大幅上調(diào)29.33倍, 此后在48 h和72 h繼續(xù)上調(diào), 120 h后回落到與24 h相當?shù)乃?圖9-A)。據(jù)此推測,可能在根中主要行使低親和吸收功能。

在葉片中的表達受供氮水平的影響較小; 當供氮水平從正常轉(zhuǎn)為NO3–饑餓時(C→S, L→C→S), 根系中該基因在72 h或120 h出現(xiàn)4.26倍或2.14倍左右的上調(diào)(圖9-B), 提示其可能參與棉株對長時間氮脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)。

根系中在不同供氮水平下均出現(xiàn)上調(diào), 推測該基因編碼雙親和NO3–轉(zhuǎn)運蛋白。不同部位葉片中的表達水平均較高, 且在功能葉和老葉中對供氮水平的響應(yīng)基本一致。如從低氮轉(zhuǎn)為正常供氮(L→C), 功能葉和老葉中的均出現(xiàn)較大幅度上調(diào); 而在L→C→S處理下(低氮轉(zhuǎn)為正常供氮, 5 d后進行饑餓), 功能葉和老葉中的均在NO3–饑餓24 h后快速下調(diào), 之后保持穩(wěn)定(圖9-C)。當供氮水平無論是從正常轉(zhuǎn)為饑餓(C→S), 還是從低氮轉(zhuǎn)為正常(L→ C), 幼葉中該基因均出現(xiàn)快速且大幅度的上調(diào), 而在L→C→S處理下波動下調(diào)(圖9-C)。這些結(jié)果提示,正常供氮時該基因可能在功能葉和老葉中發(fā)揮卸載NO3–的作用, 而在幼葉中的作用可能比較復(fù)雜。

在根系中的表達水平雖然很低, 但可看出其受NO3–饑餓(C→S, L→C→S)誘導(dǎo)而上調(diào); 在功能葉和老葉中的表達隨供氮水平的變化與相似, 但變幅相對較小; 在幼葉中受NO3-饑餓誘導(dǎo)有上調(diào)現(xiàn)象(圖9-D)。

根系中的表達在不同處理下均出現(xiàn)上調(diào)(圖9-E), 說明該基因可能具有雙親和吸收NO3–的能力。在新葉中的表達水平較低, 且其表達隨供氮水平的變化無一致規(guī)律, 在功能葉和老葉中的表達隨供氮水平的變化也與基本相似(圖9-E)。

正常供氮時在根系中的表達水平很低, 但隨NO3–饑餓(C→S, L→C→S)誘導(dǎo)而上調(diào); 低氮條件下該基因在根系中的表達水平較高, 但恢復(fù)正常供氮(L→C)后24 h即出現(xiàn)大幅下調(diào)(0.11倍), 此后在低水平波動, 推測具有高親和吸收NO3–的能力。在新葉中的表達量高于, 受NO3–饑餓(C→S)誘導(dǎo)下調(diào)后又于120 h后恢復(fù)至0 h的水平, 但其表達量在其他2個處理(L→C, L→C→S)下無變化; 在功能葉和老葉中的變化與相似, 即在L→C處理中上調(diào), 在L→C→S處理中以下調(diào)為主(圖9-F)。

3 討論

3.1 生物信息學(xué)分析系統(tǒng)展示了棉花NO3-轉(zhuǎn)運體蛋白及其基因的分子特征

本研究從陸地棉中鑒定出120個NO3-轉(zhuǎn)運蛋白,根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系將其分為10個類群, 其中V類成員最多, 這與擬南芥、水稻等物種相似, 如擬南芥53個NPF成員中的16個[4]、水稻93個中的29個[4]、小麥113個中的34個[5]、蘋果84個中的23個[7]、甘藍型油菜199個中的73個[53]屬于V類。

目前, 植物NRTs的篩選標準還未統(tǒng)一, 設(shè)置不同的篩選條件可能導(dǎo)致不同的結(jié)果。此外, 雖然已在許多物種中鑒定了基因的功能, 但該基因家族的分類尚未定論。例如, 基于對33種植物基因組的類似分析, Léran等[4]將NPF家族分為8個亞家族(NPF1～NPF8), 之后的研究多基于該標準開展。最近關(guān)于蘋果的研究中, 將MdNPF2亞科進一步分為2類[54]。甘藍型油菜中, 8個亞科中的3個(NPF2、NPF5和NPF6)均被進一步分為2組[53]。本文考慮到GhNPF2與GhNPF1處于同一亞分支, 故將其歸為一類; 而NPF5和NPF6中個別成員出現(xiàn)分支差異性, 因此將二者進一步細分為2個組, 其基序、基因結(jié)構(gòu)和基因表達模式在一定程度上支持了該分類方法。

從蛋白質(zhì)基序分析可以看到, 大多數(shù)GhNPF蛋白具有相同的保守基序(motif 1～motif 10), 但GhNPF2.6bD和GhNPF4.1cA比較特殊, 前者除motif 10外其余motif均出現(xiàn)2次, 后者除motif 8外其余motif均出現(xiàn)2次, 且二者均含有2個PTR2保守結(jié)構(gòu)域。雖然尚不明確每個基序的特定功能, 但至少說明這些基序?qū)τ谛纬呻霓D(zhuǎn)運家族的保守結(jié)構(gòu)域至關(guān)重要[55]。內(nèi)含子和外顯子是衡量基因家族進化的重要參考。在進化過程中, 物種會優(yōu)先保留含有較少或不含內(nèi)含子的基因。本研究的多數(shù)含有5個內(nèi)含子, 僅II類亞家族中的7個成員含3個內(nèi)含子, 且這幾個成員均含有MFS_1單域, 說明較的保守度更高。

基因啟動子區(qū)域存在大量的防御和應(yīng)激反應(yīng)元件, 表明其在應(yīng)激信號通路中發(fā)揮重要作用。超過3/4的基因具有脫落酸(91個成員)和乙烯(102個成員)響應(yīng)元件, 表明它們在脫落酸和乙烯途徑中具有重要作用(圖5)。約3/4的基因具有光響應(yīng)因子, 說明多數(shù)的表達受到光的調(diào)控。最新研究證明, ET (乙烯)/JA (茉莉酸)-NRT信號模塊以硝酸還原酶依賴性方式參與植物根系與地上部間的NO3-分配, 調(diào)節(jié)脅迫耐受性和植物生長[56]。

已有研究表明, 植物NRT蛋白具有非常廣泛的底物選擇性和相對特異性。如擬南芥NPF1.1、NPF2.5、NPF4.1、NPF4.5和NPF4.6以及NPF5.1、NPF5.2、NPF5.7和NPF8.2等均已被證實可運輸ABA[57-58], NPF1、NPF2 (除NPF2.9)、NPF3、NPF4 (除NPF4.5、NPF4.6)NPF5.1、NPF5.2、NPF5.6、NPF5.7和NPF8.2等均可轉(zhuǎn)運GA[58](圖1和附表1)。AtNPF2.4[31]、AtNPF2.5[32]和ZmNPF6.4[59]則可轉(zhuǎn)運氯化物。此外, 目前證明NPF6.3除可轉(zhuǎn)運IAA外, 還可介導(dǎo)K+吸收, 調(diào)節(jié)其在根、莖中的分配[60,28]; NPF7.3可協(xié)同轉(zhuǎn)運NO3-和K+ [19]。Yang等[44]發(fā)現(xiàn), 棉花根系中的(根據(jù)參考基因組ID, 其在進化樹中的名稱為GhNRT2.4)在低K+脅迫下上調(diào), 但其是否可直接轉(zhuǎn)運K+需要進一步研究。

3.2 轉(zhuǎn)錄組分析初步揭示了GhNRTs基因的功能及對鹽脅迫的響應(yīng)

本研究的轉(zhuǎn)錄組分析為推測棉花基因的功能提供了依據(jù)。大量的基因(56個)在花器官中高表達, 但只有少數(shù)幾個(、、、)在纖維發(fā)育階段表達量高, 說明參與棉花花器官形成的較多, 影響纖維發(fā)育的較少(圖6)。、和(除外)在根中特異性高表達, 提示其可能行使NO3-吸收功能。和僅在根和莖中特異性高表達, 表明其可能介導(dǎo)NO3-在根、莖之間的分配。在葉片中(尤其是功能葉)表達量較高的有、.、、、、和, 表明它們可能調(diào)控葉片中NO3-的分布。綜上,基因的表達部位及表達量相對一致,在多數(shù)亞類內(nèi)的表達模式保守, 但在不同亞類間存在一定差異。這暗示著的表達存在分化趨勢, 在參與不同組織建成及氮素吸收利用方面發(fā)揮重要作用。

棉花為中等耐鹽作物, 但其在萌發(fā)階段和苗期的耐鹽能力相對較弱[61]。研究表明基因可以緩解植物鹽脅迫, 如擬南芥突變體根系中的NO3–向地上部轉(zhuǎn)運減少, 同時植株能更好適應(yīng)包括鹽脅迫在內(nèi)的非生物脅迫, 但具體機制尚不清楚[29]。鹽脅迫下, 在擬南芥中異源表達沙芥后可促進根系中的NO3–向地上部轉(zhuǎn)運, 提高地上部NO3–/Cl–比, 同時降低地上部Na+的積累, 進而增強植株的耐鹽性[62]。本文苗期根系轉(zhuǎn)錄組分析顯示, 部分基因在鹽脅迫下差異表達, 其中顯著上調(diào)和下調(diào)的各10余個。、、、、、在鹽脅迫后6 h或12 h顯著上調(diào), 說明其參與到棉花對鹽脅迫的早期響應(yīng);、和的表達先降低(6 h)后持續(xù)升高, 表明其可能參與到棉花對鹽脅迫的長期響應(yīng)。鹽脅迫下調(diào)了芥菜和擬南芥中、的表達[63], 本研究中其同源基因和也在鹽脅迫后下調(diào)。這些基因響應(yīng)鹽脅迫的機制有待進一步研究。

3.3 根系和葉片中GhNRTs基因?qū)┑降捻憫?yīng)揭示其在氮素吸收轉(zhuǎn)運中的重要作用

擬南芥AtNRT1.1是首個被鑒定的雙親和NO3–轉(zhuǎn)運蛋白, 在根系中負責吸收NO3–, 并可促進NO3–由根向地上部的轉(zhuǎn)運[64-65]。本研究中, 其同源基因可能也具有雙親和吸收NO3–的能力(圖9-C)。擬南芥受氮饑餓誘導(dǎo)而上調(diào), 并在恢復(fù)氮素供應(yīng)后受到抑制[66]。是的同源基因, 雖然與一樣含有MFS_1結(jié)構(gòu)域(圖2), 但其表達量從低氮恢復(fù)正常供氮后大幅上調(diào)(圖9-A), 提示其可能編碼低親和NO3–轉(zhuǎn)運蛋白, 而不是像那樣編碼高親和NO3–轉(zhuǎn)運蛋白。此外, 擬南芥中的[67]和[24]均為低親和NO3–轉(zhuǎn)運體, 而棉花同源基因可能行使雙親和吸收NO3–的功能,則可能編碼高親和NO3–轉(zhuǎn)運蛋白?？梢? 不同物種的同源基因并不一定具有相似或相同的功能。

據(jù)報道, 低氮條件下擬南芥在地上部的表達增強, 可促進NO3–積累、抑制葉片變黃[68]。是的高度同源基因, 可促進葉柄處NO3-的積累以調(diào)節(jié)葉片NO3–通量[24]。水稻主要在根和葉枕表達, 參與NO3–的再分配[69]。本研究結(jié)果表明, 棉花同源基因、和在功能葉和老葉中受到NO3-饑餓誘導(dǎo)后下調(diào), 而由低氮恢復(fù)正常供氮時上調(diào)表達, 因此可能具有卸載NO3-的功能。

啟動子上的順式作用元件在調(diào)節(jié)基因表達模式中發(fā)揮重要作用[70]。棉花、和在葉片中的表達量較高, 其啟動子區(qū)域也具有較多的綠色組織特異性光響應(yīng)元件, 其中和分別具有7個和5個。擬南芥AtNPF7.3負責木質(zhì)部NO3-裝載并向地上部運輸[67], 該轉(zhuǎn)運體在非生物脅迫下可與ET (乙烯)和JA (茉莉酸)組成ET/JA-NRT信號模塊, 其中乙烯信號途徑中的EIN3/EIL1 (Ethylene Insensitive3/EIN3-Like1)可直接結(jié)合在啟動子上抑制其表達, JA信號途徑中的COI1 (coronatine insensitive1)也可下調(diào)的表達, 從而減少NO3-向地上部的運輸、增加根系中的NO3?積累, 提高植物的脅迫耐受能力[56]。本研究中,同源基因的啟動子區(qū)域含有多個ET (6個)和JA (2個)響應(yīng)元件(圖5), 推測其可能也會與ET和JA組成模塊參與NO3–的吸收或轉(zhuǎn)運。

4 結(jié)論

本研究對陸地棉硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白家族進行了全基因組分析, 首次從棉花中鑒定出120個NRT, 根據(jù)進化分支及基序結(jié)構(gòu)等, 將其劃分為10種類型(I～X)。雖然不同類型NRT在基因數(shù)量和結(jié)構(gòu)上存在一定差異, 但整體上具有高度保守性。絕大多數(shù)基因的啟動子區(qū)域都含有脫落酸、乙烯和光響應(yīng)元件。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn), 在花器官中高表達的多為成員,成員則多在根中高表達。鹽脅迫后, VI類顯著下調(diào)的基因數(shù)最多, IV和V類顯著上調(diào)的基因數(shù)最多。根據(jù)表達水平對外界NO3–變化的響應(yīng), 推測和分別具有低親和、高親和吸收NO3–的能力,和則可能編碼雙親和NO3–轉(zhuǎn)運蛋白。此外,、和還可能參與功能葉和老葉中的NO3–卸載。本研究為深入揭示陸地棉基因的結(jié)構(gòu)和功能提供了初步依據(jù)。

致謝:感謝中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院易飛副教授對本文細致的修改; 感謝中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院廖寶鵬博士生在系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建方面的幫助; 感謝中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院方孝薦博士生細心指導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)育樹的美化。

附表 請見網(wǎng)絡(luò)版: 1) 本刊網(wǎng)站http://zwxb. chinacrops.org/; 2) 中國知網(wǎng)http://www.cnki.net/; 3) 萬方數(shù)據(jù)http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb.aspx。

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Identification and expression analysis of nitrate transportergene family in upland cotton (L)

MA Chun-Min1, LI Wei-Xi2, LI Fang-Jun1, TIAN Xiao-Li1,*, and LI Zhao-Hu1

1Crop Chemical Control Research Center, College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193, China;2State Key Laboratory of Crop Genetics & Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China

Nitrate transporters (NRTs) play an important role in plant nitrogen absorption, utilization, and storage. In this study, 106 GhNRT1/PTR (NPF) (Nitrate transporter 1 (NRT1) / Peptide Transporter (PTR) family (NPF)) and 14 GhNRT2 (Nitrate transporter 2 family) were identified fromL. (TM-1) by HMM software and Blastp method. The conserved domains, phylogenetic relationships, physicochemical properties, subcellular localization, conserved motifs, gene structure, promoter cis-acting elements, and expression patterns of these GhNRTs were analyzed. The results showed that GhNPF had a typical PTR2 (Peptide Transporter 2 family) domain. Two PTR2 and/or other domains were found in individual proteins (GhNPF2.6bD, GhNPF4.1cA, and GhNPF2.14aD), indicating that GhNPF was less evolutionarily conserved. The GhNRT2 had a typical MFS_1 (Major Facilitator Superfamily) domain. Most proteins were located on the cytoplasmic membrane with hydrophobic properties. Phylogenetic analysis showed that these GhNRTs could be divided into 10 groups, and the same group had similar gene structure and motif distribution. The composition of-acting elements indicated that the relative expression levels of mostcould be related to plant hormones, abiotic stress, and light response. In addition, the relative expression patterns ofwere different among the diverse subgroups, but the relative expression patterns of different members in the same subgroup were mostly conserved.genes were mainly expressed in roots. Moreover, the transcriptome data with salt stress treatment revealed that the relative levels of nearly 1/5were significantly up-regulated or down-regulated, indicating that they probably function in response to salt stress. Sixwere selected to detect the response of their expression in roots, young leaves, functional leaves, and old leaves to different NO3–supply levels. The results showed thatandmay have the ability to absorb NO3–with dual affinity, whilemay encode high-affinity NO3–transporter. The three may be involved in NO3–unloading in functional leaves and old leaves. These results were different from those reported in plants such as. In conclusion, the results provide a reference for further functional characterization of nitrate transporters and provide a preliminary basis for the mechanism analysis of nitrogen absorption and utilization in cotton.

L.; nitrate transporters; GhNPF; GhNRT2; expression pattern

10.3724/SP.J.1006.2023.24159

本研究由國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2011ZX08005-004-008)資助。

This study was supported by the National Major Project for Developing New GM Crops (2011ZX08005-004-008).

田曉莉, E-mail: tianxl@cau.edu.cn

E-mail: lmjy611@126.com

2022-07-10;

2022-10-10;

2022-10-24.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20221021.1759.012.html

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