詹士立,何欣,陳效燕,柳愛春*,張發(fā)忠,李詩言

(1.杭州千島湖鱘龍科技股份有限公司,浙江 杭州 311700;2.杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院,浙江 杭州 310024;3.浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站,浙江 杭州 310023)

俄羅斯鱘(Acipensergueldenstaedtii),屬硬骨魚綱、鱘形目、鱘科、鱘屬。鱘因其營養(yǎng)價值與經(jīng)濟價值高,抗病力較強,卵做成的魚子醬有“黑色黃金”的美譽[1],經(jīng)濟效益顯著,近年來在中國淡水養(yǎng)殖品種中占據(jù)重要地位,養(yǎng)殖規(guī)模也不斷擴大。目前,中國已是世界上最大的鱘養(yǎng)殖與魚子醬生產(chǎn)國[2]。盡管鱘養(yǎng)殖經(jīng)濟效益顯著,但養(yǎng)殖周期較長[3],期間一旦暴發(fā)疾病,易造成較大的經(jīng)濟損失,需選擇使用抗生素和化學藥物來應對魚類發(fā)病[4]。

恩諾沙星(Enrofloxacin) 屬于喹諾酮類抗菌藥物,是動物專用的抗生素。目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中也廣泛使用,主要用于細菌性傳染病的前期預防和治療,對鱘氣單胞菌[5]、爛鰓病[6]、腸炎病有很好的治療作用,但長期使用后,會引發(fā)藥物殘留問題,大量研究表明,在許多動物體內(nèi),恩諾沙星主要以原藥形式通過腎臟排出體外[7],少量恩諾沙星會發(fā)生脫乙基反應,代謝生成環(huán)丙沙星(Ciproflocacin)[8]后排出體外,不同的種屬代謝程度有明顯差異。藥物殘留影響產(chǎn)品的質(zhì)量安全,尤其目前出口水產(chǎn)品質(zhì)量安全要求更高,歐洲、美國對進口水產(chǎn)品要求不得檢出恩諾沙星等藥物殘留[9]。因此為確保水產(chǎn)品質(zhì)量安全,極有必要對俄羅斯鱘體內(nèi)恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的藥動學與消除規(guī)律進行研究。

本研究采用口服連續(xù)給藥的方式,研究一年以內(nèi)俄羅斯鱘血漿、肌肉和肝臟中恩諾沙星的代謝動力學和消除規(guī)律,為恩諾沙星在俄羅斯鱘養(yǎng)殖中的使用和長期代謝消除情況提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物與主要試劑

恩諾沙星粉(水產(chǎn)用)(濃度≥98%),山東惠民德賽克生物科技有限公司;恩諾沙星標準品(濃度≥99%),上海安譜實驗科技股份有限公司;環(huán)丙沙星標準品(濃度≥99%),上海安譜實驗科技股份有限公司;恩諾沙星D5內(nèi)標物,環(huán)丙沙星D8內(nèi)標物,濃度為100 μg/mL,均購自于上海源葉生物科技有限公司;超純水：采用MILL-Q超純水儀制備,用水符合《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》(GB/T 6682—2008)一級水的標準;甲醇(色譜純),Fisher Chemical 公司;乙腈(色譜純),Fisher Chemical 公司;甲酸(色譜純),ROE Scientific 公司。

1.2 主要儀器

AB4500qtrap高效液相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB SCIEX 公司);HeiVAP型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(Heidolph公司);Multi Reax型渦旋混合器(Heidolph公司);TTL-DCⅡ型多功能氮吹儀(同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司);ULTRA-TURRAX型均質(zhì)機(IKA公司);50 mL塑料離心管(Biofil公司)。

1.3 試驗魚的選擇

試驗用材料魚為健康俄羅斯鱘,153尾,均為雄性。體重為(4 000±500)g,馴養(yǎng)于杭州千島湖鱘龍科技股份有限公司基地的魚池內(nèi)(魚池直徑15.0 m,水深1.5 m)。體態(tài)正常,鰭條完整,體表無明顯外傷、無炎癥,鰭、鰓鏡檢無寄生蟲,解剖觀察肝、脾、腎、腸等組織正常。經(jīng)隨機抽取檢測,俄羅斯鱘體內(nèi)未檢出恩諾沙星和環(huán)丙沙星。試驗前于公司基地的魚池內(nèi)(魚池直徑15.0 m,水深1.5 m,第一個月平均水溫22.5 ℃,全年平均水溫18.5 ℃,RSD=18.07%)暫養(yǎng)一周后開始試驗。養(yǎng)殖水質(zhì)符合漁業(yè)水質(zhì)標準。試驗過程中每天測定2次水溫。

1.4 給藥方式與劑量

給藥方式：拌餌投喂,將恩諾沙星粉用水溶解后,加入飼料拌勻后晾干。投飼給藥后材料魚半小時之內(nèi)吃完,每天按材料魚體重的0.4%投飼給藥。給藥劑量：投飼給藥一天一次,連續(xù)投喂5 d,每天投喂20.0 mg/kg的恩諾沙星(以魚體單位質(zhì)量計)。

1.5 樣品采集與保存

采樣時間點分別為給藥后1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、1 d、2 d、4 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d、42 d、60 d、120 d、180 d、270 d和365 d每個時間點隨機采集3尾俄羅斯鱘,尾椎取血液至少20.0 mL保存于肝素鈉處理后的塑料離心管中,分離血漿。去鱗,沿脊背取肌肉和皮,每一尾俄羅斯鱘取樣量不少于1 000 g,置于研磨機中研磨均勻,四分法縮分,分裝于潔凈容器,密封并標識;取肝臟樣品置于研磨機中研磨均勻。樣品置于-20 ℃冰箱保存,待測。

1.6 組織中恩諾沙星濃度測定方法

1.6.1 前處理方法

前處理方法參照《動物源產(chǎn)品中喹諾酮類殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(GB/T 20366—2006),并作適當修改。具體方法如下：準確稱取5.00 g的樣品于50 mL聚四氟乙烯離心管中,加入50 μL 1 000 ng/mL的氘代恩諾沙星內(nèi)標工作液,渦旋30 s,加入20 mL 2%甲酸-乙腈溶液,均質(zhì)提取1 min,4 000 r/min離心5 min 后取上清液于50 mL聚四氟乙烯離心管中,殘渣加入20 mL甲酸-乙腈溶液重復提取一次,合并提取液[10]。

將上清液轉(zhuǎn)移到125 mL分液漏斗中,加入25 mL乙腈飽和正己烷,振搖2 min,棄去上層溶液,將下層溶液轉(zhuǎn)至100 mL棕色雞心瓶中,于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干,用氮氣流吹干。準確加入1.0 mL甲酸乙腈溶液溶解殘渣,渦旋混勻后,用一次性注射式濾器過濾至樣品瓶中,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.6.2 質(zhì)譜條件

流速：0.2 mL/min;色譜柱：AQ C182.1 mm×150 mm(3.0 μm);柱溫：35.0 ℃,進樣量10.0 μL;流動相：A為質(zhì)量濃度0.15 g/100g的甲酸水溶液;B甲醇。洗脫梯度如下：0～1.0 min,75%A;1.0～8.0 min,75%A～72%A;8.0～9.1 min,72%A;9.1～9.2 min,72%A～65%A;9.2～9.8 min,65%A;9.8～10.0 min,65%A～62%A;10.0～10.2 min,62%A;10.2～10.3 min,62%A～60%A;10.3～11.0 min,60%A;11.0～13.0 min,60%A～75%A;13.0～18.0 min,75%A;各測定目標物的檢測參數(shù)如表1所示。

表1 恩諾沙星、環(huán)丙沙星及內(nèi)標物的串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS/MS parameters of Enrofloxacin,Ciprofloxacin and internal standards

離子源：電噴霧離子化(ESI)負離子模式;電噴霧電壓：-4 500 V;氣簾氣壓力：30 psi;離子源溫度：550 ℃;霧化氣壓力：55 psi;輔助氣壓力：55 psi;碰撞氣：Medium。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用3p97藥動學軟件處理數(shù)據(jù),選取最適合的房室模型,計算藥動學參數(shù)。

2 結(jié)果和分析

2.1 方法學驗證

2.1.1 恩諾沙星和環(huán)丙沙星的色譜圖

按照1.6.2質(zhì)譜條件,以恩諾沙星D5和環(huán)丙沙星D8作為內(nèi)標物,恩諾沙星保留時間為15.00 min左右,環(huán)丙沙星保留時間為14.72 min左右,恩諾沙星濃度為20.20 ng/mL和環(huán)丙沙星濃度為9.5 ng/mL的樣品色譜圖如圖1和圖2所示。

圖1 恩諾沙星濃度為20.20 ng/mL的色譜圖Fig.1 Chromatogram of enrofloxacin in sample at the concentration of 20.20 ng/mL

圖2 環(huán)丙沙星濃度為9.50 ng/mL的樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of ciprofloxacin in sample at the concentration of 9.50 ng/mL

2.1.2 標準工作曲線與定量限

移取恩諾沙星和環(huán)丙沙星標準溶液并稀釋成質(zhì)量濃度分別為5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00和500.00 ng/mL的恩諾沙星和環(huán)丙沙星混合標準溶液,同樣加入恩諾沙星和環(huán)丙沙星內(nèi)標配置標準曲線。按儀器工作條件進行測定。恩諾沙星和環(huán)丙沙星濃度為5.00～500.00 ng/mL范圍內(nèi),濃度與峰面積的線性關(guān)系良好,定量限(LOQ,S/N>10)為5.00 ng/mL。恩諾沙星和環(huán)丙沙星的標準工作曲線如圖3及圖4所示。

圖3 恩諾沙星標準工作曲線Fig.3 Calibration curve of enrofloxacin

圖4 環(huán)丙沙星標準工作曲線Fig.4 Calibration curve of ciprofloxacin

2.1.3 加標回收率

對空白血漿、肌肉和肝臟中加入恩諾沙星和環(huán)丙沙星標準品。俄羅斯鱘各組織中恩諾沙星平均回收率在95.00%～100.60%,環(huán)丙沙星的平均回收率在94.00%～97.70%,相對標準偏差(RSD)均小于10.00%,符合檢測要求。

2.2 恩諾沙星在組織中藥代動力學特征

2.2.1 藥時曲線

經(jīng)過測定,每個時間點俄羅斯鱘血漿中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的質(zhì)量濃度如表2所示。

表2 給藥后不同時間俄羅斯鱘血漿中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的質(zhì)量濃度Tab.2 Concentration of enrofloxacin and ciprofloxacin in plasma of Russian sturgeon at different times after drug administration n=3

經(jīng)過測定,每個時間點俄羅斯鱘肝臟中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的濃度如表3所示。

表3 給藥后不同時間俄羅斯鱘肝臟中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的質(zhì)量濃度Tab.3 Concentration of enrofloxacin and ciprofloxacin in liver of Russian sturgeon at different times after drug administration n=3

經(jīng)過測定,每個時間點俄羅斯鱘肌肉中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的濃度如表4所示。

恩諾沙星在俄羅斯鱘體內(nèi)不同組織中的藥時曲線如圖5和圖6所示。

2.2.2 藥動學參數(shù)及藥動學方程

通過C-t散點圖判別法,給藥后血藥濃度(C)對時間(t)在半對數(shù)坐標紙上的散點圖呈線性分布,恩諾沙星在俄羅斯鱘體內(nèi)可估為一室模型。經(jīng)過3p97藥動學數(shù)據(jù)處理軟件的分析,投喂恩諾沙星后俄羅斯鱘體內(nèi)的血漿、肝臟和肌肉中的恩諾沙星呈一室開放模型,藥動學參數(shù)如表5所示。

表5 恩諾沙星在俄羅斯鱘各組織中的藥動學參數(shù)Tab.5 Pharmacokinetic parameters of enrofloxacin in different tissues of Russian sturgeon n=3

2.3 恩諾沙星在俄羅斯鱘體內(nèi)的吸收與代謝殘留分析

本實驗中采用連續(xù)給藥的方式,連續(xù)5 d給予每尾俄羅斯鱘恩諾沙星20 mg/kg b.w的劑量后持續(xù)一年檢測俄羅斯鱘血漿、肌肉和肝臟中恩諾沙星及環(huán)丙沙星含量的變化。恩諾沙星在各組織的含量整體隨時間的變化而遞減,在7 d內(nèi)的變化劇烈,故單獨考察7 d內(nèi)恩諾沙星和環(huán)丙沙星在俄羅斯鱘體內(nèi)不同組織中的藥時曲線變化,如圖7與圖8所示。

圖7a 7 d內(nèi)恩諾沙星在俄羅斯鱘血漿中的藥時曲線Fig.7a Drug-time curve of enrofloxacin in plasma of Russian sturgeon during 7 days

圖7b 7 d內(nèi)恩諾沙星在俄羅斯鱘肝臟中的藥時曲線Fig.7b Drug-time curve of enrofloxacin in liver of Russian sturgeon during 7 days

圖7c 7 d內(nèi)恩諾沙星在俄羅斯鱘肌肉中的藥時曲線Fig.7c Drug-time curve of enrofloxacin in muscle of Russian sturgeon during 7 days

圖8a 7 d內(nèi)環(huán)丙沙星在俄羅斯鱘血漿中的藥時曲線Fig.8a Drug-time curve of ciprofloxacin in plasma of Russian sturgeon during 7 days

圖8b 7 d內(nèi)環(huán)丙沙星在俄羅斯鱘肝臟中的藥時曲線Fig.8b Drug-time curve of ciprofloxacin in liver of Russian sturgeon during 7 days

圖8c 7 d內(nèi)環(huán)丙沙星在俄羅斯鱘肌肉中的藥時曲線Fig.8c Drug-time curve of ciprofloxacin in muscle of Russian sturgeon during 7 days

俄羅斯鱘血漿中恩諾沙星的質(zhì)量濃度濃度從1 h的1 165.00 μg/kg上升到4 h的峰值2 087.00 μg/kg,隨后開始下降,至270 d檢出含量低于定量限5.00 μg/kg。肝臟中恩諾沙星質(zhì)量濃度從1 h的4 339.00 μg/kg開始上升,2 h達到峰值9 896.70 μg/kg,隨后開始下降,至365 d仍然可以檢出134.72 μg/kg的質(zhì)量濃度。俄羅斯鱘肌肉中恩諾沙星質(zhì)量濃度從1 h開始迅速上升,8 h的峰值2 708.70 μg/kg,隨后開始緩慢下降至1 d時,仍可以檢出1 611.00μg/kg的質(zhì)量濃度,4 d后開始迅速下降,至90 d檢出含量低于定量限(5.00 μg/kg)。

藥物代謝速率和種屬、溫度、給藥方式等因素相關(guān)[11-12]。趙鳳等[13]用高效液相色譜法分析20 ℃條件下恩諾沙星10 mg/kg體重口灌給藥后西伯利亞鱘(Acipenserbaer)血液、肌肉和肝臟組織中恩諾沙星及代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的濃度,藥物濃度時間數(shù)據(jù)采用藥代動力學軟件3p97進行分析,結(jié)果表明：消除半衰期分別為32.046 h、354.987 h和252.194 h。郭嬌嬌等[14]研究了在單次口灌給藥途徑下,恩諾沙星在雜交鱘(施氏鱘Acipenserschrenckii♂×達氏鰉Husodauricus♀)體內(nèi)的藥代動力學。20 ℃下對雜交鱘單次口灌給藥恩諾沙星10 mg/kg體重,恩諾沙星在雜交鱘體內(nèi)消除較慢,在血液、肌肉和肝臟中的消除半衰期分別為290.139 h、114.900 h和901.835 h。劉慧慧等[15]研究恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星在俄羅斯鱘中的代謝及消除規(guī)律,制定恩諾沙星在俄羅斯鱘體內(nèi)的休藥期。在水溫12～15 ℃條件下,以60 mg/(kg·b.w)劑量對體重為(750±50) g的健康俄羅斯鱘灌服恩諾沙星,消除半衰期以皮膚最大t1/2為394.431 h、血漿最小為129.6 h。研究結(jié)果與本研究有顯著性差異。本研究在22.5 ℃的條件下連續(xù)給藥5 d劑量為20 mg/kg的恩諾沙星,血漿、肌肉和肝臟中的消除半衰期分別是53.265 4 h、49.017 9 h和203.517 4 h。表明不同鱘種之間的恩諾沙星消除速率有一定差別,而溫度提高時,恩諾沙星在俄羅斯鱘體內(nèi)的代謝速率會顯著上升。本研究采用的個體大小為4 000 g左右的雄性俄羅斯鱘作為試驗對象,與劉慧慧等的研究結(jié)果比較后表明：同一種屬在不同生長期時對相同藥物的代謝水平不同,在實際用藥時需針對不同生長期的魚類謹慎用藥。

2.4 藥效及休藥期研究

恩諾沙星藥物屬于濃度依賴型抗菌藥物[16],對水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的細菌性疾病的治療效果與藥動學(Pharmacokinetics,PK)和藥效學(Pharmacodynamics,PD)-參數(shù)有關(guān),如峰濃度(Cmax)/最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)。一般認為Cmax/MIC>8時,藥物即可起到良好的治療效果[17],當Cmax/MIC=10時可發(fā)揮最大治療效果。本實驗表明,在22.5 ℃,當用20 mg/kg的劑量連續(xù)5 d混飼給藥后,恩諾沙星在俄羅斯鱘血液肝臟和肌肉中的Cmax分別為2.087 0 μg/g、9.896 7 μg/g和2.708 7 μg/g,所以20 mg/kg b.w的恩諾沙星的劑量可滿足治療效果。

“休藥期”(Withdrawal Time,WDT)是指動物停止給藥到動物性食品(包括可食性組織、蛋、奶等)中藥物殘留濃度下降至最高殘留限量以下所需的時間[18]。中國水產(chǎn)養(yǎng)殖的品種眾多,使用的漁藥種類及各種藥物的制劑類型[19]也較多,極有必要結(jié)合水產(chǎn)養(yǎng)殖的制劑水平和用藥方式開展休藥期研究。根據(jù)《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》(GB 31650—2019)的規(guī)定,恩諾沙星和環(huán)丙沙星在魚肌肉和魚皮中的含量不得高于100 μg/kg[20]。

以此標準為依據(jù)下,恩諾沙星在養(yǎng)殖魚類中的殘留消解規(guī)律已有不少研究,但大多以小型魚類為研究對象,如吉富羅非魚(JifuTilapia)[21],大黃魚(Larimichthyscrocea)[22]、鯽(Carassiusauratus)[23],等,結(jié)果表明恩諾沙星的休藥期大多在600度日以下。目前以大型魚類成年魚為對象的研究極少,本研究中在42 d后俄羅斯鱘肌肉中的恩諾沙星和環(huán)丙沙星的總含量小于100 μg/kg,平均水溫為22.5 ℃,休藥期至少為945度日,遠高于小型魚類,因此在使用恩諾沙星治療俄羅斯鱘成年魚的疾病時,要嚴格執(zhí)行休藥期規(guī)定,避免產(chǎn)生水產(chǎn)品質(zhì)量安全隱患。

3 結(jié)論

為了解恩諾沙星在俄羅斯鱘體內(nèi)的代謝消除規(guī)律,采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定了連續(xù)5 d口服20 μg/(kg·b.w)劑量的恩諾沙星后俄羅斯鱘體內(nèi)各組織中恩諾沙星的質(zhì)量濃度變化趨勢,并通過3p97藥動學軟件進行數(shù)據(jù)處理。研究結(jié)果表明：俄羅斯鱘魚血漿和肌肉中的恩諾沙星在365 d后低于檢出限,而在肝臟中仍然有較高濃度的含量;在治療病害時,20 mg/(kg·b.w)的恩諾沙星的劑量可滿足治療效果;以肌肉和魚皮計,恩諾沙星在俄羅斯鱘養(yǎng)殖過程中的休藥期至少為945度日。