余秋男 劉京讓 宋海龍

創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是全球死亡率和發(fā)病率的主要原因,該疾病造成的全球經(jīng)濟損失約為4 000億美元,占世界生產(chǎn)總值的0.5%[1]。目前對于原發(fā)性頭部創(chuàng)傷的有效治療方案較多,但治療繼發(fā)性損傷的治療方案主要是降低炎性反應、阻止急性期神經(jīng)元死亡、減少氧化應激損傷以及抗神經(jīng)興奮性毒性[2]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)最初被認為是轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)品,但越來越多的證據(jù)表明lncRNA在調(diào)節(jié)許多生物學過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。核富集轉(zhuǎn)錄本1(Neat1)作為LncRNA家族中的一員,在TBI發(fā)生后具有顯著變化[3]。微小RNA(miRNA)可參與許多疾病的病理生理過程,且腦特異性miRNA的檢測可作為TBI的替代標志物。研究表明miR-128-3p有望作為TBI血液中的生物標志物[4]。生物信息學預測到Neat1與miR-128-3p存在結(jié)合位點。本實驗通過自由落體法建立TBI小鼠模型,探討LncRNANeat1靶向調(diào)節(jié)miR-128-3p表達對TBI小鼠認知功能和神經(jīng)炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:清華大學提供雄性、BALB/c小鼠80只,要求:8周齡,體重25～28 g,許可證號:SCXK(京)2019-0016。小鼠飼養(yǎng)溫度、濕度分別為:22℃～25℃、55%～65%,定時通風、消毒。本研究經(jīng)動物倫理委員會批準。

1.1.2 試劑與儀器:武漢普諾賽生命科技有限公司提供293T細胞(產(chǎn)品編號:CL-0005);由上海生工生物有限公司構(gòu)建野生型和突變型Neat1熒光素酶報告基因載體(Neat1 WT、Neat1 MUT);由上海生工生物工程有限公司合成腺病毒空載體組(Ad-NC)、Neat1過表達腺病毒(Ad-Neat1)、miR-128-3p模擬物陰性對照(immics NC)、miR-128-3p抑制物陰性對照(inhibitor NC)、miR-128-3p模擬物(miR-128-3p mimic)、miR-128-3p抑制物(miR-128-3p inhibitor)以及Neat1、miR-128-3p、U6、β-actin引物;上海恪敏生物科技有限公司提供白細胞介素-6(IL-6,貨號:BH8273)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(貨號:E-EL-M0049);abcam公司提供半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1,caspase-1,貨號:ab179515)、核因子-κB p65(NF-κB p65,貨號:ab207297)、磷酸化核因子-κB p65(Phospho-Nuclear factor-κB p65,p-NF-κB p65;貨號:ab76302)一抗。上海豫光儀器有限公司提供熒光顯微鏡;美谷分子儀器有限公司全功能酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 TBI小鼠模型的制備[5]:將小鼠隨機分為造模組(70只)和假手術(shù)組(10只),戊巴比妥麻醉小鼠,對其頭皮進行消毒,沿小鼠頭頂正中央切開,于右側(cè)頂葉進行開窗手術(shù),之后固定小鼠;在顱骨上方15 cm處自由降落小錘(質(zhì)量約為20 g),縫合頭皮。創(chuàng)傷后取出腦組織,觀察小鼠有創(chuàng)傷灶出現(xiàn),且伴隨出血、傷灶周圍腦組織挫傷等現(xiàn)象時,表明造模成功。假手術(shù)組小鼠僅開窗、縫合,但不敲擊。

1.2.2 qRT-PCR檢測血清中Neat1、miR-128-3p表達水平:選取各組小鼠,靜脈取血,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進行qRT-PCR反應,反應體系、條件參照qRT-PCR試劑盒說明書。分別以U6、GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt計算Neat1、miR-128-3p相對表達水平。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 TBI小鼠分組及干預:將70只造模組小鼠隨機分為模型組、Ad-NC組、Ad-Neat1組、inhibitor NC組、miR-128-3p inhibitor組、Ad-Neat1+miR-128-3p mimic組、Ad-Neat1+mimic NC組,10只/組,另取10只假手術(shù)組小鼠。將小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后,對頭部消毒,于正中切開皮膚、分離骨膜。固定頭部于腦立體定位儀中,將Ad-Neat1組、Ad-NC組小鼠分別于側(cè)腦室注射4.5 μl重組腺病毒、空載體腺病毒,注射速度為0.2 μl/min、病毒滴度為4×1010PFU/ml[6];inhibitor NC組、miR-128-3p inhibitor組分別注射40 mg/kginhibitor NC、miR-128-3p inhibitor[7];Ad-Neat1+miR-128-3p mimic組、Ad-Neat1+mimic NC組分別先注射4.5 μl重組腺病毒,再分別注射40 mg/kg miR-128-3p mimic、inhibitor NC;假手術(shù)組、模型組小鼠注射等體積的0.9%氯化鈉溶液,1次/d,連續(xù)1周。

1.2.4 測定小鼠認知功能:干預完成后,對8組小鼠進行Morris水迷宮實驗,測定逃避潛伏期、穿越原平臺位置的次數(shù),作為小鼠認知功能的評價標準[8]。

1.2.5 ELISA檢測小鼠血清中炎性因子水平:水迷宮實驗實驗結(jié)束后,麻醉小鼠,靜脈取血,離心取上清,按照ELISA試劑盒步驟進行檢測。

1.2.6 HE染色觀察小鼠傷灶周圍腦組織病變狀況:取適量小鼠傷灶周圍腦組織,制作切片,行HE染色,脫水,封片,于顯微鏡下觀察病理變化。

1.2.7 雙熒光素酶檢驗Neat1、miR-128-3p關(guān)系:生物信息學方法預測到Neat1、miR-128-3p存在結(jié)合位點。常規(guī)培養(yǎng)293T細胞并分為miR-128-3p mimic+Neat1 WT組、mimic-NC+Neat1 WT組、miR-128-3p mimic+Neat1 MUT組和mimic-NC+Neat1 MUT組,分別將miR-128-3p mimic與突變型、野生型Neat1 3’UTR,mimic-NC與突變型、野生型Neat1 3’UTR,轉(zhuǎn)染48 h后測定熒光素酶活性。

1.2.8 Western blot檢測傷灶周圍腦組織中caspase-1、p-NF-κB p65/NF-κB p65表達:取適量小鼠傷灶周圍腦組織,加入裂解液,測定蛋白總濃度,分離,轉(zhuǎn)膜、封閉。加入caspase-1、NF-κB p65、p-NF-κB p65一抗于4℃孵育過夜,洗膜后,加入二抗室溫孵育2 h,顯影,曝光,β-actin為內(nèi)參,分析8組蛋白表達水平。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清中Neat1、miR-128-3p表達水平 模型組Neat1表達較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05),而miR-128-3p表達水平顯著增加(P<0.05)。見表2。

表2 小鼠血清中Neat1、miR-128-3p表達水平比較

2.2 8組小鼠傷灶周圍腦組織病理學變化 假手術(shù)組小鼠腦組織無病理損傷;模型組、Ad-NC組、inhibitor NC組小鼠傷灶周圍腦組織均出現(xiàn)大量炎性浸潤、細胞壞死現(xiàn)象;與Ad-NC組比較,Ad-Neat1組炎性浸潤、細胞壞死明顯降較少;與inhibitor NC組比較,miR-128-3p inhibitor組病理現(xiàn)象均得到改善;與Ad-Neat1+mimic NC組比較,Ad-Neat1+miR-128-3p mimic組炎性浸潤、細胞壞死現(xiàn)象加重。見圖1。

假手術(shù)組 模型組 Ad-NC組 Ad-Neat1組

2.3 預測與驗證Neat1、miR-128-3p的靶向關(guān)系 生物信息學預測Neat1、miR-128-3p存在結(jié)合位點。Neat1 WT+mimic NC組比較,Neat1 WT+miR-128-3p mimic組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05);Neat1 WT+miR-128-3p mimic組、Neat1 MUT+mimic NC組、Neat1 MUT+miR-128-3p mimic組熒光素酶活性無明顯變化(P<0.05)。見圖2,表3。

圖2 生物信息網(wǎng)預測Neat1、miR-128-3p結(jié)合位點;WT:wild-type,野生型;MUT:mutant-type,突變型

表3 熒光素酶檢測Neat1、miR-128-3p的靶向關(guān)系

2.4 Neat1過表達對TBI小鼠血清炎性因子、認知功能及Neat1表達的影響 模型組、Ad-NC組IL-6、TNF-α含量、平均逃避潛伏期較假手術(shù)組顯著增加(P<0.05),而Neat1表達、穿越平臺次數(shù)顯著降低(P<0.05);Ad-Neat1組IL-6、TNF-α含量、平均逃避潛伏期較Ad-NC組顯著降低(P<0.05),而Neat1表達、穿越平臺次數(shù)顯著增加(P<0.05)。見表4。

表4 過表達Neat1對TBI小鼠中Neat1表達、炎性因子、認知功能的影響

2.5 沉默miR-128-3p對TBI小鼠血清炎性因子、認知功能及Neat1表達影響 模型組、inhibitor NC組IL-6、TNF-α含量、miR-128-3p表達、平均逃避潛伏期較假手術(shù)組顯著增加(P<0.05),而穿越平臺次數(shù)顯著降低(P<0.05);miR-128-3p inhibitor組IL-6、TNF-α含量、miR-128-3p表達、平均逃避潛伏期較inhibitor NC組顯著降低(P<0.05),而穿越平臺次數(shù)顯著增加(P<0.05)。見表5。

表5 過表達Neat1對TBI小鼠中Neat1表達、炎性因子、認知功能的影響

2.6 Neat1過表達或沉默miR-128-3p對傷灶周圍腦組織中caspase-1、p-NF-κB p65/NF-κB p65表達的影響 模型組、inhibitor NC組caspase-1、p-NF-κB p65/NF-κB p65表達較假手術(shù)組顯著增加(P<0.05);miR-128-3p inhibitor組caspase-1、p-NF-κB p65/NF-κB p65表達較inhibitor NC組顯著降低(P<0.05);模型組、Ad-NC組caspase-1、p-NF-κB p65/NF-κB p65表達較假手術(shù)組顯著增加(P<0.05);Ad-Neat1組caspase-1、p-NF-κB p65/NF-κB p65表達較Ad-NC組顯著降低(P<0.05)。見圖3,表6。

圖3 8組小鼠caspase-1、NF-κB p65蛋白表達Western blot圖;A為假手術(shù)組;B為模型組;C為Ad-NC組;D為Ad-Neat1組;E為inhibitor NC組;F為miR-128-3p inhibitor組;G為Ad-Neat1+mimic NC組;H為Ad-Neat1+miR-128-3p mimic組

表6 Neat1過表達或沉默miR-128-3p對傷灶周圍腦組織中caspase-1、p-NF-κB p65/NF-κB p65表達的影響

2.7 過表達Neat1和miR-128-3p對TBI小鼠炎性因子、認知功能及caspase-1、p-NF-κB p65/NF-κB p65表達的影響 Ad-Neat1+miR-128-3p mimic組IL-6、TNF-α含量、平均逃避潛伏期、caspase-1、p-NF-κB p65/NF-κB p65表達較Ad-Neat1+mimic NC組顯著增加(P<0.05),而穿越平臺次數(shù)顯著降低(P<0.05),但各項指標與Ad-Neat1組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表7。

表7 過表達Neat1和miR-128-3p對TBI小鼠中炎性因子、認知功能的影響

3 討論

TBI可定義為外力引起的腦功能紊亂等一系列腦病理疾病,屬于常見的神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病。據(jù)報道全球每年有250多萬人受其影響[9]。該疾病的發(fā)病率、致殘率及致死率均較高,嚴重影響患者及家庭的生活[10]。因此本實驗通過自由落體方法復制TBI小鼠模型,當小鼠有創(chuàng)傷灶出現(xiàn),且伴隨出血、傷灶周圍腦組織挫傷等現(xiàn)象時,表明造模成功,可進行關(guān)注該病的探索。

lncRNA是一類長度>200個核苷酸的RNA,在人體組織中廣泛表達。研究表明,lncRNA 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達,影響大腦發(fā)育和功能[11]。Chai等[12]研究發(fā)現(xiàn),Neat1上調(diào)可以通過抑制PIDD1-caspase-2通路,減少caspase-1的活化,減少細胞色素C的釋放,改善腦外傷后繼發(fā)性腦損傷。Zhong等[13]研究發(fā)現(xiàn)貝沙羅汀上調(diào)lncRNA Neat1,抑制炎性反應,從而使TBI小鼠的運動和認知功能得到改善。本實驗結(jié)果表明模型組Neat1表達較假手術(shù)組顯著降低,表明Neat1下調(diào)與TBI關(guān)系密切,Ad-Neat1組IL-6、TNF-α含量、平均逃避潛伏期較Ad-NC組顯著降低,而Neat1表達、穿越平臺次數(shù)顯著增加。表明過表達Neat1可以減輕炎性浸潤,改善小鼠認知功能。

mRNAs轉(zhuǎn)錄后參與各種病理生理過程,包括腦損傷的發(fā)生。O’Connell等[4]研究發(fā)現(xiàn)TBI患者的血清中miR-128-3p水平顯著上升,在急性期護理中可作為TBI的生物標志物。本實驗研究發(fā)現(xiàn)TBI小鼠中miR-128-3p水平顯著上升miR-128-3p inhibitor組IL-6、TNF-α含量、miR-128-3p表達、平均逃避潛伏期較inhibitor NC組顯著降低,而穿越平臺次數(shù)顯著增加。表明抑制miR-128-3p表達可以改善小鼠認知功能,降低炎性反應。

生物信息學預測Neat1與miR-128-3p存在結(jié)合位點。Chen等[14]研究報道了NEAT1/miR-128-3p/ITGA5軸參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進展,并可能為治療膠質(zhì)瘤提供一種新的潛在策略。Xian等[15]研究表明NEAT1通過靶向調(diào)節(jié)miR-128-3p,可降低炎性反應,緩解脊髓損傷誘導的神經(jīng)性疼痛。另外,Caspase1在細胞凋亡過程中可導致炎性因子的大量釋放,而細胞凋亡又與TBI密切相關(guān)[16]。NF-κB信號通路廣泛參與TBI的發(fā)生發(fā)展過程,抑制NF-κB信號通路可減輕炎性因子的釋放以發(fā)揮神經(jīng)抗炎作用[17]。本實驗經(jīng)熒光素酶實驗驗證miR-128-3p為Neat1靶向作用點,且研究發(fā)現(xiàn)Ad-Neat1+miR-128-3p mimic組IL-6、TNF-α含量、caspase-1、p-NF-κB p65/NF-κB p65、平均逃避潛伏期較Ad-Neat1+mimic NC組顯著增加,而穿越平臺次數(shù)顯著降低。表明miR-128-3p mimic可通過調(diào)控Caspase1、NF-κB表達逆轉(zhuǎn)LncRNA Neat1發(fā)揮的作用。

綜上所述,LncRNA Neat1過表達可以靶向抑制miR-128-3p表達,抑制炎性反應,改善TBI小鼠認知功能,為TBI的研究提供新思路,但由于作用機制復雜,還需再探索。