陳福將，吳超雄，蔡振蕩，何麗丹

溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院兒科，浙江溫州 325000

毛細(xì)支氣管炎是嬰幼兒最常見的下呼吸道感染。NF-κB 是一種二聚體轉(zhuǎn)錄因子,參與炎癥、宿主免疫反應(yīng)、細(xì)胞黏附、生長信號、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡[1]。近來的研究報道，NF-κB 通路在RSV 感染小鼠的氣道炎癥中具有關(guān)鍵作用[2]。研究顯示，腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α），白細(xì)胞介素-8（interleukin-1，IL-8）和白?細(xì)胞介素-6（interleukin-1，IL-6）等細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)NF-κB 過表達(dá)[3]；NF-κB 家族成員的RelA（p65）可以調(diào)節(jié)多個下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性[4]。研究證明，?miRNA 參與誘導(dǎo)肺內(nèi)炎癥，其與肺內(nèi)炎癥之間的關(guān)系及其作用值得進(jìn)一步研究。目前為止，有關(guān)miRNA 在毛細(xì)支氣管炎中的作用的研究報道不多。研究顯示，在肺炎小鼠模型中，miR-302e 的表達(dá)降低，miR-302e 的過表達(dá)可減少炎癥并抑制RelA，BRD4 和NF-κB 的蛋白表達(dá)[5]。本研究旨在觀察吸入糖皮質(zhì)激素對毛細(xì)支氣管炎患兒 miR-302e、NF-κB RNA 表達(dá)的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

毛細(xì)支氣管炎組：選取2021 年1 至9 月溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院的毛細(xì)支氣管炎住院患兒 60例，均為首次發(fā)病，無基礎(chǔ)心肺疾病、無免疫抑制及免疫缺陷疾?。?0 例患兒采用隨機數(shù)字表法隨機分成激素組和非激素組，非激素組常規(guī)予可必特、沐舒坦霧化吸入，氣道阻塞嚴(yán)重者給予吸痰和氧療；激素組入院后即加用普米克令舒（布地奈德懸浮液）霧化吸入，>2 歲1.0mg，<1 歲0.5mg，2次/d，連用5d。參考Bearman 等[6]提出的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)入院臨床癥狀（呼吸次數(shù)、哮鳴音、發(fā)紺情況、輔助呼吸機參與）評分分為輕度組、中重度組。對照組：收集同期本院保健門診體檢健康兒31 例，無個人和家族特應(yīng)癥（如支氣管哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎等）病史。本研究通過溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會的審查批準(zhǔn)（倫理審批號：2021-L-040），并得到患兒監(jiān)護人的知情同意。

1.2 方法

①血清標(biāo)本采集：各組患兒于入院后次晨抽取空腹靜脈血2ml，毛細(xì)支氣管炎組在入院后第5 天再次抽取恢復(fù)期靜脈血2ml，室溫（20～25℃）放置60min，2000 轉(zhuǎn)/分離心10min，留取血清-70℃凍存?zhèn)錅y。② RT-PCR 檢測：全血檢測miR-302e、NF-κB（p65）RNA 的表達(dá)水平，各組患兒于入院后次晨另取空腹靜脈全血2ml，毛細(xì)支氣管炎組在入院后第5天再次抽取恢復(fù)期靜脈血2ml，-70℃凍存?zhèn)錅y。首先按照Trizol 試劑說明書提取總RNA，去除基因組DNA，加入引物酶RT 酶混合物I、RT 引物混合物、M-MuLV 反向轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA；然后PCR 擴增，PCR 反應(yīng)體系：2×SYBR 綠色qPCR 主混合物，正向引物、反向引物、cDNA、RNase 游離水。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上點樣，電泳25min 后，用SmartView 凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)掃描分析擴增產(chǎn)物條帶，分別測定各擴增帶灰度值，以各目的基因擴增帶灰度值比內(nèi)參照GAPDH 擴增帶灰度值，作為其RNA 水平的指標(biāo)。主要試劑來源：RT-PCR 試劑盒由Servicebio 公司提供，瓊脂糖凝膠電泳檢測試劑由北京索萊寶科技有限公司提供，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。應(yīng)用2-△△Ct方法計算miR-302e、NF-κB（p65）RNA 相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 10.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，正態(tài)分布的兩組樣本均數(shù)比較采用t檢驗，方差不齊者用t’檢驗,多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊者兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊者用DunnettT3檢驗，兩兩比較采用q檢驗。兩變量相關(guān)分析采用Bivariate 過程的Pearson等級相關(guān)法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

毛細(xì)支氣管炎患兒激素組與非激素組患兒的年齡、體質(zhì)量、入院前病程及住院天數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。對照組31 例，男15例，女16 例，平均（8.64±2.62）月齡，各組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表1 毛細(xì)支氣管炎患兒激素組與非激素組臨床資料比較（± s）

表1 毛細(xì)支氣管炎患兒激素組與非激素組臨床資料比較（± s）

2.2 急性期毛細(xì)支氣管炎組與對照組血miR-302e、NF-κB（p65）RNA 表達(dá)水平比較

熒光定量RT-PCR 檢測結(jié)果顯示急性期毛細(xì)支氣管炎激素組、非激素組患兒血miR-302e 的表達(dá)水平均顯著低于對照組，NF-κB（p65）RNA 的表達(dá)水平均顯著高于對照組，用2-△△Ct方法計算RNA 相對表達(dá)量，見表2。

表2 急性期各組血miR-302e、NF-κB RNA 表達(dá)比較（± s，pg/ml）

表2 急性期各組血miR-302e、NF-κB RNA 表達(dá)比較（± s，pg/ml）

注：與對照組比較，*P<0.01

2.3 恢復(fù)期毛細(xì)支氣管炎組血miR-302e、NF-κB RNA 表達(dá)水平比較

熒光定量RT-PCR 檢測結(jié)果顯示：恢復(fù)期毛細(xì)支氣管炎激素組患兒血miR-302e 的表達(dá)水平顯著高于非激素組，而NF-κB（p65）RNA 的表達(dá)水平顯著低于非激素組，應(yīng)用2-△△Ct方法計算RNA 相對表達(dá)量，見表3。

表3 恢復(fù)期毛細(xì)支氣管炎組血miR-302e、NF-κB RNA表達(dá)比較（± s，pg/ml）

表3 恢復(fù)期毛細(xì)支氣管炎組血miR-302e、NF-κB RNA表達(dá)比較（± s，pg/ml）

2.4 相關(guān)性分析

兩變量Pearson 等級相關(guān)法分析結(jié)果顯示毛細(xì)支氣管炎患兒血miR-302e 的表達(dá)水平與NF-κB（p65）RNA 的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.727，P<0.01）；毛細(xì)支氣管炎患兒血miR-302e、NF-κB（p65）RNA的表達(dá)水平與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，其中miR-302e 的表達(dá)水平與入院臨床癥狀評分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.845，P<0.01），而NF-κB（p65）RNA 的表達(dá)水平與入院病情評分呈正相關(guān)（r=0.694，P<0.01）。

3 討論

研究顯示，支氣管炎的氣道具有NF-κB 家族（RelA 和NF-κB2）的上調(diào),且具有較高水平的NF-κB誘導(dǎo)的TH2型細(xì)胞因子（白細(xì)胞介素10、13）[4]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，RSV 感染毛細(xì)支氣管炎小鼠存在RelA（p65）的高表達(dá)，抑制NF-κB/IL-33/ST2 軸可以減輕RSV 感染引起的急性細(xì)支氣管炎[7]。Mishra等[8]認(rèn)為NF-κB 調(diào)節(jié)許多促炎介質(zhì)、黏附分子、呼吸道黏蛋白及生長和血管生成因子的表達(dá)，NF-κB通路激活在哮喘發(fā)病機制中發(fā)揮主要作用。

本研究結(jié)果表明，急性期毛細(xì)支氣管炎激素和非激素組NF-κB（p65）RNA 的表達(dá)水平均顯著高于健康對照組，與RSV 感染的毛細(xì)支氣管炎小鼠NF-κB（p65）RNA 的高表達(dá)研究結(jié)果相一致[7]。另外本研究相關(guān)分析表明，毛細(xì)支氣管炎組血NF-κB（p65）RNA 的表達(dá)水平與入院時評分呈正相關(guān)，表明毛細(xì)支氣管炎患兒血NF-κB（p65）RNA 的表達(dá)水平與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

miRNA 在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用，在呼吸道病毒誘發(fā)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，已引起越來越多的關(guān)注[10-11]。研究表明，哮喘小鼠肺組織中檢測到多種miRNA 顯著差異性改變，這些miRNA參與調(diào)節(jié)哮喘的氣道炎癥、轉(zhuǎn)化生長因子β 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及包括凋亡和炎癥在內(nèi)一些信號通路[12]。Mi-RNA 是哮喘診斷和嚴(yán)重程度評估的有前途的工具[13]。有關(guān)miRNA 在毛細(xì)支氣管炎中的研究報道不多，研究顯示，miR-26b 在毛細(xì)支氣管炎患兒血淋巴細(xì)胞中存在差異表達(dá)，可能參與了炎癥的發(fā)生[14]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，RSV 感染降低了氣道上皮細(xì)胞中miR-34b/miR-34c 的表達(dá)，從而導(dǎo)致RSV 疾病中的黏液過度分泌[15]。Zhang 等[16]在嚴(yán)重RSV 相關(guān)肺炎的研究發(fā)現(xiàn)，顯著上調(diào)的miRNA 有miR-1271-5p、miR-10a-3p 等，可能反映嚴(yán)重的RSV 相關(guān)性肺炎，這些miRNA 靶基因參與了NF-κB 信號通路。Xiao等[17]研究顯示，miR-302e 通過抑制NF-κB 活化來抑制過敏性炎癥，表明miR-302e 可能在過敏性疾病中發(fā)揮抗炎作用，并作為治療過敏性疾病的新治療靶點發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，毛細(xì)支氣管炎激素組、非激素組患兒血miR-302e 的表達(dá)水平均顯著低于健康對照組，相關(guān)分析結(jié)果表明毛細(xì)支氣管炎患兒血miR-302e 的表達(dá)水平與入院時評分呈負(fù)相關(guān)，表明毛細(xì)支氣管炎患兒血miR-302e 的低表達(dá)與毛細(xì)支氣管炎的病情密切相關(guān)，能反映毛細(xì)支氣管炎的氣道炎癥程度。

研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素在炎癥過程中可以通過糖皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)調(diào)節(jié)miRNA 的表達(dá)，如參與炎癥反應(yīng)的miR-98、miR-155 和miR-511[18]。在感染性休克的研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松刺激以濃度依賴性方式增加了敗血性休克患者T 淋巴細(xì)胞的增殖，并顯著降低了miRNA-155 的水平，認(rèn)為糖皮質(zhì)激素可能通過miRNA-155 途徑調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞的增殖[19]。兒童哮喘的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 與長期吸入糖皮質(zhì)激素反應(yīng)密切相關(guān)，并證明miR-155-5p、miR-532-5p是吸入糖皮質(zhì)激素反應(yīng)的潛在藥物基因組學(xué)預(yù)測因子[20]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)吸入糖皮質(zhì)激素5d 后，恢復(fù)期毛細(xì)支氣管炎激素組患兒血miR-302e 的表達(dá)水平均顯著高于非激素組，而NF-κB（p65）RNA的表達(dá)水平顯著低于非激素組，表明吸入糖皮質(zhì)激素能上調(diào)毛細(xì)支氣管炎患兒血miR-302e 的表達(dá)水平而下調(diào)NF-κB（p65）RNA 的表達(dá)水平。

綜上所述，吸入糖皮質(zhì)激素能上調(diào)毛細(xì)支氣管炎血miR-302e 的表達(dá)，抑制NF-κB RNA 的表達(dá)從而發(fā)揮抗炎作用，在毛細(xì)支氣管炎的治療中具有重要作用。