王淑華 馬艷軍，3 姚 娜 范可可 胡曉萌 江澤慧，* 胡 陶，3，*

（1國(guó)際竹藤中心/國(guó)家林業(yè)和草原管理局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/北京竹藤科技研究中心，北京 100102；2中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所/國(guó)家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；3廣西憑祥竹林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站，廣西 憑祥 532600）

鐵皮石斛（Dendrobium candidum）為蘭科多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴藥材，同時(shí)具有重要的生態(tài)價(jià)值和觀賞價(jià)值［1-2］。當(dāng)前，野生鐵皮石斛資源瀕臨滅絕［3］，在保護(hù)鐵皮石斛野生資源的前提下培育新品種將有助于石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［4］。60Co-γ 輻射誘變因其成本低、穿透力強(qiáng)、突變率高等優(yōu)勢(shì)，與常規(guī)育種技術(shù)結(jié)合，在百合、牡丹、菊花等觀賞植物中已得到廣泛應(yīng)用［5-7］。

種子是輻射誘變中常用的材料［8-10］，但目前蘭科植物誘變育種中多利用幼苗［11］、根狀莖［12］和原球莖［13］作為輻射材料，輻射處理種子的相關(guān)研究較少。原因之一在于蘭科植物種子細(xì)小，較難萌發(fā)，輻射對(duì)其損傷嚴(yán)重，顯著降低其萌發(fā)率。有報(bào)道表明化學(xué)處理（水楊酸、褪黑素、赤霉素等）、光譜處理及激光或微波處理等可在一定程度上緩解植物輻射損傷，并提高其誘變率［14-16］。此外，60Co-γ 輻射會(huì)顯著降低植物內(nèi)生真菌種群的多樣性，破壞內(nèi)生真菌群落的穩(wěn)定性［17］，而對(duì)于真菌共生型植物，菌根真菌可增強(qiáng)植物的抗輻射能力［18］。其中鐵皮石斛是典型的菌根真菌共生植物，自然條件下菌根真菌對(duì)鐵皮石斛種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)具有重要作用［19］。

鑒于此，本研究選取顯著促進(jìn)鐵皮石斛種子萌發(fā)的膠膜菌屬菌株JL2、JL4，使其與60Co-γ輻射后的鐵皮石斛種子建立共生關(guān)系，比較與菌株JL2、JL4 共生萌發(fā)和在1/2MS培養(yǎng)基上非共生萌發(fā)這兩類不同處理?xiàng)l件下，種子萌發(fā)率、成苗率的差異，分析菌根真菌對(duì)輻射后種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，探索菌根真菌共生對(duì)促進(jìn)鐵皮石斛輻射突變材料的恢復(fù)培養(yǎng)和擴(kuò)繁培養(yǎng)的潛在作用，以期為提高蘭科植物種子輻射誘變育種效率提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鐵皮石斛（Dendrobium candidum）、建蘭（Cymbidiumensifolium）栽培于國(guó)際竹藤中心溫室，植株生長(zhǎng)健康。于2021 年4—5 月對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行授粉，同年11 月前收集成熟未開(kāi)裂蒴果（圖1-A），于4 ℃條件下保存。

圖1 鐵皮石斛蒴果與菌根真菌菌落形態(tài)Fig.1 Capsules of D.candidum and morphology of mycorrhizal fungi

供試菌株JL2 與JL4 為分離自建蘭根部的兩株菌根真菌（圖1-B、C），將其與鐵皮石斛種子共生萌發(fā)，為確定菌株在鐵皮石斛原球莖中的定殖情況，對(duì)其進(jìn)行真菌特異性染色［20］。

1.2 儀器與設(shè)備

YT-CJ-2N 型超凈工作臺(tái)，北京亞泰科隆實(shí)驗(yàn)科技開(kāi)發(fā)中心；Axiocam Erc 5s Rev.2.0 體視顯微鏡，德國(guó)Cart Zeiss顯微鏡有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 輻射處理 將蘭花蒴果表面用75%乙醇擦拭消毒，在超凈工作臺(tái)內(nèi)剖開(kāi)分裝至1.5 mL 無(wú)菌離心管中，在安徽合肥（國(guó)家）林業(yè)輻照中心進(jìn)行60Co-γ 輻射處理，輻射劑量為0（CK）、20、40、60、90、120 Gy，劑量率為32.2 Gy·h-1，不同劑量梯度通過(guò)輻射時(shí)間控制。

1.3.2 輻射后種子萌發(fā) 在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用無(wú)菌水將各劑量輻射后的種子制成懸浮液，播種于4 種不同條件的培養(yǎng)基。依據(jù)是否接種真菌，培養(yǎng)條件可分為非共生萌發(fā)［1/2MS培養(yǎng)基（murashige and skoog medium with half strength MS macronutrients）、燕麥培養(yǎng)基（oat meal agar medium，OMA）］和共生萌發(fā)（OMA 培養(yǎng)基+菌株JL2、OMA培養(yǎng)基+菌株JL4）。

培養(yǎng)基主要成分如下：1/2MS 培養(yǎng)基［1/2MS +6-苯甲基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）0.5 mg+ α-萘乙酸（α-Naphthaleneacetic acid，NAA）0.1 mg+ 蔗糖30.0 g + 瓊脂6.0 g +活性炭 0.03 g +去離子水1 000 mL，pH值6.3～6.5］和OMA培養(yǎng)基［1.0 g燕麥粉（Solarbio?，北京）+ 6.0 g 瓊脂 + 1 000 mL 去離子水，自然pH 值］。在輻射種子共生萌發(fā)中，將各劑量輻射處理種子播于OMA 培養(yǎng)基上，并接種培養(yǎng)7 d 的真菌菌株。每個(gè)培養(yǎng)皿中播種800～1 000 顆種子，各處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)條件：溫度（23±2）℃，光照強(qiáng)度1 600～2 000 lx，光周期14 h光/10 h暗。

1.3.3 菌根真菌的培養(yǎng)與鑒定 菌株JL2（NCBI登錄號(hào)：OP132532）和JL4（NCBI 登錄號(hào)：OP132533）培養(yǎng)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基（Difco，美國(guó)）上，（25±2）℃暗培養(yǎng)。

為了確定菌株JL2 和JL4 在膠膜菌屬真菌中的分類地位，從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載已報(bào)道的膠膜菌屬菌株的ITS 序列，采用MEGA-X 軟件中的最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，選用K2 +G模型，設(shè)1 000次重復(fù)。

1.3.4 鐵皮石斛種子萌發(fā)率、成苗率統(tǒng)計(jì) 參照Stewart等［21］的方法，并進(jìn)行適當(dāng)修改，用0～5個(gè)階段對(duì)種子萌發(fā)和原球莖生長(zhǎng)情況進(jìn)行分級(jí)描述，將發(fā)育至第2階段的種子視為萌發(fā)（圖2），在體視顯微鏡下統(tǒng)計(jì)種子的萌發(fā)率和成苗率，計(jì)算相對(duì)萌發(fā)率。

式中，S0～S5分別代表鐵皮石斛種子萌發(fā)的第0階段至第5階段。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 22.0 軟件，對(duì)不同萌發(fā)條件下輻射劑量0（CK）、20、40、60、90、120 Gy 及其對(duì)應(yīng)的種子相對(duì)萌發(fā)率進(jìn)行線性回歸分析。建立擬合線性回歸方程Y= bX+ a，求算參數(shù)a、b 的值和決定系數(shù)（R2），以檢驗(yàn)方程擬合優(yōu)度；其中，Y為種子相對(duì)萌發(fā)率，X為輻射劑量；Y=50%時(shí)的X值為半致死劑量（LD50）［22］。運(yùn)用SPSS 22.0 軟件，將種子萌發(fā)率和成苗率的百分?jǐn)?shù)結(jié)果進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換：y= sin-1x；將轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和事后多重比較。當(dāng)方差齊性時(shí)，事后多重比較采用LSD 法；方差不齊時(shí)，采用Games-Howell法。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌根真菌分子鑒定與定殖觀察

由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）可知，JL2、JL4 為膠膜菌屬（Tulasnellasp.）菌株。對(duì)與真菌共生萌發(fā)的原球莖進(jìn)行染色，結(jié)果表明，真菌菌絲可定殖在原球莖基部細(xì)胞內(nèi)，形成蘭科菌根典型的胞內(nèi)菌絲團(tuán)結(jié)構(gòu)（圖4）。

圖3 菌根真菌菌株JL2、JL4的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of mycorrhizal fungi JL2 and JL4

圖4 真菌在鐵皮石斛原球莖和細(xì)胞內(nèi)的定殖Fig.4 Fungal colonization in D.candidum protocorm and cell

2.2 60Co-γ輻射對(duì)鐵皮石斛種子萌發(fā)的影響

培養(yǎng)50 d 時(shí)統(tǒng)計(jì)鐵皮石斛種子的萌發(fā)率，計(jì)算相對(duì)萌發(fā)率。由表1 可知，不同劑量輻射后的鐵皮石斛種子在非共生萌發(fā)（1/2MS）和共生萌發(fā)（菌株JL2、JL4）培養(yǎng)條件下，萌發(fā)率均隨輻射劑量的升高而降低，其中，20 Gy處理的種子萌發(fā)率顯著高于其他輻射劑量處理種子萌發(fā)率，40 和60 Gy 處理下的種子萌發(fā)率差異不顯著（表1）；在OMA 培養(yǎng)基上非共生萌發(fā)的種子均未萌發(fā)；輻射劑量為40、60 和120 Gy 時(shí)，與菌株JL2共生萌發(fā)的種子相對(duì)萌發(fā)率最高；輻射劑量為20 和90 Gy 時(shí)，非共生萌發(fā)（1/2MS）的種子相對(duì)萌發(fā)率最高。

表1 不同60Co-γ輻射劑量對(duì)鐵皮石斛種子萌發(fā)率的影響Table 1 Effects of different radiation doses on germination rates of D.candidum seeds /%

以表1中6個(gè)輻射劑量梯度和相對(duì)萌發(fā)率為基礎(chǔ)，得到1/2MS 萌發(fā)條件下的線性回歸方程為y=-0.809x+ 100.266（R2=0.962），LD50為62 Gy；與菌株JL2 共生萌發(fā)條件下的線性回歸方程為y= -0.739x+100.973 （R2=0.946），LD50為69 Gy；與菌株JL4 共生萌發(fā)條件下的線性回歸方程為y= -0.786x+ 99.253（R2=0.978），LD50為63 Gy（圖5）。結(jié)果表明，與菌株JL2、JL4 共生萌發(fā)的鐵皮石斛種子半致死劑量均高于1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)的種子，其中與菌株JL2共生萌發(fā)的種子半致死劑量較1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)種子提高了7 Gy。

圖5 輻射劑量與相對(duì)萌發(fā)率的相關(guān)性分析Fig.5 The correlation analysis of irradiation dose with relative germination rate

2.3 60Co-γ輻射對(duì)鐵皮石斛成苗率的影響

分別在培養(yǎng)50 和115 d 時(shí)統(tǒng)計(jì)鐵皮石斛的成苗率，以確定不同培養(yǎng)條件下輻射對(duì)早期幼苗形成的影響（表2）。培養(yǎng)50 d 時(shí)，在1/2MS 培養(yǎng)基上僅20 Gy 處理有幼苗形成，成苗率為3.02%（圖6、表2）；與菌株JL2、JL4 共生萌發(fā)條件下，20 Gy 處理種子的成苗率顯著高于對(duì)照（0 Gy）和其他輻射劑量，分別為11.92%和36.94%，在非共生培養(yǎng)OMA 培養(yǎng)基上所有處理均無(wú)幼苗形成（圖6、表2）。

培養(yǎng)115 d 時(shí)，在1/2MS、JL2 和JL4 三種培養(yǎng)條件下，0 Gy 和20 Gy 處理成苗率差異不顯著，但顯著高于其他輻射劑量（表2）；在與半致死劑量最接近的60 Gy處理下，石斛種子與菌株JL2、JL4 共生萌發(fā)的成苗率顯著高于1/2MS 培養(yǎng)基上的種子成苗率（P＜0.05），其中與菌株JL4 共生萌發(fā)成苗率可高達(dá)3.74%；當(dāng)輻射劑量提高至90 Gy 時(shí)，共生萌發(fā)種子的成苗率依然顯著高于1/2MS 培養(yǎng)基上萌發(fā)的種子（P＜0.05）；在非共生培養(yǎng)OMA培養(yǎng)基上均無(wú)幼苗形成，其中0、40、60、90和120 Gy處理種子均處于萌發(fā)的第2階段，而20 Gy處理種子與上述種子相比較為膨大，且部分種子到達(dá)原球莖階段（圖6）。由此可見(jiàn)，輻射劑量20 Gy 可促進(jìn)鐵皮石斛快速形成幼苗；與菌株JL2、JL4 共生萌發(fā)可顯著提升種子在高輻射劑量（＞60 Gy）下的成苗率。

圖6 輻射劑量和萌發(fā)方法對(duì)鐵皮石斛種子萌發(fā)的影響Fig.6 Effect of various irradiation doses and germination method on the germination of D.candidum seeds

表2 不同60Co-γ輻射劑量對(duì)鐵皮石斛成苗率的影響Table 2 Effects of different radiation doses on seedling formation rates of D.candidum seeds /%

2.4 60Co-γ輻射對(duì)幼苗形態(tài)的影響

培養(yǎng)96 d 時(shí)，在顯微鏡下觀察不同培養(yǎng)條件下各劑量輻射種子的幼苗生長(zhǎng)情況。由圖7 可知，與菌株JL4 共生萌發(fā)形成的鐵皮石斛幼苗長(zhǎng)勢(shì)最好，其中90和120 Gy 處理下幼苗個(gè)體較大，表現(xiàn)出葉面積大、假鱗莖粗壯、根系發(fā)達(dá)（圖7）；與菌株JL2 共生萌發(fā)條件下，同樣表現(xiàn)出90 Gy 處理種子形成的的幼苗個(gè)體較大，但120 Gy 處理種子未形成幼苗，僅有原球莖形成；然而，與菌株JL2、JL4 共生萌發(fā)條件下，60 Gy 處理種子形成的石斛幼苗個(gè)體較其他劑量?。▓D7）。與共生萌發(fā)培養(yǎng)條件相比，40～120 Gy 輻射處理種子在1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)形成的幼苗生長(zhǎng)較緩慢，葉片尚未展開(kāi)（圖7）。由此可見(jiàn)，經(jīng)輻射處理的種子與菌株JL2、JL4共生萌發(fā)可促進(jìn)其幼苗生長(zhǎng)，獲得更加健壯的幼苗。

圖7 各劑量輻射處理的鐵皮石斛種子在不同培養(yǎng)條件下形成的幼苗形態(tài)Fig.7 Seedlings morphology of D.candidum seeds treated with various radiation doses under different culture conditions

3 討論

3.1 鐵皮石斛種子半致死劑量

60Co-γ 輻射具有誘變突變頻率高、加快新品種選育進(jìn)程的潛力。適宜的輻射劑量有利于獲得更多的有效突變，在一定范圍內(nèi)提高輻射劑量可增加誘變材料的突變率，但輻射劑量過(guò)高則會(huì)大大降低其成活率［23］。半致死劑量是保證植物材料存活并獲得最大變異率的最佳劑量，其作為衡量適宜輻射劑量的重要標(biāo)準(zhǔn)在植物輻射育種中廣泛應(yīng)用［24］。石斛輻射誘變主要以原球莖［25］或組培苗［11］為材料，半致死劑量主要集中于30～70 Gy。本研究通過(guò)3 種不同培養(yǎng)條件對(duì)60Co-γ 輻射處理鐵皮石斛種子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)種子半致死劑量為62～69 Gy，與已報(bào)道的輻射鐵皮石斛原球莖的半致死劑量67.23 Gy 接近［26］，原因可能與誘變所用的種子材料處于成熟未休眠狀態(tài)有關(guān)，為輻射鐵皮石斛種子的劑量范圍選用提供了參考。

3.2 60Co-γ輻射對(duì)鐵皮石斛成苗率的影響

不同劑量的電離輻射會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生不同的影響，如低劑量電離輻射對(duì)生長(zhǎng)激素、細(xì)胞分裂素的合成和植物生長(zhǎng)有刺激作用，而高劑量輻射對(duì)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)有抑制作用［27-28］。本研究發(fā)現(xiàn)，20 Gy處理對(duì)不同培養(yǎng)條件下石斛種子萌發(fā)、成苗均具有促進(jìn)作用，這與Dehgahi 等［25］發(fā)現(xiàn)低劑量γ 射線可微弱促進(jìn)D.Sonia28 原球莖生長(zhǎng)的結(jié)果相一致。然而隨輻射劑量的增加，各培養(yǎng)條件下輻射處理種子的成苗率逐漸降低，表明更高劑量的60Co-γ輻射會(huì)抑制幼苗形成，推測(cè)其原因在于高劑量輻射使種子受到較大傷害，種子活性下降，且萌發(fā)后自身恢復(fù)生長(zhǎng)的能力大大減弱［29］。

3.3 菌根真菌對(duì)鐵皮石斛輻射種子萌發(fā)和成苗的影響

在誘變育種中，通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)條件提高突變細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)力，可獲得穩(wěn)定突變株［30］。盧敏［31］發(fā)現(xiàn)有益真菌的侵染可增強(qiáng)石斛組培苗的耐熱性，提高其半致死溫度。本研究探討了膠膜菌屬菌根真菌在鐵皮石斛輻射種子萌發(fā)中的作用，發(fā)現(xiàn)與菌株JL2 共生萌發(fā)的輻射種子半致死劑量（69 Gy）較1/2MS 培養(yǎng)基對(duì)照組提高了7 Gy；另一方面，經(jīng)高劑量（＞60 Gy）處理的種子與菌株JL2、JL4 共生萌發(fā)后可獲得更多的誘變幼苗，表明菌株JL2 和JL4 對(duì)輻射處理后種子的生長(zhǎng)具有一定的恢復(fù)作用。這與其他研究者關(guān)于內(nèi)生真菌和叢枝菌根真菌通過(guò)侵染植物形成共生體以增強(qiáng)宿主在逆境條件下生存能力的報(bào)道相一致［32］。同時(shí)也表明，今后可通過(guò)與適宜真菌菌株共生培養(yǎng)，來(lái)提高鐵皮石斛誘變材料在后期生長(zhǎng)中的恢復(fù)能力和成活率。

4 結(jié)論

共生與非共生培養(yǎng)下，鐵皮石斛種子萌發(fā)率隨輻射劑量的增加呈下降趨勢(shì)，較高劑量對(duì)幼苗形成有抑制作用，20 Gy 處理可促進(jìn)鐵皮石斛種子快速成苗，為縮短育種周期、快速擴(kuò)繁提供技術(shù)參考。菌株JL2 和JL4 可在一定程度上提高鐵皮石斛種子的輻射耐受能力，恢復(fù)輻射處理種子的生長(zhǎng)分化能力。高劑量（90、120 Gy）輻射的種子與JL4 共生萌發(fā)可獲得表型變化更明顯的幼苗。蘭科植物種子細(xì)小且數(shù)量多，因此為獲得表型變化明顯的突變株，可適當(dāng)提高輻射劑量，并對(duì)輻射種子進(jìn)行菌根真菌共生萌發(fā)培養(yǎng)。