羅 陽，田唯嘉，，何 芳，浣 成，劉伯承，張佰忠，宋 武，楊 青，易康樂

（1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南 長沙 410131；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410125）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）屬于條件性致病菌，在家畜、野生動(dòng)物、水產(chǎn)動(dòng)物以及人類的消化道、呼吸道等系統(tǒng)中均能生存，具有分布廣、發(fā)病率高、耐藥性強(qiáng)等特點(diǎn)[1-3]。病原菌控制一直是牛奶生產(chǎn)中的工作重點(diǎn)，而保持奶牛乳房健康是牛奶品質(zhì)安全的關(guān)鍵。肺炎克雷伯菌作為常見的奶牛乳房炎致病性革蘭氏陰性菌之一[4]，在臨床上常被誤診為大腸桿菌，并采用抗生素進(jìn)行治療，由于不同致病菌耐藥性有差異，近年來，肺炎克雷伯菌高毒力菌株以及多重抗藥現(xiàn)象不斷出現(xiàn)，對(duì)奶牛場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5-8]。因此，肺炎克雷伯菌導(dǎo)致的奶牛乳房炎及其防治受到越來越多畜牧工作者的關(guān)注。

核酸檢測(cè)相對(duì)傳統(tǒng)純培養(yǎng)法具有速度快、操作簡單、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，在病原菌臨床鑒定研究中有著廣泛的應(yīng)用。不同種屬微生物有著固有看家基因和保守序列，經(jīng)常作為微生物鑒定的關(guān)鍵靶點(diǎn)。ITS（Internal transcribed spacer）序列是16S-23S rDNA 內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔層一段基因片段，具有較16S rDNA 和23S rDNA 更高的遺傳變異性和物種特異性。前人利用ITS 序列已經(jīng)成功設(shè)計(jì)了阪崎腸桿菌、沙門氏菌和單核李斯特菌等病原體鑒定的引物和探針，解決了食品安全中微生物鑒定的技術(shù)瓶頸[9-11]。UreD基因是肺炎克雷伯菌編碼脲酶的第一啟動(dòng)子，對(duì)脲酶功能蛋白的表達(dá)和氮代謝過程發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，而且同種克雷伯菌UreD基因具有高度保守性，與其他物種之間的差異性較大，可認(rèn)定為肺炎克雷伯菌的特有基因[12-15]。目前，科研工作者針對(duì)人源或食品環(huán)境中的肺炎克雷伯菌開展了大量調(diào)查和深入研究[16-18]，但針對(duì)奶牛乳房炎來源的肺炎克雷伯菌的分析以及發(fā)病機(jī)制研究較少。因此，以ITS 序列和UreD基因作為靶基因來鑒定肺炎克雷伯菌引起的奶牛乳房炎，對(duì)病原菌快速鑒定體系的構(gòu)建和乳房炎精準(zhǔn)治療具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、松鼠葡萄球菌分離自湖南省某規(guī)?；膛?chǎng)乳房炎患病牛，并保存于-80 ℃冰箱。

2×FastTaq Premix 購自上海吐露港生物科技有限公司；基因擴(kuò)增反應(yīng)液（常溫?cái)U(kuò)增法）購自廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司；BHI 肉湯培養(yǎng)基購自杭州百思生物技術(shù)有限公司；核酸染料、DNA Marker 購自杭州博日科技有限公司；其余試劑均為分析純。

儀器設(shè)備：電子分析天平（AL204，梅特勒-托利多）；凝膠成像儀（ZF-288，上海嘉鵬）；LAMP動(dòng)物疫病檢測(cè)儀（Dhelix-Q5，廣州雙螺旋）；PCR 儀（A200，杭州朗基）；核酸電泳儀（DYY-6D，北京六一）；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD，蘇州安泰）；高壓滅菌鍋（LDZF-50L-Ⅰ，上海博迅）。

1.2 基因組提取

采用三區(qū)劃線法將肺炎克雷伯菌接種于BHI肉湯固體培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種于5 mL BHI 肉湯液體培養(yǎng)基中，37 ℃、226 r/min 恒溫?fù)u床培養(yǎng)12～16 h，將獲取的菌液12 000 r/min離心1 min，棄上清，用無菌水反復(fù)洗滌2 次，采用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取基因組，-20 ℃保存。

1.3 ITS序列PCR擴(kuò)增與引物特異性檢測(cè)

利用肺炎克雷伯菌16S-23S rDNA ITS 序列，按照YIN 等[19]的方法合成特異性引物，ITS-F：5′-ATTTGAAGAGGTTGCAAACGAT-3′ ，ITS-R：5′-CCGAAGATGTTTCACTTCTGATT-3′，引物由杭州擎科生物科技有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系為25 μL：2×Mix 12.5 μL，上游和下游引物各1 μL，細(xì)菌DNA 模板2 μL，滅菌超純水8.5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃，預(yù)變性5 min；隨后擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)（95 ℃，變性45 s；55 ℃，退火40 s；72 ℃，延伸45 s）；最后72 ℃，延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，PCR 產(chǎn)物送至杭州擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫比對(duì)確認(rèn)。將實(shí)驗(yàn)室保存的乳房炎型金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、松鼠葡萄球菌的基因組DNA，按照上述反應(yīng)體系和方法進(jìn)行引物特異性驗(yàn)證。

1.4 ITS序列PCR敏感性檢測(cè)

將提取的肺炎克雷伯菌基因組DNA 進(jìn)行質(zhì)量濃度測(cè)定，按照10 倍梯度稀釋成500、50、5、5×10-1、5×10-2、5×10-3、5×10-4、5×10-5、5×10-6、5×10-7ng/μL，按照1.3中的方法和反應(yīng)程序進(jìn)行敏感性檢測(cè)。

1.5 UreD基因LAMP引物設(shè)計(jì)

參照COLLINS 等[15]的方法，在NCBI 上獲取肺炎克雷伯菌脲酶UreD基因序列（GenBank 登錄號(hào)：L07039.1），應(yīng)用在線軟件Primer Explorer V5（http：//primerexplorer.jp/e/）進(jìn)行LAMP 特異性引物設(shè)計(jì)，共3組，分別包含內(nèi)引物（UreD-FIP：5′-TCATCACCGCCGACGATGCCGTTTTACCCGGAAGAAG-3′，UreDBIP：5′-TGACAATTAGCGCGCACCTTGCGGTAAAACTTGCTGG-3′）、環(huán)引物（UreD-LF：5′-GAAGCAGATAGAGGTGACAGG-3′，UreD-LB：5′-CTGCCATACGCTGATAACCA-3′）、外引物（UreD-F3：5′-GATCTCCGCTTTCAGCAG-3′，UreD-B3：5′-CAACTGCTGGCGAACTAG-3′），引物由杭州擎科生物科技有限公司合成。

1.6 UreD基因LAMP法的建立

將FIP/BIP 內(nèi)引物、LF/LB 環(huán)引物、F3/B3外引物按照8∶4∶1 配制成工作液，構(gòu)建25 μL 反應(yīng)體系：12.5 μL 反應(yīng)液、0.5 μL 熒光染料、1 μL Bst 聚合酶、2 μL 細(xì) 菌DNA 模 板、1 μL 引 物 工 作 液 和8 μL ddH2O，反應(yīng)前加入20 μL 礦物油進(jìn)行封閉。利用LAMP 儀以1 ℃為反應(yīng)梯度，設(shè)定60～65 ℃6 個(gè)反應(yīng)條件進(jìn)行對(duì)比，確定最佳反應(yīng)溫度，反應(yīng)結(jié)束后查看擴(kuò)增曲線，陽性為S形曲線，陰性則為直線。將實(shí)驗(yàn)室保存的奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、松鼠葡萄球菌的基因組DNA，在最佳反應(yīng)溫度下進(jìn)行引物特異性驗(yàn)證。

1.7 LAMP法敏感性檢測(cè)

將1.4 中不同質(zhì)量濃度的肺炎克雷伯菌基因組DNA，在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行敏感性檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 肺炎克雷伯菌ITS序列PCR擴(kuò)增與引物特異性檢測(cè)

肺炎克雷伯菌基因組DNA 經(jīng)特異性引物PCR擴(kuò)增后，獲得260 bp左右的基因片段（圖1），與肺炎克雷伯菌16S-23S rDNA ITS 序列相似性為100%。以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、松鼠葡萄球菌基因組DNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，未能獲得目的基因片段（圖2），說明本研究所用的引物特異性較好，能準(zhǔn)確鑒定肺炎克雷伯菌。

2.2 肺炎克雷伯菌ITS序列PCR敏感性檢測(cè)

當(dāng)肺炎克雷伯菌DNA 質(zhì)量濃度高于5×10-2ng/μL時(shí)，擴(kuò)增出的條帶明亮清晰；當(dāng)DNA質(zhì)量濃度為5×10-3ng/μL 時(shí)，條帶開始模糊發(fā)暗，穩(wěn)定性不好；質(zhì)量濃度低于5×10-4ng/μL 時(shí)，泳道中目的基因條帶難以區(qū)分（圖3）。說明利用PCR 技術(shù)檢測(cè)肺炎克雷伯菌ITS 基因所需的最低DNA 質(zhì)量濃度為5×10-2ng/μL。

圖3 肺炎克雷伯菌ITS序列PCR敏感性檢測(cè)結(jié)果Fig.3 PCR sensitivity detection results of Klebsiella pneumoniae ITS sequences

2.3 肺炎克雷伯菌UreD基因LAMP引物特異性檢測(cè)

通過設(shè)定不同反應(yīng)溫度對(duì)LAMP反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示（表1），60～65 ℃內(nèi)均能擴(kuò)增肺炎克雷伯菌UreD基因，但擴(kuò)增時(shí)間和CT 值有所差異，反應(yīng)溫度為62 ℃時(shí)，LAMP擴(kuò)增所需時(shí)間最短（20 min），在63 ℃時(shí)，LAMP 反應(yīng)獲得CT 值最高，按照達(dá)到CT值所需時(shí)間最短，確定最佳反應(yīng)溫度。因此，確定LAMP法擴(kuò)增UreD基因的最佳溫度為62 ℃。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的LAMP引物在最適反應(yīng)溫度下無法擴(kuò)增出乳房炎來源的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和松鼠葡萄球菌，而肺炎克雷伯菌能穩(wěn)定擴(kuò)增，呈現(xiàn)S 形曲線（圖4），說明LAMP 引物特異性良好，可用于后期試驗(yàn)。

圖4 肺炎克雷伯菌UreD基因LAMP法擴(kuò)增結(jié)果Fig4 Amplification results of Klebsiella pneumoniae UreD gene by LAMP

表1 肺炎克雷伯菌UreD基因不同反應(yīng)溫度下LAMP擴(kuò)增效率對(duì)比Tab.1 Comparison of LAMP amplification efficiency of Klebsiella pneumoniae UreD gene at different reaction temperatures

2.4 肺炎克雷伯菌UreD基因LAMP法敏感性檢測(cè)

在62 ℃反應(yīng)條件下，對(duì)肺炎克雷伯菌500～5×10-7ng/μL 的DNA進(jìn)行擴(kuò)增（圖5）。結(jié)果顯示，利用LAMP 技術(shù)均能擴(kuò)增肺炎克雷伯菌UreD基因，說明以UreD基因?yàn)榘谢?，LAMP 擴(kuò)增的靈敏度非常高。

圖5 肺炎克雷伯菌UreD基因LAMP敏感性檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Sensitivity test results of Klebsiella pneumoniae UreD gene by LAMP

3 結(jié)論與討論

核酸檢測(cè)是當(dāng)前疫情大流行的環(huán)境下重要防控手段之一，快速、準(zhǔn)確檢測(cè)乳房炎病原菌對(duì)臨床診斷、治療以及預(yù)防交叉感染等環(huán)節(jié)具有重要意義。靶基因選擇是成功建立PCR 鑒定體系的關(guān)鍵因素，大量研究將耐藥基因作為肺炎克雷伯菌快速鑒定的靶點(diǎn)。張畢明等[20]利用耐藥基因KPC/CMY-2成功建立了肺炎克雷伯菌熒光定量PCR 檢測(cè)體系，并將時(shí)間控制在90 min 內(nèi)。汪華學(xué)等[21]基于PCR技術(shù)建立了基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）鑒定方法，對(duì)攜帶blaKPC-2基因型的肺炎克雷伯菌能實(shí)現(xiàn)快速鑒定，準(zhǔn)確率高達(dá)92.90%。此外，還有針對(duì)高黏性表型（uge、ureA、allS、cf29a等）、莢膜血清型（K1、K2、K5、K20 等）肺炎克雷伯菌致病決定基因以及其他功能性蛋白質(zhì)編碼基因（iucA、entB、fimH等）建立的PCR 鑒定體系[22-24]。本研究中，利用肺炎克雷伯菌16S-23S rDNA ITS序列，可在核酸質(zhì)量濃度為5×10-2ng/μL的環(huán)境下實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定擴(kuò)增。YIN 等[19]利用ITS 序列也成功建立了嬰幼兒奶粉中肺炎克雷伯菌的快速鑒定方法，利用此方法從奶粉中檢測(cè)出肺炎克雷伯菌濃度可低至0.015 cfu/g，具備較高的特異性和靈敏度。

LAMP 技術(shù)是一種新型核酸快速擴(kuò)增方法，由于等溫反應(yīng)特性，在簡易環(huán)境下利用恒溫水浴鍋也能完成檢測(cè)，在采樣現(xiàn)場(chǎng)和移動(dòng)性實(shí)驗(yàn)室中被廣泛應(yīng)用。LAMP 技術(shù)鑒定肺炎克雷伯菌同樣需要選擇合適的靶基因，纖維二糖PTS家族CelB基因[25]、碳青霉烯酶KPC 編碼基因[26]、莢膜多糖合成調(diào)控基因rcsA[27]、脲酶基因ureR_1[28]等相繼被選為肺炎克雷伯菌快速鑒定的靶基因。前人研究表明，LAMP 技術(shù)鑒定肺炎克雷伯菌的靈敏度普遍為PCR 技術(shù)的10～1 000倍[27，29-30]。在本研究中，以肺炎克雷伯菌脲酶UreD基因?yàn)榘悬c(diǎn)實(shí)現(xiàn)了LAMP 技術(shù)的穩(wěn)定擴(kuò)增和快速鑒定，且在核酸質(zhì)量濃度為5×10-7ng/μL 的條件下，依然能夠成功鑒定出肺炎克雷伯菌UreD基因，檢測(cè)靈敏度是普通PCR 方法的105倍，在奶牛乳房炎致病菌臨床鑒定上具有一定的應(yīng)用前景。

綜上，本研究成功構(gòu)建了PCR 和LAMP 技術(shù)快速鑒定奶牛乳房炎來源肺炎克雷伯菌的方法，2 種方法操作簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)，適合在實(shí)驗(yàn)室和養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)推廣應(yīng)用。