趙文影，張?jiān)旗o，白小飛，孫玉潔，郭玲花，黃柏成，田克恭

（1.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471000；2.普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471000）

豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）是造成母豬繁殖障礙的主要病原體之一，臨床癥狀主要表現(xiàn)為母豬不育、流產(chǎn)、木乃伊胎以及延遲發(fā)情[1-2]。PPV屬于細(xì)小病毒屬成員，為無囊膜的負(fù)鏈單股線狀DNA 病毒。PPV 共有7 個基因型，其中PPV2—7 型還未見分離成功的報(bào)道，對于新型細(xì)小病毒的致病力及免疫保護(hù)機(jī)制尚不清楚[3-4]。PPV1 型基因組全長約5 kb，包含2 個開放閱讀框（Open reading frame，ORF），其中ORF1 編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2和NS3，ORF2 編 碼 結(jié) 構(gòu) 蛋 白VP1、VP2 和VP3。PPV1 根據(jù)毒株組織嗜性和致病性差異分為四大類：第一類是以NADL-2為代表的弱毒株，第二類是以NADL-8 株為代表的強(qiáng)毒株，第三類是以Kresse株為代表的皮炎型強(qiáng)毒株，第四類是以IAF-83株為代表的腸炎型弱毒株[5-7]。前人研究表明，不同毒株的致病性差異或毒力強(qiáng)弱由VP1/VP2基因氨基酸位點(diǎn)替換所決定[8]。目前，GenBank 收錄的PPV 弱毒株代表株基因序列包含有NADL-2 株、N 株和China株等，強(qiáng)毒株代表株基因序列包含Kresse 株、27a株、BQ株等。

1964 年，MAYR 等[9]在豬原代細(xì)胞培養(yǎng)物中首次分離到PPV，我國潘雪珠等[10]在1983 年首次分離到該病毒，隨后國內(nèi)各地陸續(xù)有PPV 病例報(bào)道[11-12]。目前，防控該病的主要手段是接種疫苗，但是由于PPV 的NS1 和VP2 氨基酸位點(diǎn)突變，造成現(xiàn)有疫苗不能對異源毒株提供良好的保護(hù)效果[13-14]。有研究表明，與其他細(xì)小病毒屬的成員相比，PPV1 基因組的保守性更高[15-17]。前人對PPV 全基因組序列進(jìn)行進(jìn)化動力學(xué)分析表明，非結(jié)構(gòu)蛋白每年每個位點(diǎn)氨基酸替代率約為10-5次，衣殼蛋白基因每年每個位點(diǎn)的核苷酸取代率約為10-4次，衣殼蛋白氨基酸高替換率與RNA病毒相似，提示PPV基因組具有遺傳多樣性[18-19]。

為深入了解PPV 的變異情況，對2020—2021年從江蘇、河南和北京3 個省市收集的組織病料進(jìn)行PCR 鑒定和檢出率分析，并從PPV 陽性病料中進(jìn)行病毒分離鑒定，通過PCR 擴(kuò)增分離株全基因組核酸序列，對分離毒株的全基因組、VP2基因及推導(dǎo)氨基酸進(jìn)行序列分析，以期為PPV 疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 Viral Nucleic Acid Extraction KitⅡ購 自 臺 灣 旭 基 公 司；2×TransTaq?-T PCR SuperMix（+dye）、2×TransStart?FastPfu PCR SuperMix（-dye）、pEASY?-Blunt Cloning Kit 和Trans-T1 感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物公司；Premix ExTaq（2×）（Probe qPCR）、DNA Marker 和瓊脂糖等均購自Takara 公 司；α-MEM 培 養(yǎng) 基 和0.25% 胰 酶 購 自Gibco 公司；胎牛血清（FBS）購自Cegrogen 公司；溴化乙淀溶液（EB）和50×TAE電泳緩沖液購自生工生物（上海）股份有限公司。PPV 鼠源單克隆抗體2D1由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心提供，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的兔抗鼠IgG購自Sigma公司，PPV HeN1202株病毒液由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2 臨床樣品 在2020—2021年從江蘇、河南和北京3個省市共采集165份組織樣品。

1.1.3 細(xì)胞 ST 細(xì)胞來源于美國菌種保藏中心（ATCC），由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心保存。

1.2 方法

1.2.1 PPV 流行病學(xué)調(diào)查 采用PCR 檢測方法對2020—2021 年從江蘇、河南和北京3 個省市采集的臨床病料進(jìn)行豬細(xì)小病毒核酸檢測。上游引物PPV-F（5′-TGGTCTCCTTCTGTGGTAGG-3′）和 下游 引 物PPV-R（5′-CAGAATCAGCAACCTCAC-3′）由天津金唯智有限公司合成，預(yù)期片段大小為445 bp。按照Viral Nucleic Acid Extraction Kit Ⅱ試劑盒提取病毒核酸。PCR 反應(yīng)體系：2×TransTaq?-T PCR SuperMix（+dye）10 μL，上、下游引物各0.5 μL，RNase free dH2O 7 μL，模板2 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 病毒的分離培養(yǎng) 稱取陽性病料2 g，用剪刀剪碎后加入7 mL α-MEM 培養(yǎng)基，經(jīng)研磨處理后，10 000 r/min 離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm 濾器過濾除菌后，分裝備用。將處理后的組織研磨液用含2% FBS 的α-MEM 培養(yǎng)基2 倍稀釋，然后接種于長至單層的ST 細(xì)胞，37 ℃孵育1 h 后，補(bǔ)加5 mL 含2% FBS 的α-MEM 培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對照。培養(yǎng)72～96 h 收毒，或待細(xì)胞病變至80%時(shí)收毒。

1.2.3 電鏡負(fù)染 取10 μL 病毒液滴于碳膜上，靜置10 min；同時(shí)取10 μL 1%磷鎢酸滴于干凈的封口膜上；靜置結(jié)束后，用濾紙吸取多余的病毒液，將銅網(wǎng)置于磷鎢酸緩沖液上5～10 s，吸干多余磷鎢酸，之后在電鏡下觀察病毒粒子形態(tài)。

1.2.4 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）ST 細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后計(jì)數(shù)，按照2 萬個/孔鋪于96 孔板，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長至單層進(jìn)行病毒液的接種，同時(shí)設(shè)置陰性對照和陽性對照（陽性對照孔接種HeN1202 株病毒液）。接毒后培養(yǎng)72 h從培養(yǎng)箱取出，PBS 洗滌3 次，200 μL/孔；加入預(yù)冷的80%丙酮，50 μL/孔，2～8 ℃固定30 min；棄去丙酮，PBS 洗滌3 次，200 μL/孔，3 min/次；加入1∶400稀釋的PPV鼠源單克隆抗體2D1，50 μL/孔，置37 ℃作用30 min；棄去一抗，PBS 洗滌3 次，200 μL/孔，5 min/次；加入1∶500 稀釋的FITC 標(biāo)記的兔抗鼠IgG抗體，50 μL/孔，置37 ℃作用30 min；棄去二抗，洗滌3次，200 μL/孔，5 min/次，最后加入PBS，50 μL/孔，用熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）PPV qPCR 鑒定的上游引物（5′-TCACCAAACAATTAATAATAGC-3′）、下游引物（5′-GGTTCATCATCATTATATTGTG-3′）和探針引物（5′-FAM-ACACAGAAGCAACAGCAATTAGGC-BHQ1-3′）均由天津金唯智有限公司合成。按照Viral Nucleic Acid Extraction Kit Ⅱ試劑盒提取病毒核酸，作為模板。qPCR 反應(yīng)體系：Premix ExTaqTM（2×）（Probe qPCR）10 μL，上、下游引物各0.4 μL，探針引物0.8 μL，RNase free ddH2O 6.4 μL，模板2 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性90 s；95 ℃變性10 s，60 ℃30 s，共35 個循環(huán)，并在60 ℃處收集熒光。

1.2.6 PPV 基因組PCR 擴(kuò)增 根據(jù)PPV HN2011 株（GenBank登錄號：JX992846.1）序列設(shè)計(jì)5對引物用于PPV 基因組擴(kuò)增（表1），引物由天津金唯智有限公司合成。使用2×TransStart?FastPfu PCR SuperMix（-dye）進(jìn)行PPV全基因組序列PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2×TransStart?FastPfu PCR SuperMix（-dye）25 μL，上、下游引物各1.5 μL，RNase free ddH2O 20 μL，模板2 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將目的片段回收后，與pEASY?-Blunt載體25 ℃金屬浴20 min進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans-T1 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR 鑒定為陽性的質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

表1 引物序列信息Tab.1 Primers used in this study

1.2.7 PPV全基因組和VP2基因序列分析及遺傳進(jìn)化分析 首先使用SeqMan 軟件拼接測序結(jié)果，然后使用MegAlign 軟件將拼接結(jié)果與GenBank 收錄的PPV 毒株序列（表2）進(jìn)行全基因組和VP2基因核苷酸的一致性比對（Clustal W 法）。基于鄰近法，使用MEGA 6.0 軟件對VP2基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并基于VP2基因推導(dǎo)氨基酸序列，分析PPV分子特征。

表2 PPV參考毒株序列信息Tab.2 Information of PPV reference strains

2 結(jié)果與分析

2.1 PPV流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

對2020—2021年采集的病料進(jìn)行PCR檢測，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，河南PPV 核酸檢出率為37.5%，江蘇PPV 核酸檢出率為8.3%，北京PPV 核酸檢出率為3.5%（表3）；從年份來看，與2020 年相比，2021 年P(guān)PV 核酸檢出率明顯升高（表4）。

表3 2020—2021年不同省市PPV核酸檢測結(jié)果Tab.3 Result of PPV nucleic acid detection in different provinces from 2020 to 2021

表4 2020—2021年P(guān)PV核酸檢測結(jié)果Tab.4 Result of PPV nucleic acid detection from 2020 to 2021

2.2 臨床樣品PPV的分離

將PPV核酸陽性的病料上清接種于ST細(xì)胞，盲傳2 代后開始出現(xiàn)細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)顆粒增多、細(xì)胞變圓、聚堆、拉網(wǎng)脫落，而對照細(xì)胞形態(tài)未見異常（圖1）。將分離的PPV命名為BJ2。

圖1 PPV感染細(xì)胞病變結(jié)果（100×）Fig.1 Cytopathic results of PPV infeced cells（100×）

2.3 PPV BJ2分離株的鑒定

2.3.1 PPV 分離株IFA檢測 將BJ2株F4代病毒液接種于ST 細(xì)胞，48 h 后進(jìn)行IFA 檢測。結(jié)果顯示，陽性對照細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)可見特異性綠色熒光，接毒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)顯示與陽性對照細(xì)胞一致的綠色熒光，正常細(xì)胞未見特異性熒光（圖2）。

圖2 PPV BJ2株IFA鑒定結(jié)果（100×）Fig.2 IFA identification results of PPV BJ2 strain（100×）

2.3.2 qPCR鑒定 采用qPCR 方法檢測BJ2分離株F1～F3代病毒核酸，結(jié)果顯示，F(xiàn)1～F3代病毒液CT 值依次為26.14、22.25、19.12，CT 值隨代次增加而降低（圖3），說明病毒在細(xì)胞傳代培養(yǎng)中有增殖。

圖3 PPV BJ2株增殖鑒定qPCR擴(kuò)增曲線Fig.3 qPCR amplification curve of PPV BJ2 proliferation identification

2.3.3 電鏡形態(tài)學(xué)觀察 對PPV 病毒細(xì)胞培養(yǎng)物上清進(jìn)行電鏡負(fù)染觀察，可見病毒粒子呈圓形、無囊膜，病毒粒子的直徑約為20 nm（圖4）。

圖4 PPV BJ2株病毒粒子形態(tài)學(xué)觀察Fig.4 Morphological observation of virions of PPV BJ2 strain

2.4 PPV BJ2株全基因組PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用PCR 方法擴(kuò)增PPV BJ2 株全基因組片段1—5，其 大 小 分 別 為1 316、1 279、687、1 045、1 209 bp。PCR 結(jié)果顯示，所擴(kuò)增出的片段1—5 與預(yù)期目的條帶大小相符（圖5）。

圖5 PPV BJ2株全基因組PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR results of PPV BJ2 strain whole genome

2.5 PPV BJ2株全基因組序列分析

基于測序結(jié)果，利用MegAlign 軟件，將PPV BJ2和HeN1202 株的全基因組序列與GenBank 收錄的國內(nèi)外18 株具有代表性毒株的全基因組序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示（圖6），BJ2 株和HeN1202 株（實(shí)驗(yàn)室2019 年分離株）與常見毒株核苷酸一致性為95.5%～99.3%，其中BJ2 株與皮炎型強(qiáng)毒株Kresse株、英國Challenge株核苷酸一致性最高（99.3%），與27a 簇JY 株核苷酸一致性為99.0%，與弱毒株NADL-2 株核苷酸一致性為96.4%；HeN1202 株與國內(nèi)HNZK-1 株核苷酸一致性最高（99.3%），與BJ2株核苷酸一致性為95.9%，與27a 簇JY 株核苷酸一致性最低（95.5%）。

圖6 PPV全基因組核苷酸一致性分析Fig.6 The full genome nucleotide identity analysis of PPV

2.6 PPV BJ2株VP2基因序列和推導(dǎo)氨基酸序列分析

將BJ2 株和HeN1202 株與弱毒株NADL-2 株、強(qiáng)毒株Kresse 株、Challenge 株及27a 株進(jìn)行VP2基因核苷酸一致性和遺傳進(jìn)化樹分析。結(jié)果顯示，BJ2 株與強(qiáng)毒株Kresse 株、Challenge 株、27a 株親緣關(guān)系較近（圖7A），其核苷酸一致性依次為99.4%、99.4%、99.3%（圖7B）。HeN1202 株與弱毒代表株NADL-2 株親緣關(guān)系較近，其核苷酸一致性為99.0%（圖7B）。

圖7 PPV VP2基因序列分析Fig.7 Sequence analysis of PPV VP2 gene

將分離株VP2基因與GenBank上登錄的PPV序列進(jìn)行氨基酸序列比對，結(jié)果顯示，分離株BJ2株與PPV 毒株VP2 氨基酸序列一致性為97.1%～99.7%（圖7C）。BJ2 株與Kresse 株相比，共有3 個氨基酸位點(diǎn)存在突變（Q228E、A414T、E419Q）；與27a 株相比，共有2 個氨基酸位點(diǎn)存在突變（S414T、T436P）；與NADL-2 株相比，共有9 個氨基酸位點(diǎn)存在突變（T45S、I215T、Q228E、D378G、H383Q、A414T、E419Q、S436P、R565K）。HeN1202 株與PPV 毒株VP2 氨基酸序列一致性為97.1%～99.8%（圖7C），與NADL-2 株相比，共有13 個氨基酸位點(diǎn)存在突變（E16A、T45S、I164L、H303Y、I320T、D378G、K407N、L391V、S436A、Q544R、I564M、R565K、Y570H）。BJ2 株和HeN1202株與已有代表毒株的VP2蛋白主要氨基酸位點(diǎn)突變情況見表5。

表5 PPV VP2蛋白主要氨基酸變異情況Tab.5 Amino acid variation of PPV VP2 protein

3 結(jié)論與討論

豬細(xì)小病毒病由PPV 感染引起，以妊娠母豬流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎為典型特征，僅通過臨床癥狀很難與其他繁殖障礙性疾病進(jìn)行區(qū)分。PPV 在世界范圍內(nèi)廣泛傳播和流行，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展。PPV 可在豬腎或睪丸細(xì)胞中復(fù)制，包括PK-15細(xì)胞、SK6 細(xì)胞、ST 細(xì)胞等[8，27-29]，在細(xì)胞周期的S 期晚期和G2 期早期可快速復(fù)制[30]。PPV 在細(xì)胞中的增殖可導(dǎo)致胞內(nèi)顆粒樣物質(zhì)增多、變圓、堆積、拉網(wǎng)直至細(xì)胞死亡。本研究應(yīng)用ST 細(xì)胞對病毒進(jìn)行分離，成功從陽性病料中分離到1 株BJ2 株，出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變；IFA 結(jié)果顯示，接毒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)可見特異性綠色熒光。

PPV 基因組編碼結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白又稱為衣殼蛋白，分別為VP1和VP2，其分子質(zhì)量分別為83 ku 和64 ku，VP2 水解后可產(chǎn)生VP3 蛋白，其分子質(zhì)量為60 ku。上述3種蛋白質(zhì)均具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的能力，且誘導(dǎo)能力的強(qiáng)弱為VP2＞VP1＞VP3，且VP2的基因序列可以作為遺傳進(jìn)化樹的分類依據(jù)[21]。全基因組核苷酸序列分析表明，BJ2 株與皮炎型強(qiáng)毒株Kresse 株核苷酸一致性最高，HeN1201 株與HNZK-1 株核苷酸一致性最高?；赩P2基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)BJ2株與德國27a 株處同一進(jìn)化分支，說明我國的PPV分離株在進(jìn)化分支上與德國27a 株相聚較近，證實(shí)國內(nèi)PPVVP2基因抗原漂移，可能導(dǎo)致現(xiàn)有疫苗免疫效果不佳，這與HAO 等[12]的報(bào)道一致，中國PPV出現(xiàn)新的進(jìn)化分支。ZEEUW 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在人工感染27a 株后再次感染異源毒株，不能對機(jī)體提供有效的免疫保護(hù)。目前，還未見針對27a 簇毒株疫苗的相關(guān)報(bào)道。

BERGERON 等[8]在對NADL-2 株和Kresse 株進(jìn)行同素異形體的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，衣殼蛋白中的單個氨基酸的突變可能會影響病毒在細(xì)胞中的復(fù)制，NADL-2 株和Kresse 株基因組非編碼區(qū)幾乎相同，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸均一致，僅在編碼結(jié)構(gòu)蛋白（VP1/VP2）的氨基酸中存在6 個氨基酸突變，且D378G、H383Q 和S436P 這3 個氨基酸位點(diǎn)的突變常被認(rèn)為是造成組織嗜性差異的原因。CHAPMAN等[32]對PPV 結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行3D 解析，發(fā)現(xiàn)436 aa位于衣殼亞基的3 倍刺突中心，這個位置被認(rèn)為是各種細(xì)小病毒最重要的抗原表位區(qū)域[33]。但是關(guān)于PPV抗原漂移對中和活性的影響還有待進(jìn)一步研究。本研究將BJ2 株、HeN1202 株與PPV 代表毒株進(jìn)行VP2 氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，與NADL-2 株、Kresse 株相比，BJ2 株228 位點(diǎn)由Q 突變?yōu)镋、419 位點(diǎn)由E 突變?yōu)镼，這是27a 簇毒株獨(dú)有的突變位點(diǎn)。此外，BJ2 株VP2 氨基酸436 位點(diǎn)和Kresse 株一致，BJ2 株可能與Kresse 株具有相同的組織嗜性，需進(jìn)一步研究。HeN1202株與NADL-2株相比，僅378位點(diǎn)由D突變?yōu)镚、436 位點(diǎn)由S 突變?yōu)锳，各類氨基酸位點(diǎn)在病毒致病性中的作用尚不清楚。

本研究對2020—2021年江蘇、河南和北京等省市的PPV 流行病學(xué)情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示，PPV平均檢出率為19.4%，河南、北京、江蘇的檢出率分別為37.5%、3.5%、8.3%，與2020 年相比，2021 年P(guān)PV 核酸檢出率明顯升高。國內(nèi)其他地區(qū)PPV 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，陽性率為16.7%～40.0%[34-35]。說明PPV 仍然是影響?zhàn)B豬業(yè)的一大難題，PPV 毒株發(fā)生變異可能導(dǎo)致現(xiàn)有疫苗不能針對新發(fā)毒株對機(jī)體提供免疫保護(hù)。

本研究成功分離1 株P(guān)PV，測序分析表明，BJ2株全基因組與高致病性強(qiáng)毒株Kresse 株同源性最高；BJ2株VP2基因序列與強(qiáng)毒株Kresse株、Challenge株、27a 株同源性較高；對分離株VP2 氨基酸序列進(jìn)行推導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，與27a 株僅存在2 個氨基酸位點(diǎn)的差異，且具有Q228E 氨基酸位點(diǎn)的變化是類27a 簇獨(dú)有分子特征。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，河南省PPV檢出率最高。