李春艷，劉芳婷，張王斌

(塔里木大學/南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理兵團重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部阿拉爾作物有害生物科學觀測實驗站，新疆阿拉爾 843300)

0 引 言

【研究意義】蘋果(Maluspumila)薔薇科蘋果亞科蘋果屬植物[1]。2019年新疆蘋果種植面積2.3×104余hm2[2]由病毒和類病毒引起的蘋果外觀異常，導致蘋果品質(zhì)變劣，產(chǎn)量下降[3-4]?！厩叭搜芯窟M展】類病毒是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小病原物，是一類單鏈共價閉合環(huán)狀的裸露RNA分子,通常含330個左右核苷酸[5-7]。類病毒病害在我國蘋果上發(fā)生的主要有三個：蘋果銹果類病毒 (Apple scar skin viroid，ASSVd)、蘋果皺果類病毒 (Apple fruirt crinkle viroid，AFVCd)、蘋果凹果類病毒 (Apple scar skid viroid，ADFVd)[8]。病毒病病害在我國蘋果上發(fā)生的主要有6種[9-10]：蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)、蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)、蘋果莖痘病毒(Apple stem pitting virus，ASPV) 如蘋果綠皺果病毒(Apple green crinkle virus，AgrCV)、蘋果銹果類病毒(Apple scar skin viroid，ASSVd)和蘋果花葉病毒(Apple mosaic virus ,ApMV)。蘋果外觀異常與蘋果銹果類病毒病病狀相似，侵染后通常表現(xiàn)為銹果型、花臉型、銹果-花臉混合型、環(huán)斑型和綠點型等癥狀[11-12]。已有在新疆蘋果樹、梨樹、杏樹、桃樹上蘋果銹果類病毒的報道[13-15]?！颈狙芯壳腥朦c】有關(guān)基于高通量測序?qū)σ鹦陆⒗瓲柼O果外觀異常病原的鑒定文獻較少，以高通量基因測序技術(shù)[16]為研究手段，需對引起阿拉爾蘋果外觀不同情況異常病原進行鑒定分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用田間調(diào)查和高通量基因測序技術(shù)，調(diào)查與分析引起阿拉爾蘋果外觀異常的病原種類、癥狀、發(fā)生情況，確定引起阿拉爾蘋果外觀異常的病毒種類，為防治該病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

于2019年10月新疆阿拉爾六團一連(N40°57′42″，E80°28′49″，海拔1 070 m)不同蘋果園隨機采集6份有顯著癥狀的蘋果果實樣品和無明顯癥狀的枝條樣品。表1

表1 樣品基本信息Table 1 Basic sample information

1.2 方 法

1.2.1 發(fā)病率調(diào)查

選取新疆阿拉爾六團一連西一壟、西二壟、西三壟、西四壟地塊為調(diào)查地，在每壟各個果園中用五點取樣法分別選取40株果樹，記錄栽植信息，描述癥狀并統(tǒng)計發(fā)病率。表2

表2 調(diào)查地基本信息Table 2 Basic information of the survey site

1.2.2 蘋果病毒分子檢測宏轉(zhuǎn)錄組法

1.2.2.1 RNA提取

組織樣品RNA提取采用 TRizol 試劑(天根生化科技(北京)有限公司)進行提取。

1.2.2.2 建庫測序

利用帶有Oligo(dt)的磁珠對含有ploy(A)尾的mRNA富集，將mRNA打斷成短片段合成cDNA，純化后末端修復、加A尾并連接測序接頭，最后進行PCR擴增。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用DPS7.55軟件進行差異顯著性分析(α= 0.05)。

對原始下機數(shù)據(jù)(Raw Data)進行預處理，得到有效數(shù)據(jù)(Clean Data)。數(shù)據(jù)使用Trimmomatic軟件進行質(zhì)控，質(zhì)控后將得到高質(zhì)量序列clean reads，然后基于有效數(shù)據(jù)進行宿主數(shù)據(jù)去除，分析病毒物種分類分析和復雜度，拼接與組裝等。

將測序得到的各病毒基因序列通過MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，采用 Clustal W算法對序列進行比對，采用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展校正值設(shè)為1000，其余使用軟件默認設(shè)置。構(gòu)建進化樹的序列來自于 NCBI。表3

表3 GenBank 已登錄蘋果全長基因組的分離株Table 3 GenBank has logged into the isolates of the full length apple genome

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果外觀異常分類描述

研究表明，田間蘋果外觀異常表現(xiàn)為果實畸形型、裂果型、和著色異常型3種類型。果實畸形型：果實表面不平滑，呈縱向凹陷狀，色澤分布不均勻；裂果型：果面或果頂部出現(xiàn)銹斑，不規(guī)則的銹斑從蘋果頂部向四周蔓延，嚴重時果實銹斑處開裂；著色異常型:果實從著色時開始表現(xiàn)癥狀，在果面出現(xiàn)近圓形黃綠色斑塊，表現(xiàn)出紅黃相間的“花臉狀”，著色部分隆起，用手摸起來凹凸不平。其中黃綠色病斑面積與果實的表面積之比依次遞增。圖1～3

注:A:底部俯視圖 B:正面俯視圖 C：背面俯視圖

注:A: 黃元帥田間表現(xiàn)；B：新世紀正面俯視圖；C:新世紀底部俯視圖

注:A-D：短枝富士田間癥狀觀察結(jié)果

2.2 不同品種間蘋果外觀異常癥狀及發(fā)病情況

研究表明，不同品種間發(fā)病率與癥狀表現(xiàn)有所差異，王林的發(fā)病率最高為74.50%，與新世紀的發(fā)病率存在顯著差異，表現(xiàn)為畸形癥狀；其次是短枝富士，發(fā)病率為70.50%，與王林、新世紀間的發(fā)病率差異不顯著，表現(xiàn)為著色異常、裂果癥狀；發(fā)病率最低的為新世紀，達到了63.50%，表現(xiàn)為著裂果癥狀。3個品種間發(fā)病率雖有差異，但不顯著。表4

表4 不同品種間蘋果外觀異常發(fā)病率比較Table 4 Comparison of the incidence of apple appearance abnormality among different varieties

2.3 不同地塊間蘋果外觀異常發(fā)病比較

研究表明，對不同地塊間蘋果外觀異常發(fā)病率調(diào)查結(jié)果進行分析，西一壟的發(fā)病率最高為83.20%，分別與西三壟、西四壟間發(fā)病率存在顯著差異；其次是西二壟發(fā)病率78.20%，與西四壟間發(fā)病率存在顯著差異；西三龍發(fā)病率為73.20%，分別與西一壟、西四壟間發(fā)病率存在顯著差異；西四壟的發(fā)病率最低為47.20%，與其他3壟的發(fā)病率存在顯著差異。表5

表5 不同果園蘋果外觀異常發(fā)病率比較Table 5 Comparison of the incidence of abnormal apple appearance in different orchards

2.4 蘋果外觀異常病原系統(tǒng)進化

研究表明，在王林上檢測到5種病毒，分別為ASGV、ACLSV、ASPV、AgrCV、ApMV；在短枝富士上檢測到3種病毒，分別為AgrCV、ASPV、ASGV；在新世紀上檢測到4種病毒，分別為ASGV、ACLSV、ASPV、AgrCV。王林、短枝富士、新世紀都檢測到了蘋果莖溝病毒，DZFS-ASGV和WL-ASGV親緣關(guān)系最近共同聚在一個分支上，但XSJ-ASGV與相似性為63%的印度蘋果分離株(LT160740)親緣關(guān)系最近聚在另一個分支上。王林、新世紀上也檢測到了蘋果褪綠葉斑病毒，WL-ACLSV和XSJ- ACLSV與相似性為100%的分離株(M58152)親緣關(guān)系最近共同聚在一個分支上。王林、短枝富士、新世紀也檢測到了蘋果綠皺果病毒，XSJ-AgrCV和WL-AgrCV親緣關(guān)系最近共同聚在一個分支上，但DZFS-AgrCV與相似性為96%的加拿大蘋果分離株(HE963831)親緣關(guān)系最近聚在另一個分支上。王林、短枝富士、新世紀也都檢測到了蘋果莖痘病毒，但都分別聚在不同的分支上WL- ASPV與相似性為100%的日本分離株(AB045371)親緣關(guān)系最近聚在一個分支上，DZFS-ASPV與相似性為99%的印度分離株(FR694186)親緣關(guān)系最近聚在另一個分支上，XSJ-ASPV單獨為一個分支。表6，圖4

表6 蘋果外觀異常攜帶病毒種類Table 6 The apple appears to carry an abnormal virus type

圖4 蘋果分離物核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育Fig.4 Phylogenetic analysis of nucleotide sequences from apple isolates

3 討 論

蘋果果實外觀異常原因較為復雜，已經(jīng)報道的主要是蘋果銹果類病毒(Apple scar skin viroid，ASSVd)引起的。不同品種蘋果外觀異常田間表現(xiàn)癥狀不同與時丕坤[17]觀察結(jié)果一致。高通量測序技術(shù)檢測出在3種不同品種、不同表現(xiàn)癥狀的蘋果中均攜帶蘋果莖溝病毒(ASGV)、蘋果莖痘病毒(ASPV)、蘋果綠皺果病毒(AgrCV)，李鵬舉等[18]在黑龍江省不同蘋果產(chǎn)區(qū)的不同品種的蘋果上也均檢測到了蘋果莖溝病毒(ASGV)。研究表明ASGV、ASPV、ACLSV在蘋果樹中呈混合侵染與楊潔萍等[19]結(jié)果一致。根據(jù)高通量測序結(jié)果顯示，檢測到的病毒有蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)、蘋果莖痘病毒(Apple stem pitting virus，ASPV)、蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)、蘋果花葉病毒(Apple mosaic virus，ApMV)和蘋果綠皺果病毒(Apple green crinkle virus，AgrCV)5種類型，并未檢測到有蘋果銹果類病毒(Apple scar skin viroid，ASSVd)，但多病毒病的混合發(fā)生也表現(xiàn)出了類似蘋果銹果類病毒病的癥狀，有待深入研究。

蘋果類病毒和病毒病害目前無有效防治手段，加強果園管理可緩解病害癥狀的表現(xiàn)[20]，使用套袋技術(shù)可以促進蘋果果面著色、提高果實的貯藏性和果實的商品價值[21]，但無法徹底根除及解決風味變差的問題。發(fā)病率的差異可能與果園土肥水管理，土壤情況，營養(yǎng)不均衡，樹體衰弱，病毒容易入侵，負載量大等有關(guān)[22]。可以通過肥水管理措施，增強樹勢，提高樹體的免疫力。合理負載，平衡樹勢，減小留果密度，及時補充營養(yǎng)等措施減輕病害的發(fā)生[23-24]。蘋果一旦感染上病毒，很難防治，目前蘋果病毒病尚無有效的防治藥劑，只能通過預防手段加以控制，發(fā)現(xiàn)病株，立即拔除。培育無病毒母本，栽培無病毒苗木，加強植物檢疫是防治病毒病的有效方法[25]。

4 結(jié) 論

4.1蘋果外觀異常田間癥狀主要有果實畸形型、銹果型、著色異常型三種類型。不同品種間病害癥狀表現(xiàn)有所差異。短枝富士表現(xiàn)為著色異常、裂果癥狀，攜帶病毒為AgrCV、ASPV、ASGV。王林主要表現(xiàn)為畸形癥狀，攜帶病毒為ASGV、ACLSV、ASPV、AgrCV、ApMV。新世紀表現(xiàn)為裂果癥狀，攜帶病毒為ASGV、ACLSV、ASPV、AgrCV。

4.2新疆阿拉爾蘋果外觀異常在阿拉爾六團一連平均發(fā)病率為70.45%。對不同品種間發(fā)病率比較分析，王林的發(fā)病率為74.50%，短枝富士發(fā)病率為70.50%，新世紀的發(fā)病率為63.50%，同一地塊不同品種間的發(fā)病率無規(guī)律性。西一壟的發(fā)病率為83.20%，西二壟的發(fā)病率為78.20%，西三壟的發(fā)病率為73.20%，西四壟的發(fā)病率為47.20%，蘋果外觀異常發(fā)病率與不同地塊間無相關(guān)性。