梁 雎，劉國宏，王保民，何 橋，阿布來克·尼亞孜，郭紅梅，李興婷，，任紅松

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院吐魯番農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,新疆吐魯番 838000；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100083；3.西南大學(xué),重慶 400715；4.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院綜合試驗場，烏魯木齊，830000)

0 引 言

【研究意義】葉酸是人體生命活動必需的水溶性B族維生素，其分子由蝶啶、對氨基苯甲酸和谷氨酸殘基三部分組成[1-2]。根據(jù)取代基的不同，葉酸分為不同的種類，目前在動植物中已發(fā)現(xiàn)的葉酸種類有50多種[3-4]。葉酸缺乏會引發(fā)巨幼紅細胞貧血等[5-7]。與水稻、谷子等作物相比，蔬菜、水果中葉酸含量較高，成為人體攝入葉酸的主要來源[8-14]。由于蔬菜等在烹飪加熱過程會導(dǎo)致葉酸降解[15-17]，而葡萄以鮮食為主，能使其含有的葉酸不經(jīng)烹飪降解而最大限度地保留，且與其他水果比較葡萄還含有大量天然葡萄糖，可促進葉酸在人體的吸收[18]。葡萄是我國重要的大宗水果，面積約為72.51×104hm2，產(chǎn)量達到1 419.54×104t。其中新疆葡萄面積約為14.393×104hm2，產(chǎn)量達到270.57×104t[19-20]。但高含量天然葉酸葡萄種質(zhì)資源評價、篩選和利用基礎(chǔ)研究尚未見報道，采用ELISA檢測和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，提出一種從分子水平評價和篩選高葉酸葡萄種質(zhì)資源的方法，為高葉酸葡萄種質(zhì)資源的充分利用提供理論基礎(chǔ)。【前人研究進展】不論是比色法、微生物分析或是儀器分析，都難以進行大量樣品的高通量檢測。而對于葡萄種質(zhì)資源篩選來說，大量材料的選擇是關(guān)鍵步驟，實現(xiàn)大量材料的快速篩選，有利于品種篩選的推進，否則，將會影響品種篩選的效率[21-28]。目前，免疫檢測(酶聯(lián)免疫吸附檢測ELISA)是特異、快速、高通量檢測植物活性物質(zhì)的常用方法之一。該方法已經(jīng)應(yīng)用于植物激素、營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子等的檢測。對不同玉米品種中的葉酸含量進行檢測，可以對大批量品種進行的有效的葉酸含量初篩[29]。對山西谷子資源葉酸含量分析與評價的研究結(jié)果，解釋了葉酸含量的變異與地理分布的關(guān)系，通過檢查分析篩選出24份高含量葉酸谷子品種[28]。富含葉酸水稻研究進展，收集了塞拉利昂、圭亞那等地的水稻種質(zhì)資源[10]。已經(jīng)對蔬菜中番茄資源葉酸含量進行了檢測和評價，對高含量番茄品種已經(jīng)進入了實際利用階段[30]。綠葉蔬菜等天然葉酸在人的腸道中被吸收，而合成葉酸是在肝臟內(nèi)被吸收的。肝臟吸收合成葉酸的量有限，未被吸收的過量合成葉酸會進入血液[31]。葡萄本身就含有一定含量葉酸，且葡萄還含有大量天然葡萄糖，可促進葉酸吸收[8-24]，葡萄是天然葉酸篩選的優(yōu)勢果樹。RFLP，RAPD，AFLP，SSR等，ISSR(Inter-simple sequence repeat polymor-phic DNA) 分子標(biāo)記是一種基于微衛(wèi)星序列發(fā)展起來的新的分子標(biāo)記[ 31]， 來源于植物基因組中豐富的簡單序列重復(fù) (SSRs)，用錨定的微衛(wèi)星 DNA 為引物，即在 SSR 序列的 3′端或57′端加上2～4個隨機核苷酸，由此組成的單引物進行重復(fù)序列間DNA的PCR 擴增 。【本研究切入點】ISSR分子標(biāo)記具有簡單迅速、穩(wěn)定高效、DNA 多態(tài)性高的特點，克服了SSR的強特異性，可以在不同物種間通用，同時又克服了RFLP 技術(shù)的局限性和RAPD的假陽性等優(yōu)點。 ISSR 標(biāo)記近年來已廣泛應(yīng)用在葡萄遺傳多樣性及親緣關(guān)系的分析中。需建立檢測葡萄種質(zhì)資源果實的ELISA技術(shù)體系?！緮M解決的關(guān)鍵問題】應(yīng)用ELISA和ISSR標(biāo)記技術(shù)，對22份葡萄種質(zhì)資源果實進行大通量葉酸檢測、遺傳多樣性與親緣關(guān)系比較分析，從分子水平在不同來源葡萄種質(zhì)資源中評價和篩選高含量葉酸葡萄材料，建立葡萄種質(zhì)資源ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)體系。為有效利用高含量葉酸葡萄種質(zhì)資源、創(chuàng)制高含量葉酸新種質(zhì)和研究葉酸相關(guān)遺傳基礎(chǔ)進行前期基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 ELISA材料

材料來源于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院吐魯番農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所葡萄種質(zhì)資源圃，其中包括 6份歐美雜種品種，16份歐亞種品種[ 32-52]。 試驗在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室進行。

1.1.2 ISSR材 料

材料來源于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院吐魯番農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所葡萄種質(zhì)資源圃，其中包括 6份歐美雜種品種，16份歐亞種品種。試驗在重慶西南大學(xué)實驗室進行。表1

1.2 方 法

1.2.1 ELISA方法

1.2.1.1 ELISA主要試驗試劑

包被抗原葉酸-BSA、葉酸單克隆抗體和HRP-羊抗鼠IgG由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)作物化學(xué)控制中心提供，5-甲酰四氫葉酸標(biāo)準(zhǔn)樣品購自美國Sigma公司，其他化學(xué)試劑均購自北京化學(xué)試劑公司。

1.2.1.2 主要試驗儀器

洗板機(普朗集團)；酶標(biāo)儀(Thermo Multiskan)；紫外可見分光光度計(Angilent)；渦旋攬拌器(北京鼎國)；微量移液器(大龍興創(chuàng)實驗儀器公司)；磁力攬拌器(大地自動化儀器廠)；微量髙速離心機(Eppendorf);分析天平(Sartourius);pH儀(Mettler toledo)。

1.2.1.3 最適工作條件的確定

采用棋盤格法確定包被抗原以及抗體最佳稀釋倍數(shù)，以獲得最佳抑制曲線。具體方法如下：(1)用包被緩沖液(Na2CO3-NaHCO3緩沖液，0.01mol/L，pH9.6)將包被抗原葉酸-BSA(1 mg/mL)稀釋1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000五個濃度，分別向酶標(biāo)板上每孔加入100 μL，37℃溫育3 h，棄包被液，用洗液(0.01 M 的Na2HPO4- KH2PO4緩沖液，pH7.5，含0.1% 吐溫-20)洗板3次，甩干。(2)葉酸單抗(1 mg/mL)用樣品稀釋液(0.01 M 的Na2HPO4- KH2PO4緩沖液，pH 7.5，含0.1% 吐溫-20及1 g/L明膠)稀釋成1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000 4個濃度，分別向上述不同濃度抗原孔中加入50 μL/孔，形成棋盤格。(3)每個抗原-抗體濃度組合分別加入50 μL的葉酸標(biāo)準(zhǔn)液2 000 ng/mL和0 ng/mL 2個濃度。37℃溫育30 min，洗液洗板4次。(4)加入0.1 μg/mL 的HRP-羊抗鼠IgG，每孔100 μL，37℃溫育30 min，洗板3次。(5)加OPD底物溶液，每孔100 μL，避光顯色10 min。加2M H2SO4，每孔50 μL終止顯色反應(yīng)。用酶聯(lián)免疫檢測儀在492 nm測定各孔光密度(OD)值。

表 1 用于 ISSR 分析的22份葡萄種質(zhì)資源Table 1 22 Grape germplasm resources used for ISSR analysis

1.2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

包被抗原用包被緩沖液稀釋至工作濃度，加入酶標(biāo)板100 μL/孔，37℃溫育3 h，棄包被液，洗液洗板3次。將50 μL不同濃度(0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 ng/mL) 的葉酸標(biāo)準(zhǔn)液加入酶標(biāo)板，每個濃度重復(fù)3次，再加入50 μL稀釋至工作濃度的葉酸單抗溶液，37℃溫育30 min，洗板3次。每孔加入100 μL 0.1 μg/mL的HRP-羊抗鼠IgG，37℃溫育30 min，棄液后洗板3次。每孔加入100 μLOPD底物溶液，避光顯色10 min，每孔加50 μL 2M H2SO4后于492 nm波長下測各孔OD值。將含0 ng/mL 葉酸標(biāo)準(zhǔn)品孔的OD值設(shè)為BO，其余孔OD值為B。標(biāo)準(zhǔn)品濃度的自然對數(shù)為橫坐標(biāo)，B/BO值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.5 樣品葉酸提取

實驗用乙酸乙酯提取樣品，步驟為：稱取0.5 g新鮮植物材料，加2 mL飽和食鹽水，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10 mL離心管，渦旋30 s，再加入5 mL乙酸乙酯提取，充分震蕩后靜置10 min，吸取3 mL上層有機相，轉(zhuǎn)入新的10 mL離心管中，用氮氣吹干，用2.5 mL樣品稀釋液定容，再稀釋至合適濃度即為待測液。

1.2.2 ISSR方法

1.2.2.1 主要試驗試劑

(1)DNA 提取試劑：PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，去糖緩沖液(成分終濃度：1 mol/L NaCl，0.4 mol/L 葡萄糖，2%PVP，0.1 mol/L(pH=8)Tris-HCl)，蛋白酶(10mg/mL)，β-巰基乙醇，CTAB(成分終濃度：1.4 mol/L NaCl，2%PVP，0.02mol/L EDTA，0.1 mol/L Tris-HCl，2% CTAB)，醋酸鉀，氯仿：異戊醇(24∶1)，無水乙醇，RNA 酶，無菌水，10×loading buffer。

(2)PCR 擴增試劑：2.5 mM dNTPs，5U/μL rTaq，15 mM 10×buffer(Mg2+)，ddH2O。

(3)樣本檢測試劑：30%丙烯酰胺(29gAcr，1gBis 溶于 100 mL 去離子 H2O 中)，5×TBE(27.5 g 硼酸，54 gTris，10 mL 0.5mol/L EDTA 定容至 1 L)，TEMEDA，10%APS(1 g 過硫酸銨溶于 10 mL 去離子水)，固定液(1 g AgNO3，100 mL 無水乙醇，5 mL冰醋酸，定容至 1 000 mL)，顯色液(14 g NaOH，2.5 mL 甲醛，定容至 1 000 mL)，瓊脂糖，溴化乙錠。

1.2.2.2 主要試驗儀器

研缽，微量移液器(Eppendorf)，制冰機(SANYO)，臺式離心機(Eppendorf)，恒溫水浴鍋(Shellab)，恒溫儀，真空離心干燥儀(Eppendorf)，核酸蛋白檢測儀 NANODROP2000(Thermo)，凝膠成像系統(tǒng) Gel DocTmXR+imaging system(BIO-RAD)，Veriti PCR 儀(ABI)，C1000 Touch PCR 儀(BIO-RAD)，垂直板電泳槽(北京六一儀器廠 DYCZ-30C)，水平板電泳槽(北京六一儀器廠DYCP-31E)，普通電泳系統(tǒng)(BIO-RAD)。

1.2.2.3 基因組 DNA 提取

基因組DNA提取參照改良 CTAB 法， 從葡萄幼葉中提取基因組DNA，0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用核酸檢測儀檢測DNA 濃度和純度，并將濃度稀釋至20ng/ mL。

1.2.2.4 DNA 擴增和電泳

采用 20 μL 反應(yīng)體系，其中包括 2 μL模板DNA，2.0 μL Buffer， 0.7 μL引物，0.4 μLTap酶，1.6 μL dNTPs， 13.3 μLDDH2O。

用于ISSR-PCR反應(yīng)的dNTP、Taq酶、標(biāo)準(zhǔn)分子量(Marker) DI2000 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，引物來自加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)提供的ISSR引物序列[3]，由杭州生工公司合成。

PCR 反應(yīng)程序為：94℃ 預(yù)變性1.5 min，94℃ 變 性 40 s，53℃ 退火1 min， 72℃ 延伸 1.5 min， 進行 40個循環(huán)， 最后 72℃ 延伸 5 min， 4℃保存。PCR 反應(yīng)在德國Biometra公司生產(chǎn)的Tl型PCR循環(huán)儀上進行。擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，將電泳產(chǎn)物在凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD molecalar imager cel doc xr +)的紫外燈下觀察、照相并保存圖片。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 ELISA數(shù)據(jù)

依據(jù)葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線將所測OD值帶入計算所測樣品葉酸含量。

1.3.2 LSSR數(shù)據(jù)

根據(jù)各分子標(biāo)記在相同電泳遷移率(相同分子量片段)的有無統(tǒng)計得到所有位點的二元數(shù)據(jù)，有DNA 擴增帶記為1，無帶記為0。利用NT-SYSpc2.10e軟件進行Jaccard相似性系數(shù)分析，并通過非加權(quán)配對算術(shù)平均法(UPGMA) 進行聚類分析，建立親緣關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

研究表明，葉酸含量均值黑奇無核最高，為46.953 4 ng/g；其與紅巴拉多、炎興無核無顯著差異；其與紅寶石、夏黑、達米拉、本納格、蜜紅、無核紫、瑞都翠霞、宇選1號、京密、里扎馬特、洛浦早生、粉紅亞都蜜、雜1、美人指、無核白、紅標(biāo)無核、1124、京翠有顯著差異；這批檢測的葡萄種質(zhì)資源中葉酸含量最低的是京翠，為5.039 4 ng/g；歐亞種的葉酸含量平均為17.234 9 ng/g，歐美雜種的為13.236 2 ng/g，歐亞種的葉酸含量較歐美雜種高3.998 7 ng/g。表2

2.1 ISSR多態(tài)性分析

研究表明，9 條引物共擴增出78條帶，其中多態(tài)性條帶70 條，多態(tài)性百分率 89.7%。單條引物擴增的條帶為4～13條，平均 8條。擴增產(chǎn)物長度介于250～3 000 bp，以500～2 000 bp的擴增片段居多。擴增條帶數(shù)最多的引物為BC881，達13條，多態(tài)性百分率為100%，引物 BC856，BC811擴增條帶數(shù)最少，均為4條。其中多態(tài)性百分率最高的還有BC815和 BC834，達100%，最低的為BC811，為25%。 表3，圖1

表 2 22份葡萄種質(zhì)資源果實葉酸含量的方差Table 2 Variance analysis of folic acid content in 22 grape germplasm resources

圖1 ISSR 引物 881 對葡萄種質(zhì)資源的擴增結(jié)果Fig．1 Amplification profile of ISSR prime881 with part of samples

表3 不同引物的堿基序列及擴增結(jié)果Table 3 Sequence and amplification efficiency of different primers

2.2 聚類分析

研究表明，22 份葡萄材料的遺傳相似系數(shù)為 0.474 4～0.846 2，平均遺傳相似系數(shù)為0.654 5，其中無核紫與宇選1號、木納格與力扎馬特的遺傳相似系數(shù)最大，均為 0.846 2 。宇選 l號與木納格的遺傳相似系數(shù)最小，為 0.474 4 。

在遺傳相似系數(shù)為 0.621處，22份葡萄材料明顯分為 2 大類群。第 1 大類包含1個歐亞種(紅巴拉多)，其余為第 2大類。在遺傳相似系數(shù)為 0.622處，21份葡萄材料又明顯分為 2 大類群。 第 1 大類包含11個歐亞種(炎興無核、灰比諾、瑞都翠霞、京蜜、黑奇無核、無核白、1124、京翠、紅寶石、無核紫、達米娜)，6個歐美雜種 (雜1、夏黑、蜜紅、紅標(biāo)無核、洛浦早生、宇選1號)；第2大類包含4個歐亞種(美人指、粉紅亞都蜜、木納格、里扎馬特)。 圖2

2.3 22份葡萄種質(zhì)資源聚類后葉酸含量分析

研究表明，在遺傳相似系數(shù)為 0.621處，22份葡萄材料明顯分為 2 大類群。第 1 大類葉酸含量平均為35.79 ng/g；，其余為第 2大類，葉酸含量平均為15.71 ng/g。在遺傳相似系數(shù)為 0.622處，21份葡萄材料又明顯分為 2 大類群。 第 1 大類葉酸含量平均為16.53 ng/g；第2大類葉酸含量平均為12.24 ng/g。 群體1的葉酸含量比群體2的葉酸含量高。圖3

圖3 22份葡萄種質(zhì)資源聚類后葉酸含量變化Fig.3 Analysis of folic acid content of 22 Grape Germplasm Resources after clustering

3 討 論

目前，建立葉酸酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)已有較多報導(dǎo)，楊霈瑤[21]報道了葉酸競爭抑制ELISA檢測方法的建立，通過碳二亞胺法，將葉酸和牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白分別偶聯(lián)合成了葉酸免疫原(FA-BSA、FA．BSA．ACA)和包被原(FA-OVA)，利用FA-BSA免疫家兔制備多克隆抗體，在純化抗體的基礎(chǔ)上建立葉酸間接ELISA檢測方法并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；劉小軍[53]利用酶聯(lián)免疫技術(shù)研制一種快速檢測食品中的葉酸試劑盒，經(jīng)過測試，該試劑盒對牛奶樣本的檢測限為 10.0 ug/L。建立ELISA方法進行玉米中5-甲酰四氫葉酸含量的檢測。Yue等[29]制備單克隆抗體，對不同玉米品種中的葉酸含量進行檢測，可以對大批量品種進行的有效的葉酸含量初篩。李貞[54]建立了牛奶中葉酸檢測的酶聯(lián)免疫反應(yīng)方法，并對其葉酸本底含量測定。用競爭性酶聯(lián)免疫，棋盤法確定最佳抗體包被條件、封閉條件、酶標(biāo)抗原濃度等，并進行性能評價測定，檢測 80 例牛奶樣品中的葉酸本底含量。牛奶樣本葉酸本底含量范圍為12.55～68.72 ng/mL，均值37.93 ng/mL；解鑫[55]用酶聯(lián)免疫法的試劑盒對代表性乳粉樣品進行3 d 3平行檢測，對檢測數(shù)據(jù)做正態(tài)分布分析及不確定度計算，結(jié)果表明，酶聯(lián)免疫方法不確定度范圍為 9.6%～31.3%。此方法的最低檢測限為2.22 ng/mL；李江[56]建立一種檢測奶粉中葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的酶聯(lián)免疫分析方法，結(jié)果表明，當(dāng)加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20，40和80 μg/kg時，空白基質(zhì)奶粉中葉酸的提取回收率為93.5%～118.0%；非空白基質(zhì)樣品中葉酸的加標(biāo)回收率為88%～92%；方法檢出限為4 μg/kg。

近年來， 應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)進行葡萄品種鑒定、分析種質(zhì)間的遺傳多樣性、品種間的親緣關(guān)系等方面已有較多的報道。王發(fā)明等[ 57]對廣西桂林的 17 份野生毛葡萄種質(zhì)和 41 份栽培葡萄種質(zhì)，使用12條ISSR引物進行了遺傳多樣性和親緣關(guān)系檢測。聚類分析表明41份葡萄資源中，京亞、香玉、藤稔等 11 個品種聚為一類，克倫森、夏黑、紅玫瑰等6個品種聚為一類，群體遺傳分析表明，ISSR分子標(biāo)記可以產(chǎn)生豐富的遺傳多態(tài)性位點，可以有效地應(yīng)用于葡萄種質(zhì)遺傳多樣性研究上。張富民等[ 58]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對福建省各葡萄種植區(qū)收集到的196份葡萄資源進行親緣關(guān)系鑒定。聚類分析表明，196份葡萄資源可以分為3大類，即東亞種群、歐美雜種和歐亞種；群體遺傳分析表明，葡萄資源種內(nèi)存在豐富的遺傳多樣性。吳子龍等[59]利用ISSR標(biāo)記對l5份葡萄材料進行了基因組多態(tài)性分析，結(jié)果表明山葡萄與歐亞種 、美洲雜種葡萄的親緣關(guān)系較遠，歐亞種與美洲雜種之間親緣關(guān)系較近。張永福等[ 60]利用 ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)對彌勒市8個主栽葡萄品種進行基因組多態(tài)性檢測，聚類分析表明，8 份試材中玫瑰蜜、水晶、紅玫瑰等分為第 1 大類，紅地球、競秀、青提等為第2大類。 唐宇宏等[61]采用ISSR技術(shù)對黑龍江省西部地區(qū)葡萄的9個品種進行親緣關(guān)系的研究，聚類分析結(jié)果可分出歐亞種和美洲種。 張永輝等[62]利用ISSR 標(biāo)記對81份葡萄資源進行分類研究，將供試材料毛葡萄 1 099 確定為桑葉葡萄，對葡萄進行重新分類。崔鵬等[63]用ISSR 標(biāo)記研究南方45個葡萄主要栽培品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。聚類分析將 45 個供試品種分為兩個類群，歐亞種群和歐美雜種群。吳代東等[64]用 ISSR 標(biāo)記研究36份抗病性不同的葡萄種質(zhì)，聚類分析將 36 個供試品種分為兩個類群，第1類包含9個品種分別為：雷司令、刺水 14、黑珍珠4號等； 第2類包含27個品種，包括水源12號、水源4號、金 1等。 陳小宇等[65]用 ISSR 標(biāo)記研究蛇龍珠8個新株系的親緣關(guān)系和遺傳多樣性，聚類分析表明蛇龍珠E06與其他7個株系有差異，另外7個株系聚為一類。賴呈純等[66]利用 ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)對 95 份葡萄品種(系) 資源進行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析; 聚類分析結(jié)果表明，95 份葡萄資源劃分為3大類，分別為歐亞種、歐美雜種和東亞種群，這與葡萄傳統(tǒng)分類結(jié)果一致。李琳等[ 31]利用 ISSR 標(biāo)記對 24 份葡萄材料進行了基因組多態(tài)性分析，聚類分析結(jié)果表明，24 份葡萄材料明顯分為2 大類群，第 1 類包含10個歐美雜種、7個歐亞種、1個華歐雜種，第2 類包含3個美洲雜交種、1個河岸葡萄 、1個冬葡萄、1個東亞葡萄。美洲雜交種與歐美雜種 、 歐亞種葡萄的親緣關(guān)系較遠，歐美雜種與歐亞種葡萄之間親緣關(guān)系較近。利用ISSR技術(shù)進行葡萄種質(zhì)資源進行的親緣關(guān)系鑒定和聚類分析，并沒有將結(jié)果應(yīng)用到評價和篩選葡萄種質(zhì)資源相關(guān)性狀上。

4 結(jié) 論

在遺傳相似系數(shù)為 0.621處，22份葡萄材料明顯分為 2 大類群。第 1 大類葉酸含量平均為35.79 ng/g；其余為第 2大類，葉酸含量平均為15.71 ng/g。在遺傳相似系數(shù)為 0.622處，21份葡萄材料又明顯分為 2 大類群。第1大類葉酸含量平均為16.53 ng/g；第2大類葉酸含量平均為12.24 ng/g。歐亞種的Folic acid含量較歐美雜種稍高3.998 7 ng/g；群體1的葉酸含量比群體2的葉酸含量高。歐亞種的葉酸含量較歐美雜種稍高；在遺傳相似系數(shù)為0.621處，22份葡萄材料明顯分為2大類群。第1大類包含1個歐亞種(紅巴拉多)，其余為第2大類。在遺傳相似系數(shù)為 0.622處，21份葡萄材料又明顯分為2大類群。第1大類包含11個歐亞種(炎興無核、灰比諾、瑞都翠霞、京蜜、黑奇無核、無核白、1124、京翠、紅寶石、無核紫、達米娜)，6個歐美雜種 (雜1、夏黑、蜜紅、紅標(biāo)無核、洛浦早生、宇選1號)。第2大類包含4個歐亞種(美人指、粉紅亞都蜜、木納格、里扎馬特)；ISSR標(biāo)記在葡萄種質(zhì)資源鑒定有較高的分辨能力。