才 羿，戴冬洋，2，譚 海，王 迪，楊 芬，王 嶺，盛云燕

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶 163319；2.石河子大學(xué)，新疆石河子 832000；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163310)

0 引 言

【研究意義】甜瓜(CucumismeloL.)是葫蘆科黃瓜屬甜瓜種一年生雙子葉蔓性草本植物。植物雄性不育是作物雜種優(yōu)勢(shì)利用的主要途徑，具有重要的生產(chǎn)利用價(jià)值。利用雄性不育降低生產(chǎn)成本可以保證農(nóng)作物授粉的成功率以及提高農(nóng)作物產(chǎn)量。甜瓜具有較高的雜種優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用雄性不育材料可以降低生產(chǎn)投入，減少花器損傷，節(jié)省田間勞動(dòng)力、提高雜交制種效率，提高甜瓜產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。ABORTEDMICROSPORES(AMS)在擬南芥雄性不育中具有重要的作用，前期對(duì)甜瓜單細(xì)胞核雄性不育進(jìn)行定位并篩選候選基因得到AMS為關(guān)鍵基因，但是其調(diào)控甜瓜雄性不育的功能尚不明確。AMS基因是甜瓜花藥發(fā)育過程中參與花粉壁合成和調(diào)控絨氈層后期的關(guān)鍵因子，其編碼bHLH類轉(zhuǎn)錄因子。若AMS基因發(fā)生異常，則不能正常形成花粉，會(huì)導(dǎo)致甜瓜雄性不育的發(fā)生?；蚓庉嬢d體的構(gòu)建是基因功能鑒定的重要步驟?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前期在研究甜瓜雄性不育時(shí)發(fā)現(xiàn)該性狀為單隱性細(xì)胞核雄性不育(Genic male sterility，GMS)類型[1-2]，該不育類型主要是由于絨氈層發(fā)育異常導(dǎo)致[3]，過程受到復(fù)雜機(jī)制的調(diào)控。bHLH(BasicHelixLoopHelix)蛋白參與絨氈層退化[4]，而ABORTEDMICROSPORES(AMS)基因是編碼bHLH類轉(zhuǎn)錄因子，是花粉發(fā)育的關(guān)鍵基因之一[5-8]。AMS基因是花粉壁形成的主要調(diào)節(jié)劑[2]，其在擬南芥中表達(dá)是在減數(shù)分裂前開始，并在減數(shù)分裂后表達(dá)量增加，其與其它絨氈層特定基因相比，AMS基因的表達(dá)時(shí)間更長[9]。AMS基因與絨氈層和花粉發(fā)育的雙相調(diào)節(jié)有關(guān)。盛云燕等[10]在甜瓜雄性不育基因定位的研究發(fā)現(xiàn)，AMS基因?yàn)樘鸸蠁坞[性核不育性狀候選基因，經(jīng)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該基因表達(dá)在可育植株中表達(dá)量顯著高于不育株。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析可育株與不育株花蕾不同發(fā)育時(shí)期差異基因，AMS基因顯著差異表達(dá)[11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】通過基因定位確定控制甜瓜單隱性核不育性狀的候選基因?yàn)锳MS基因[10]，但是其調(diào)控機(jī)理尚不明確，而CRISPR/Cas9技術(shù)目前在多種作物中開展基因功能驗(yàn)證，而在甜瓜方面的應(yīng)用尚不廣泛。需研究鑒定甜瓜雄性不育候選基因ABORTEDMICROSPORES(AMS)的基因家族。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用生物信息學(xué)技術(shù)鑒定甜瓜雄性不育候選基因ABORTEDMICROSPORES(AMS)家族基因，構(gòu)建甜瓜AMS基因的CRISPR/Cas9植物基因敲除載體，對(duì)AMS基因進(jìn)行定向編輯，為甜瓜AMS基因功能及雄性不育的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1AMS基因家族成員篩選與鑒定

前期獲得的甜瓜AMS基因(MELO3C021653.2.1)序列[12]作為目標(biāo)序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和PYTOZOME數(shù)據(jù)庫(https://phytozome．jgi．doe．gov/pz/portal．html#)數(shù)據(jù)庫同源比對(duì)擬南芥AMS基因家族，篩選出帶有Helix-loop-helix DNA結(jié)構(gòu)域的典型同源基因。利用PYTOZOME數(shù)據(jù)庫、https://pickle.vcru.wisc.edu/wenglab數(shù)據(jù)庫、葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫(http://cucurbitgenomics.org/)和NCBI數(shù)據(jù)庫同源篩選，具有典型的Helix-loop-helix DNA結(jié)構(gòu)域的甜瓜AMS基因，搜索NCBI數(shù)據(jù)庫和葫蘆科數(shù)據(jù)庫兩種方法鑒定篩選甜瓜AMS基因家族成員。數(shù)據(jù)在PHYTOZOME和SMART數(shù)據(jù)庫(http://smart.embl-heidelberg.de/)中對(duì)非冗余的蛋白序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。

1.1.2AMS基因靶點(diǎn)的選擇及線性化載體制備

利用已發(fā)表的甜瓜AMS基因的CDS區(qū)，通過在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站(http://crispr.mit.edu:8079/?)設(shè)計(jì)sgRNA并進(jìn)行靶位點(diǎn)選擇及特異性分析。篩選出3個(gè)靶點(diǎn)作為AMS基因的敲除位點(diǎn)。表1

1.2 方 法

1.2.1 甜瓜AMS基因GRISPR/Cas9敲除載體的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增體系為：DNA模板、正向引物和反向引物10 pmol各1 μL、PremixTaq3 μL，用ddH2O補(bǔ)足10 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，最后4℃保溫。

利用限制性內(nèi)切酶BsaⅠ制備線性化載體pHSN401，酶切體系為：10×Green Buffer 1.5 μL，Bsa I (Thermo #ER0291) 0.5 μL，50588 pHSN401 2 μg，ddH2O補(bǔ)齊到15 μL，37℃，20 min，經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)、回收得到的線性化載體50588 pHSN401-BsaI。表1

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.2AMS-pHSN401 CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將得到的線性化載體50588 pHSN401-BsaI分別與1∶10稀釋的退火產(chǎn)物相連接，連接體系為：2x buffer 5 μL，50588 pHSN401-BsaI1 μL，1∶10稀釋的退火產(chǎn)物1 μL，ligase (NEB #M2200) 0.5 μL，ddH2O 2.5 μL，25℃，30 min。轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含卡那霉素(Kana)的抗性培養(yǎng)板篩選單克隆，菌落PCR檢測(cè)并測(cè)序驗(yàn)證，分別命名為：AMS-pHSN401-1、AMS-pHSN401-2和AMS-pHSN401-3。

1.2.3AMS-pHSN401 CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并鑒定

取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于室溫待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時(shí)插入冰中。100 μL感受態(tài)加入適量質(zhì)粒DNA，用手撥打管底混勻，依次于冰上靜置5 min、液氮5 min、37℃水浴5 min、冰浴5 min。加入700 μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)2～3 h。6 000 r/min離心1 min，留取100 μL左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含Kana的LB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d。待平板長出單克隆，挑單克隆搖菌，進(jìn)行PCR鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1AMS基因進(jìn)化

利用MEGA 7.0軟件對(duì)擬南芥、黃瓜、甜瓜、番茄等物種AMS同源基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，采用鄰接(Neighbor-Joining，NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并設(shè)置bootstrap為1 000檢驗(yàn)，分析不同物種蛋白系統(tǒng)間的親緣關(guān)系以及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

1.3.2AMS基因理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)及染色體定位

AMS基因蛋白的等電點(diǎn)、分子量采用Expasy ProtParam(http://web．expasy．org/protparam/)進(jìn)行分析，并用WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)預(yù)測(cè)基因亞細(xì)胞定位。通過葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫(http://cucurbitgenomics.org/)和NCBI數(shù)據(jù)庫(http://blast．ncbi．nlm．nih．gov/Blast．cgi)分析甜瓜AMS同源基因在染色體上的位置。

1.3.3AMS相關(guān)基因基序預(yù)測(cè)、保守結(jié)構(gòu)域和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過MEME(http://meme-suite.org/)對(duì)AMS基因保守基序進(jìn)行分析。利用SMART數(shù)據(jù)庫(http://smart.embl-heidelberg.de/)對(duì)AMS基因進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，并利用IBS 1.0軟件進(jìn)行可視化分析。甜瓜AMS基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)和各二級(jí)結(jié)構(gòu)所占比例采用在線SOPMA數(shù)據(jù)庫(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl page=/NPSA/npsa_sopma.html)進(jìn)行在線預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMS基因生物信息學(xué)分析

2.1.1AMS基因進(jìn)化

研究表明，42個(gè)AMS同源基因共分為3個(gè)亞族，其中5個(gè)甜瓜AMS基因被分為2個(gè)亞族，亞族Ⅱ未發(fā)現(xiàn)甜瓜AMS基因；剩余2個(gè)亞族中，甜瓜AMS基因與黃瓜AMS基因進(jìn)化關(guān)系較近，同源性較高，與擬南芥和番茄的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，甜瓜AMS基因(MELO3C021653.2.1)在亞族Ⅲ。 圖1

圖1 甜瓜、擬南芥、黃瓜和番茄AMS基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.1 Phylogenetic relationships of AMS genes from melon, arabidopsis, cucumber and tomato

2.1.2 甜瓜AMS基因理化性質(zhì)及染色體定位

研究表明，甜瓜AMS蛋白從501～605 aa不等，平均分子量約為59 351 Da，等電點(diǎn)為5.04～6.45，大部分甜瓜AMS基因定位于細(xì)胞核中，也有部分存在胞間層和細(xì)胞質(zhì)中。其中目標(biāo)序列MELO3C021653.2.1，氨基酸數(shù)目為605 aa，等電點(diǎn)為5.04，帶正電荷，亞細(xì)胞預(yù)測(cè)該基因位于細(xì)胞核。5個(gè)甜瓜AMS基因分別定位在第4、6、9號(hào)染色體上。表2

表2 甜瓜AMS基因理化性質(zhì)及染色體定位Table 2 Physicochemical properties and chromosome location of AMS gene in Melon

2.1.3 甜瓜AMS基因的保守元件及結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

研究表明，在5個(gè)甜瓜AMS基因氨基酸序列中鑒定出10個(gè)保守基序，甜瓜MELO3C021653.2.1基因含有保守基序1、5、8、9；所有甜瓜AMS基因均含有保守基序1，保守基序1是甜瓜AMS基因家族蛋白最重要的保守基序。甜瓜AMS基因家族的保守結(jié)構(gòu)域相對(duì)單一，多數(shù)蛋白只具有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域HLH(Helix-Loop-Helix)，少數(shù)蛋白還具有低復(fù)雜性區(qū)域。圖2

圖2 甜瓜AMS基因保守元件及結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.2 Conserved motif and Domains analysis of AMS genes in Melon

2.1.4 甜瓜AMS基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

研究表明，AMS基因(MELO3C021653.2.1)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，延伸鏈(Extended strand)和β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)主要分布在蛋白的兩邊，無規(guī)卷曲(Random coil)所占比例最高，占52.07%，α-螺旋(Alpha helix)所占比例也達(dá)到33.06%。表3、圖3

表3 甜瓜AMS基因各二級(jí)結(jié)構(gòu)所占比例Table 3 Proportions of secondary structure of AMS genes

圖3 甜瓜AMS基因二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of secondary structure of AMS gene in Melon

2.2 AMS-pHSN401基因敲除載體的構(gòu)建

研究表明，設(shè)計(jì)篩選出3個(gè)靶位點(diǎn)，3個(gè)靶點(diǎn)位于甜瓜MELO3C021653.2.1基因的CDS區(qū)。利用限制性內(nèi)切酶BsaI制備線性化載體pHSN401。將構(gòu)建好的甜瓜MELO3C021653.2.1質(zhì)粒AMS-pHSN401-1、AMS-pHSN401-2和AMS-pHSN401-3分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，獲得AMS-pHSN401基因敲除載體。圖4

注:M：DL4500 DNA Maker；+：陽性對(duì)照；1、2、3分別為質(zhì)粒AMS-pHSN401-1、AMS-pHSN401-2和AMS-pHSN401-3

3 討 論

甜瓜具有較高雜種優(yōu)勢(shì)[13]，雄性不育材料的應(yīng)用可減少制種成本，為育種提供良好的親本材料[14]。植物雄性不育受遺傳基因、物質(zhì)代謝、激素、溫度、光照等多種因素影響[15]，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)大量與雄性不育相關(guān)基因(DYT1、AMS1、MS等)，在影響孢子減數(shù)分裂、絨氈層降解、花粉形成方面具有與重要作用[16]。AMS具有調(diào)節(jié)絨氈層分泌、形成花粉壁物質(zhì)，以及在小孢子和未成熟花粉粒中影響絨氈層到心室的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等功能[17]。戴艷麗等[18]2019年利用大蔥中對(duì)ALS基因進(jìn)行克隆并開展CRISPR/Cas9載體構(gòu)建，為大蔥抗除草劑新品種的選育奠定了良好的基礎(chǔ)；岳寧波等[19]2020年利用CRISPR/Cas9技術(shù)設(shè)計(jì)3個(gè)靶標(biāo)位點(diǎn)定點(diǎn)編輯SlMAPK6，并獲得突變體CRISPR-3和CRISPR-7，所有突變植株表現(xiàn)出根系更發(fā)達(dá)、側(cè)枝增多的表型，SlMAPK6在番茄植株形態(tài)建成的過程中發(fā)揮了重要作用。試驗(yàn)對(duì)甜瓜的AMS基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析并且構(gòu)建了甜瓜雄性不育關(guān)鍵基因AMS基因敲除載體。明確了甜瓜AMS基因的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)甜瓜的AMS基因進(jìn)行了理化性質(zhì)的分析以及染色體位置的預(yù)測(cè)，對(duì)甜瓜AMS基因的保守元件，結(jié)構(gòu)域及蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，甜瓜AMS基因家族的多樣性。

遺傳轉(zhuǎn)化是實(shí)現(xiàn)基因功能驗(yàn)證和基因快速轉(zhuǎn)育的重要手段，但目前甜瓜的遺傳轉(zhuǎn)化體系尚不穩(wěn)定，可選取材料范圍比較窄，外源基因種類比較少等。

近年來CRISPR/Cas9系統(tǒng)經(jīng)過不斷優(yōu)化升級(jí)，其功能日益增強(qiáng)，應(yīng)用范圍逐步擴(kuò)大。與其他基因編輯技術(shù)相比具有操作簡便、靈活、效率高的優(yōu)勢(shì)[20-21]。

王雪等[22]采用CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)，構(gòu)建CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除甜瓜ACC合成酶基因表達(dá)載體的方法，利用“老漢瓜”品種的甜瓜ACC合成酶的基因成功的構(gòu)建了敲除載體，為培育甜瓜的耐貯保鮮品種打下了基礎(chǔ)。楊晶等[23]利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)基因組編輯技術(shù)，構(gòu)建了甜瓜eIF4E基因敲除載體。

4 結(jié) 論

甜瓜AMS基因家族經(jīng)生物信息學(xué)分析，編碼甜瓜AMS基因蛋白長度從501～605 aa不等，并且具有相同的保守結(jié)構(gòu)域HLH，AMS基因主要被預(yù)測(cè)在細(xì)胞核中表達(dá)。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在育種方向上具有應(yīng)用前景，構(gòu)建甜瓜敲除重組載體AMS-pHSN401并轉(zhuǎn)化到了農(nóng)桿菌中，經(jīng)檢測(cè)已獲得陽性菌落。