楊 碩，唐宗馨，段勃帆，陳禹含，郭歡新，孟祥晨*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一種慢性復(fù)發(fā)性炎癥性疾病，包括克羅恩?。–rohn’s disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）[1]。免疫失衡、腸道屏障通透性的改變、微生物群的狀態(tài)以及飲食與生活方式等環(huán)境因素的變化都對該病的發(fā)生和發(fā)展有很大影響[2]。Jacob等[3]于2020年對IBD發(fā)病率進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，每年歐洲UC的患病率為24.3～505.0/10萬 人，而CD的患病率為12.7～322.0/10萬 人；北美UC的患病率為19.2～249/10萬 人，而CD的患病率為20.2～319/10萬 人。近年來隨著城市化進(jìn)程不斷發(fā)展，中國IBD的發(fā)病率也逐漸上升，到2025年預(yù)計將有150多萬IBD病例[4]。目前，IBD的治療方法聚焦在應(yīng)用抗炎藥物方面，如糖皮質(zhì)激素、5-氨基水楊酸、硫嘌呤生物制劑等可用于不同類型的IBD治療[5]。隨著對腸道菌群研究的深入，益生菌治療也成為研究熱點，雙歧桿菌作為腸道內(nèi)的優(yōu)勢有益菌群，菌體自身或其代謝產(chǎn)物可黏附于腸道，阻止致病菌的定植以及易位[6]。本實驗室前期研究表明，將兩歧雙歧桿菌H3-R2作用于免疫低下小鼠中可修復(fù)腸道黏膜，調(diào)節(jié)炎癥因子，同樣證明雙歧桿菌具有替代治療或者輔助治療IBD的潛力[7]。本文綜述了雙歧桿菌及其制劑在IBD治療中的應(yīng)用及其作用機(jī)制。

1 雙歧桿菌及其制劑概述

腸道菌群具有轉(zhuǎn)化食物、調(diào)節(jié)免疫功能、影響脂肪儲存等重要功能[8-10]。雙歧桿菌屬作為腸道菌群的主要組成部分，其代謝過程中產(chǎn)生的共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）、胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）、短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）以及吲哚-3-乳酸（indole-3-lactic acid，ILA）等多種物質(zhì)均已被證明具有調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)及其他多種生理功能[11-14]。同時，雙歧桿菌也因其可增強(qiáng)免疫、抵制有害菌侵入等多種益生功能而在工業(yè)上被廣泛生產(chǎn)制備為緩解腸道疾病制劑。常見的有雙歧桿菌三聯(lián)活菌片、雙歧桿菌四聯(lián)活菌片、常樂康以及金雙歧等制劑[15]。

市售雙歧桿菌制劑種類有限并且多為復(fù)合益生菌制劑，單菌制劑較少，除受雙歧桿菌自身嚴(yán)格的生長條件影響外，還因有研究表明，治療UC時應(yīng)用混合益生菌的療效優(yōu)于使用單菌株療效[16]。Wang Nana[17]、Fujiwara[18]、Philippe[19]等的實驗均證明動物雙歧桿菌、長雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌17具有緩解結(jié)腸炎效果。但Yu Rui等[20]將青春雙歧桿菌IF1-03以及青春雙歧桿菌IF1-11分別作用于葡聚糖硫酸鈉鹽（dextran sulfate sodium salt，DSS）誘導(dǎo)的IBD模型小鼠，發(fā)現(xiàn)IF1-03對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎具有保護(hù)作用，而IF1-11卻幾乎沒有改善作用。同時，F(xiàn)leming等[21]發(fā)現(xiàn)短雙歧桿菌BBG-001對于恢復(fù)腸道屏障、調(diào)節(jié)腸炎無明顯效果。以上結(jié)果表明，不同種乃至不同株的雙歧桿菌益生效果具有菌株特異性，針對不同菌株的作用效果仍需繼續(xù)進(jìn)行探索。

2 雙歧桿菌及其制劑在IBD中的應(yīng)用

UC和CD的發(fā)病原因、病理特征和病變范圍不完全相同，UC病變主要集中在結(jié)腸，以黏膜炎癥為特征，而CD的病變范圍涉及到整個胃腸道，以透壁炎癥為特征[22]。研究發(fā)現(xiàn)將益生菌應(yīng)用于UC治療比應(yīng)用于CD治療更有效[15]。同樣地，雙歧桿菌及其制劑在IBD中的應(yīng)用也更多集中于UC的治療。

雙歧桿菌及其制劑廣泛應(yīng)用于UC的治療，Amiriani等[23]采用隨機(jī)、雙盲臨床試驗方法將60 名輕中度UC患者分為兩組，隨機(jī)給予包含雙歧桿菌的復(fù)合益生菌制劑或安慰劑進(jìn)行為期8 周的治療，結(jié)果顯示益生菌組臨床結(jié)腸炎活動指數(shù)（simple clinical colitis activity index，SCCAI）顯著降低，并且益生菌組的治療效果在超過5 年病齡的患者中更加顯著。另外，針對日本輕度至中度活動期UC患者的實驗結(jié)果表明，長雙歧桿菌536不僅在腸道中具有良好的耐受性，而且用其治療8 周后顯著降低了患者疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）和結(jié)腸Rachmilewitz內(nèi)鏡指數(shù)（endoscopic index，EI）[24]。除此之外，雙歧桿菌與治療UC的藥物聯(lián)合還具有協(xié)同作用，di Pierro等[25]研究表明長雙歧桿菌W11可作為抗生素治療的輔助劑，比單獨使用利福昔明治療效果增加了一倍。Palumbo等[26]研究表明，與單獨接受美沙拉嗪治療相比，接受美沙拉嗪聯(lián)合含有雙歧桿菌的復(fù)合益生菌治療的UC患者病情得到更好的改善；而且益生菌的聯(lián)合治療效果甚至在治療兩年之后也依舊明顯。

由于CD發(fā)病機(jī)制相對復(fù)雜、并發(fā)癥多，雙歧桿菌及其制劑在治療CD方面的研究相對有限[27]。Fedorak等[28]評估了益生菌合劑VSL#3（8 種不同的益生菌種類的混合物，包含3 株雙歧桿菌）預(yù)防CD術(shù)后復(fù)發(fā)的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與術(shù)后90 d后再進(jìn)行益生菌晚期干預(yù)治療相比，在行腸切除術(shù)后立即接受并持續(xù)接受一年的VSL#3治療可顯著降低白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-8、IL-1β等促炎細(xì)胞因子的水平，同時顯著降低術(shù)后復(fù)發(fā)率。Steed等[29]應(yīng)用長雙歧桿菌和Synergy1組成的合生元對35 名活動性CD患者進(jìn)行為期6 個月的治療，發(fā)現(xiàn)合生元顯著降低了黏膜組織中的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α水平，并促進(jìn)了雙歧桿菌對腸道黏膜表面的定植。最終，接受合生元治療患者的臨床癥狀得到顯著改善，DAI有所降低。然而，也有研究表明將動物雙歧桿菌作用于從CD患者分離衍生出的巨噬細(xì)胞無明顯有益作用[30]。由于益生菌應(yīng)用于CD治療的研究較少，雙歧桿菌及其制劑在CD治療中的應(yīng)用仍需進(jìn)一步驗證。

3 雙歧桿菌及其制劑對IBD作用機(jī)制

3.1 調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)

雙歧桿菌及其制劑可以通過其菌體成分或代謝產(chǎn)物等作用于炎癥信號通路（圖1），調(diào)節(jié)炎癥因子等物質(zhì)的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，起到抗炎作用。

圖1 雙歧桿菌及其制劑調(diào)節(jié)IBD的經(jīng)典信號通路Fig.1 Classic signaling pathways for IBD regulation by Bifidobacterium and its preparations

首先，無論是菌體成分還是其代謝產(chǎn)物均需結(jié)合細(xì)胞膜受體發(fā)揮作用，經(jīng)雙歧桿菌代謝產(chǎn)生的乙酸等SCFAs結(jié)合GPCRs，從而刺激下游炎癥信號通路發(fā)揮抗炎作用[31]。TLRs是主要的結(jié)合通路，TLRs作為模式識別受體可感知和識別病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），如未甲基化的雙鏈DNA、單鏈RNA、肽聚糖、脂蛋白等，從而激活下游信號，需注意TLR2必須與TLR1或TLR6形成異二聚體才能傳輸信號[32]。信號傳輸下游炎癥信號通路主要有3 條：1）NF-κB通路：重要下游炎癥信號通路，經(jīng)刺激后，IκB泛素化降解，使P50/P65二聚體進(jìn)入細(xì)胞核誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄[33]；2）JAK-STAT通路：經(jīng)膜受體識別，隨著JAK的激活，使STAT磷酸化，而后形成磷酸化STAT二聚體入核，誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控炎癥[34]；3）MAPK通路：MAPK家族主要有3 類——JNK、ERK和p38 MAPK，通過3 條級聯(lián)反應(yīng)方式進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，形成AP-1、TCF、ATF2等轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控炎癥因子表達(dá)[35]。大量研究表明，雙歧桿菌及其制劑可以作用于以上通路的關(guān)鍵蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)IBD，表1列出了雙歧桿菌作用以上炎癥信號通路及作用效果的相關(guān)研究。

表1 雙歧桿菌調(diào)節(jié)IBD的經(jīng)典信號通路Table 1 Classical signaling pathways for IBD regulation by Bifidobacterium

3.2 調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)

近年來的研究表明氧化應(yīng)激在IBD的致病機(jī)理中起關(guān)鍵作用，生理條件下氧代謝可產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），在機(jī)體健康情況下，一定含量的ROS對于維持正常的腸道穩(wěn)態(tài)有益，但當(dāng)腸道發(fā)生炎癥時會產(chǎn)生ROS，腸道通透性會隨著ROS積累量的增加而增高，可導(dǎo)致腸道細(xì)菌通過腸壁轉(zhuǎn)位增加，加速炎癥反應(yīng)[48]。另外，IBD以廣泛聚集中性粒細(xì)胞為特征，髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）作為中性粒細(xì)胞原代顆粒的標(biāo)志，通過過氧化物酶循環(huán)等途徑能有效地生成ROS[49]。研究表明服用含有雙歧桿菌的復(fù)合益生菌可以顯著降低MPO含量，降低腸道炎癥小鼠的組織病理學(xué)評分[50]。

Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1）/核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）通路是組織和細(xì)胞中最重要的抗氧化防御系統(tǒng)之一，可調(diào)控抗氧化酶的基因和蛋白表達(dá)，正常狀態(tài)下胞質(zhì)中的Nrf2泛素化后被降解，而在受到刺激后胞質(zhì)中的Nrf2從與Keap1結(jié)合的復(fù)合物中解離下來進(jìn)入核內(nèi)，與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant responsive element，ARE）結(jié)合進(jìn)行谷胱甘肽（glutathione，GSH）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等的轉(zhuǎn)錄[51]（圖2），這些抗氧化蛋白表達(dá)量在IBD患者中均有所降低。Wang Yuanyuan等[52]用植物乳桿菌ZDY2013與兩歧雙歧桿菌WBIN03的單菌懸液及混合菌懸液灌胃經(jīng)三硝基苯磺酸（trinitrobenzenesulfonic acid solution，TNBS）誘導(dǎo)的IBD小鼠，結(jié)果表明益生菌治療組通過激活Nrf2通路，使血清中谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）、CAT和SOD活性提高，結(jié)腸組織中抗氧化酶相關(guān)因子SOD1、GPX2、CAT相對表達(dá)量增加，從而通過抗氧化途徑使小鼠結(jié)腸炎癥有所緩解。

圖2 不同狀態(tài)下的Keap1/Nrf2通路Fig.2 Keap1/Nrf2 pathway in different states

雙歧桿菌的代謝產(chǎn)物也可通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)緩解IBD，長雙歧桿菌CCFM752上清液可以增強(qiáng)A7R5細(xì)胞內(nèi)CAT活性，降低還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶活性，從而表現(xiàn)出抗氧化的特性[53]。嬰兒雙歧桿菌代謝產(chǎn)生的吲哚乳酸（indole-3-lactic acid，ILA）可以與芳香烴受體（aryl hydrogen receptor，AhR）結(jié)合刺激Nrf2通路，增加靶基因GPX2、SOD2和NAD(P)H脫氫酶的mRNA表達(dá)，通過調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)保護(hù)腸道細(xì)胞[54]。齒雙歧桿菌可以分泌γ-谷氨酰半胱氨酸，該半胱氨酸可轉(zhuǎn)化為抗氧化劑并抑制氧化應(yīng)激。含有γ-谷氨酰半胱氨酸的細(xì)菌分泌產(chǎn)物以及純化的γ-谷氨酰半胱氨酸進(jìn)入細(xì)胞并上調(diào)GSH水平，從而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的ROS，并使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激表型最小化，調(diào)節(jié)未折疊蛋白反應(yīng)，從而使黏液蛋白的表達(dá)量增多，調(diào)節(jié)IBD反應(yīng)[55]。

3.3 恢復(fù)腸黏膜屏障

腸道黏膜屏障是宿主抵御致病菌和感染的第一道防線，在IBD愈合以及恢復(fù)過程中維持腸道黏膜屏障完整性以及免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[56]。腸黏膜屏障由微生物屏障、機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障4 個部分組成[57]，這4 個部分在腸道內(nèi)共同作用（圖3）。

圖3 腸黏膜屏障Fig.3 Intestinal mucosal barrier

微生物屏障是指寄生在腸道的微生物與宿主形成的復(fù)雜腸道生態(tài)系統(tǒng)，自出生開始，宿主腸道微生物逐漸具備復(fù)雜的消化和代謝功能，形成多樣的以及穩(wěn)定的常駐菌群，該菌群通過彼此間共生、拮抗、與致病菌競爭結(jié)合位點以及直接或間接參與抗菌物質(zhì)的合成，進(jìn)而展現(xiàn)出抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用，對腸道內(nèi)維持穩(wěn)態(tài)環(huán)境至關(guān)重要[58]。研究表明，IBD患者腸道菌群穩(wěn)態(tài)失衡，與健康受試者相比，雙歧桿菌屬、真桿菌屬和柔嫩梭菌屬等腸道有益菌屬含量顯著降低，而擬桿菌屬等潛在致病菌屬含量顯著增加[59]。研究表明，改善腸道微生物組成已成為治療IBD的重要輔助手段[49]。Yang Bo等[60]利用短雙歧桿菌CCFM683灌胃DSS誘導(dǎo)的IBD模型鼠后對其糞便菌群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在科水平上雙歧桿菌可以抑制DSS導(dǎo)致的紫單胞菌科和脫硫弧菌科相對豐度增加，同時增加消化鏈球菌科的豐度，進(jìn)而恢復(fù)腸道菌群平衡。同樣地，馬巖等[61]給DSS誘導(dǎo)的IBD模型小鼠灌胃動物雙歧桿菌乳亞種XLTG11后對結(jié)腸內(nèi)容物進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在門水平上，雙歧桿菌組抑制了DSS導(dǎo)致的變形菌門豐度升高，且增加了厚壁菌門和放線菌門的豐度。在屬水平上，雙歧桿菌組增加了雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、糞桿菌屬等有益菌屬的豐度，降低了幽門螺旋桿菌屬等潛在治病菌屬的豐度。

化學(xué)屏障包括腸腔內(nèi)水分、消化液以及腸黏液層，其中起重要保護(hù)作用的為腸黏液層，它位于腸黏膜屏障的最外層，可以起到保護(hù)腸黏膜不受有害微生物破壞及酸堿侵蝕的作用，從而為上皮細(xì)胞提供一個完整的防御，以抵御有害物質(zhì)和病原體，它是宿主與腸道內(nèi)環(huán)境接觸的第一道屏障[62]。Kiu等[63]將短雙歧桿菌UCC2003灌胃小鼠2 周后，對小鼠腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，編碼黏蛋白的編碼基因Muc2、Muc6、Muc5b和Muc4表達(dá)量均顯著上調(diào)，證明了雙歧桿菌對化學(xué)屏障的保護(hù)作用。同時，Caballero-Franco等[64]研究發(fā)現(xiàn)，Wistar大鼠口服補(bǔ)充VSL#3對黏液結(jié)構(gòu)有影響，并刺激Muc2基因的表達(dá)，但對Muc1和Muc3表達(dá)量的影響很??；另外，非黏液糖蛋白的分泌量也增加，這導(dǎo)致腸道黏液含量增加了60%，提高了腸道屏障的通透性，從而起到保護(hù)腸道的作用。

機(jī)械屏障主要由腸上皮細(xì)胞與相鄰細(xì)胞間的連接構(gòu)成完整的腸上皮結(jié)構(gòu)，其連接方式包括緊密連接、縫隙連接、黏附連接及橋粒連接等，而圍繞在上皮頂側(cè)的緊密連接則是維持腸黏膜機(jī)械屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是機(jī)械屏障最重要的結(jié)構(gòu)[65]。短雙歧桿菌UCC2003灌胃后的小鼠與空白對照組小鼠相比，其轉(zhuǎn)錄組中與機(jī)械屏障功能相關(guān)的關(guān)鍵基因表達(dá)量顯著上調(diào)，其中包括編碼閉鎖小帶蛋白1（zonula occludens 1，ZO-1）蛋白的Tjp1基因[63]。Chen Xiaohong等[66]給TNBS誘導(dǎo)的IBD模型鼠灌胃長雙歧桿菌HB5502后發(fā)現(xiàn)，小鼠結(jié)腸中緊密連接蛋白ZO-1、閉合蛋白（Occludin）-1和密封蛋白（Claudin）-1的表達(dá)量顯著升高。Ling Xiang等[67]的實驗同樣證明，雙歧桿菌作用于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞可上調(diào)Occludin、Claudin-3和ZO-1這些緊密連接蛋白的表達(dá)。

免疫屏障主要由腸相關(guān)淋巴組織（gut-associated lymphatic tissue，GALT）和分泌型免疫球蛋白（secretory immunoglobulin A，SIgA）以及相應(yīng)的免疫反應(yīng)構(gòu)成，腸道免疫屏障是腸道免疫穩(wěn)態(tài)的重要保障[68]。Shang Jiacui等[7]將兩歧雙歧桿菌H3-R2作用于免疫低下小鼠，實驗結(jié)果表明此菌株可以促進(jìn)強(qiáng)SIgA的產(chǎn)生，促進(jìn)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，具有免疫調(diào)節(jié)作用。同時，Treg在免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，Zhou Linyan等[69]將嬰兒雙歧桿菌作用于DSS誘導(dǎo)的IBD小鼠后，小鼠結(jié)腸組織中叉頭框蛋白P3（forkhead box P3，F(xiàn)oxp3）表達(dá)量升高，另外細(xì)胞因子IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）表達(dá)量也升高，F(xiàn)oxp3表達(dá)量隨菌液濃度的增高而呈現(xiàn)明顯升高趨勢，由于Foxp3是控制Treg發(fā)育和功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，因此證明此嬰兒雙歧桿菌可通過促進(jìn)Treg細(xì)胞的增殖參與腸道內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)而在IBD的治療中發(fā)揮作用。

4 結(jié) 語

雙歧桿菌作為腸道重要的有益微生物之一，已用于IBD的治療，主要通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激以及保護(hù)腸黏膜屏障作用3 種不同機(jī)制發(fā)揮功效。通過以上綜述發(fā)現(xiàn)，該方面研究存在以下特點：首先，在UC以及CD治療中，因二者發(fā)病機(jī)制不一致，雙歧桿菌的治療效果也不相同；其次，目前雙歧桿菌作用于腸道炎癥的研究多為短療程；最后，單株或混合菌株的治療效果有顯著差異，雙歧桿菌的不同種甚至是亞種都有不同的作用機(jī)制。因此，繼續(xù)深入探索雙歧桿菌不同菌株在UC以及CD發(fā)生發(fā)展中的作用，需要注意其作為長期治療手段的安全性，同時目前研究大多集中于菌體直接作用，深入挖掘起作用的菌體成分及代謝產(chǎn)物能否靶向抑制炎癥信號通路的關(guān)鍵蛋白對今后的臨床治療意義重大。