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        擴(kuò)增型和非擴(kuò)增型CRISPR/Cas系統(tǒng)在食源性致病菌快速檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用的研究進(jìn)展

        2023-04-06 03:02:54徐文星邵艷娜吳清平張菊梅
        食品科學(xué) 2023年5期
        關(guān)鍵詞:食源性靶標(biāo)致病菌

        徐文星,邵艷娜,吳清平,王 涓,張菊梅,丁 郁*

        (1.廣東省科學(xué)院微生物研究所,華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省微生物安全與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物組學(xué)與精準(zhǔn)應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510070;2.暨南大學(xué)理工學(xué)院,廣東 廣州 510632;3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東 廣州 510642)

        食源性致病菌是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致食品安全問題的重要因素[1],其引發(fā)的食品安全事件日益增多,可能造成嚴(yán)重的健康問題和經(jīng)濟(jì)損失,目前常見的食源性致病菌包括大腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌等[2-4],它們通常引起腹痛、腹瀉以及嘔吐等癥狀,嚴(yán)重時(shí)還會(huì)造成死亡。世界衛(wèi)生組織調(diào)查發(fā)現(xiàn),在全球范圍內(nèi)每年約有6億 例食源性疾病發(fā)生,其中有42萬 人因此死亡[5-6]。2011年5—7月,歐洲暴發(fā)了由腸出血性大腸桿菌O104:H4污染豆芽菜引起的中毒感染[7-9]。2015—2018年,在奧地利、丹麥、芬蘭、英國(guó)瑞典等國(guó)家出現(xiàn)單核細(xì)胞增生李斯特菌污染冷凍玉米,由此引起了持續(xù)性的食源性疾病暴發(fā)[10-11]。2016—2020年,歐洲18 個(gè)國(guó)家暴發(fā)了由腸炎沙門氏菌引起的食源性疾病,這是有史以來歐洲報(bào)道的規(guī)模最大的一次食源性疾病案例[1]。因此,盡早的發(fā)現(xiàn)食源性致病菌是防止食源性疾病暴發(fā)的有效手段?;诩?xì)胞培養(yǎng)的方法雖然一直以來被認(rèn)為是檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),但其分析檢測(cè)耗時(shí)久(有時(shí)長(zhǎng)達(dá)7 d),并且操作過程繁瑣,難以滿足目前的快速檢測(cè)需求。此外,基于核酸檢測(cè)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)以及基于免疫反應(yīng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)也是較常用的細(xì)菌檢測(cè)方式(圖1)。雖然它們所需檢測(cè)時(shí)間短于傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng),但其檢測(cè)成本較高,仍難以實(shí)現(xiàn)高效、快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。因此,開發(fā)新型快速高效檢測(cè)食源性致病菌的技術(shù)是目前亟待解決的重要問題。成簇的間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其相關(guān)蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)組成的CRISPR/Cas系統(tǒng)可以通過核酸“指導(dǎo)”的堿基配對(duì)方式介導(dǎo)核酸酶對(duì)靶標(biāo)的識(shí)別[12],從而實(shí)現(xiàn)對(duì)外來核酸的特異性切割,因此,可以通過人工合成向?qū)蛄袑?shí)現(xiàn)對(duì)不同目標(biāo)物的檢測(cè)。

        圖1 常規(guī)免疫檢測(cè)及核酸檢測(cè)原理Fig.1 Principles of routine immunoassay and nucleic acid detection

        CRISPR/Cas系統(tǒng)是廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中的一類適應(yīng)性免疫系統(tǒng),其免疫反應(yīng)主要由3 個(gè)階段組成:適應(yīng)、表達(dá)和干擾。在適應(yīng)過程中,外源核酸序列被整合到CRISPR的間隔區(qū)域。在表達(dá)和干擾階段,CRISPR基因座轉(zhuǎn)錄釋放CRISPR RNA(crRNA)以引導(dǎo)Cas蛋白識(shí)別和切割降解外源核酸[13-14]。CRISPR/Cas系統(tǒng)主要分為兩類[15]:1)具有多亞基效應(yīng)器,每種蛋白發(fā)揮單一功能[16];2)由不同的遺傳元件編碼的核酸酶[17],如常用于致病菌檢測(cè)的Cas9、Cas12、Cas13[18]。其中,Cas9蛋白具有類似HVH和RuvC兩個(gè)核酸酶的結(jié)構(gòu)域。當(dāng)crRNA與反式激活crRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)通過堿基互補(bǔ)配對(duì)形成二元復(fù)合物小向?qū)NA(small guide RNA,sgRNA)時(shí),可以識(shí)別含有NGG(其中N為任意核苷酸)、大約20 個(gè)核苷酸的前間隔序列臨近基序(protospacer adjacent motif,PAM)。通過堿基配對(duì)識(shí)別目標(biāo)雙鏈DNA,引導(dǎo)Cas9核酸酶對(duì)目標(biāo)雙鏈DNA的切割。與Cas9不同的是,dCas9由于HVH、RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域失活而不具有切割活性,但其sgRNA仍然對(duì)于目標(biāo)DNA具有較強(qiáng)的特異性結(jié)合活性。Cas12a具有單個(gè)的RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域,crRNA對(duì)富含T的PAM序列靶標(biāo)雙鏈DNA進(jìn)行特異性識(shí)別和結(jié)合,激活Cas12a的反式切割活性,從而對(duì)單鏈DNA進(jìn)行非特異性切割。與Cas12a類似,Cas13a也是在crRNA與靶標(biāo)單鏈RNA結(jié)合后激活其對(duì)核酸的非特異性反式切割活性,但其具有兩個(gè)HEPN結(jié)構(gòu)域,識(shí)別的原間隔子側(cè)翼位點(diǎn)的3'-端核苷酸不能為鳥嘌呤。目前CRISPR/Cas系統(tǒng)由于其檢測(cè)范圍廣、反應(yīng)時(shí)間短、材料成本低以及靈敏度高等優(yōu)勢(shì)已被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測(cè)中。Zhang Ting等[19]通過CRISPR/Cas13a系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌等幾種活的致病菌的檢測(cè),檢出限可達(dá)10 CFU?;贑RISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測(cè)一般需要通過核酸提取、核酸擴(kuò)增、信號(hào)生成、信號(hào)輸出4 個(gè)步驟[20]。如圖2所示,通過PCR或等溫?cái)U(kuò)增等技術(shù)對(duì)靶標(biāo)的擴(kuò)增可以有效提高檢測(cè)靈敏度,但是這一過程不僅需要耗費(fèi)大量的時(shí)間,而且存在氣溶膠污染的風(fēng)險(xiǎn)[21]。因此,開發(fā)免擴(kuò)增的CRISPR檢測(cè)系統(tǒng)受到研究者的廣泛青睞。Sha Yong等[22]開發(fā)了CRISPR/Cas級(jí)聯(lián)信號(hào)放大系統(tǒng),無需核酸擴(kuò)增即可達(dá)到1.33×10-15mol/L的檢出限。本實(shí)驗(yàn)室在CRISPR/Cas系統(tǒng)快速檢測(cè)食源性致病菌領(lǐng)域積累了較豐富的研究成果,目前基于CRISPR/Cas12a技術(shù)已實(shí)現(xiàn)單核細(xì)胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌核酸檢測(cè)平臺(tái)的搭建[23-26],通過合理設(shè)計(jì)crRNA實(shí)現(xiàn)不同Cas系統(tǒng)在多種病原菌核酸檢測(cè)中的應(yīng)用[24]?;谝陨涎芯砍晒约按罅课墨I(xiàn),本文介紹基于核酸擴(kuò)增和免核酸擴(kuò)增的CRISPR/Cas系統(tǒng)在食源性致病菌檢測(cè)中的研究進(jìn)展,并討論它們的優(yōu)勢(shì)、局限性以及未來的發(fā)展前景,以期為CRISPR/Cas系統(tǒng)在食源性致病菌檢測(cè)領(lǐng)域的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

        圖2 不同類型CRISPR/Cas檢測(cè)食源性致病菌的工作流程Fig.2 Workflow of different CRISPR/Cas systems for the detection of foodborne pathogens

        1 基于恒溫?cái)U(kuò)增的CRISPR/Cas核酸檢測(cè)技術(shù)

        為了獲得更高的檢測(cè)靈敏度,通常將核酸擴(kuò)增技術(shù)與CRISPR/Cas系統(tǒng)聯(lián)用[27-28]。常規(guī)的PCR技術(shù)對(duì)溫度控制有較高的要求,所需儀器設(shè)備價(jià)格昂貴,而目前發(fā)展迅速的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù),不需要加熱循環(huán)且反應(yīng)時(shí)間短,成為傳統(tǒng)PCR良好的替代技術(shù)[29]。如表1所示,常用于CRISPR/Cas系統(tǒng)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括LAMP[30]、RPA[31]、RCA[32]以及NASBA[33-34]等。LAMP是一種基于BstDNA聚合酶進(jìn)行大片段循環(huán)鏈置換DNA合成的技術(shù),它可以在恒溫條件下完成擴(kuò)增反應(yīng)[35]。Li Linxian等[36]將CRISPR/Cas12b與LAMP結(jié)合,開發(fā)了一種低成本多用途的高效快速核酸檢測(cè)系統(tǒng)(one-hour low-cost multipurpose highly efficient system,HOLMES),實(shí)現(xiàn)了一步法對(duì)靶標(biāo)核酸進(jìn)行定量分析,其檢測(cè)原理如圖3所示。與LAMP相比,RPA技術(shù)只需一對(duì)引物即可完成擴(kuò)增,SHINE一步反應(yīng)系統(tǒng)(streamlined highlighting of infections to navigate epidemics)[37]基于RPA擴(kuò)增和CRISPR/Cas13檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)SARS-Cov-2的測(cè)定,其中將擴(kuò)增和檢測(cè)簡(jiǎn)化為一步反應(yīng),縮短了檢測(cè)時(shí)間,并且可以達(dá)到90%的靈敏度和100%的特異性。該系統(tǒng)具有紙基比色和熒光兩種信號(hào)讀取方式,熒光信號(hào)可以通過手機(jī)應(yīng)用程序完成讀取。Wang Ruixuan等[38]建立了RCA輔助CRISPR/Cas9切割(RCA-assisted CRISPR/Cas9 Cleavage,RACE)核酸檢測(cè)平臺(tái),實(shí)現(xiàn)了對(duì)外膜囊泡中microRNA的高度特異性檢測(cè)及單堿基分辨,并且可以同時(shí)定量幾個(gè)外膜囊泡衍生的miRNA。NASBA是一種RNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),可以在41 ℃下完成反應(yīng),無需熱循環(huán)儀器[39],當(dāng)NASBA與CRISPR/Cas結(jié)合使用時(shí),可以實(shí)現(xiàn)10-15mol/L寨卡病毒RNA的檢測(cè)[40]。

        表1 幾種基于等溫?cái)U(kuò)增的CRISPR/Cas體系Table 1 Several CRISPR/Cas systems based on isothermal amplification

        圖3 HOLMESv2的工作原理及應(yīng)用場(chǎng)景[36]Fig.3 Working principle and application scenarios of HOLMESv2[36]

        CRISPR/Cas與等溫?cái)U(kuò)增聯(lián)用技術(shù)也廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測(cè)中。例如研究人員將CRISPR/Cas9與等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)相結(jié)合,建立CAS-EXPAR平臺(tái)[41]。在該系統(tǒng)中,結(jié)合了Cas9對(duì)單向?qū)NA(sgRNA)的特異性切割活性和指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(exponential amplification reaction,EXPAR)快速擴(kuò)增的優(yōu)勢(shì)。以Cas切割DNA片段為引物,無需外源添加引物即實(shí)現(xiàn)了對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的特異性檢測(cè),靶標(biāo)核酸物質(zhì)檢出限可達(dá)8.2×10-19mol/L。Zhou Baoqing等[26]利用CRISPR/Cas12a的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)分析成功實(shí)現(xiàn)了金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)。在該項(xiàng)研究中,基于CRISPR/Cas12a的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置與熒光量子點(diǎn)QD相結(jié)合,當(dāng)靶標(biāo)DNA存在時(shí),通過重組酶介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(recombinase aid amplification,RAA)獲得特定的dsDNA產(chǎn)物,并激活Cas/crRNA的反式裂解活性。被降解的探針未能與檢測(cè)線上的捕獲探針相結(jié)合從而導(dǎo)致沒有信號(hào)積累,而質(zhì)控線具有明顯的熒光信號(hào)。此外,CRISPR/Cas12a結(jié)合RPA可以高精度的完成炭疽芽孢桿菌的檢測(cè)以及沙門氏菌毒力基因和耐藥基因的雙重檢測(cè)[42-43]。CRISPR/Cas14a1與不對(duì)稱核酸擴(kuò)增相結(jié)合,可以實(shí)現(xiàn)牛奶中多種致病菌的檢測(cè)[44]。

        目前,CRISPR/Cas系統(tǒng)與核酸擴(kuò)增聯(lián)用技術(shù)在食源性致病菌中的應(yīng)用研究中逐漸增加,這些研究建立了多種食品快速檢測(cè)平臺(tái),實(shí)現(xiàn)了食源性致病菌的精準(zhǔn)、快速及高效檢測(cè)。相對(duì)于傳統(tǒng)的PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),在核酸擴(kuò)增的后端加入高效的檢測(cè)工具——Cas蛋白,在很大程度上提升了檢測(cè)的靈敏度和特異性。CRISPR/Cas系統(tǒng)與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)聯(lián)用建立的一系列檢測(cè)平臺(tái)有效地克服了傳統(tǒng)PCR需要昂貴的熱循環(huán)儀器等缺陷,但將核酸擴(kuò)增這一步驟引入CRISPR/Cas系統(tǒng)中增加了檢測(cè)的復(fù)雜度,同時(shí)降低了CRISPR體系的優(yōu)勢(shì),而僅體現(xiàn)出它在特異性方面的優(yōu)勢(shì)。此外,部分基于擴(kuò)增的CRISPR/Cas檢測(cè)平臺(tái)中擴(kuò)增和檢測(cè)是割裂的兩部分,容易發(fā)生污染而造成假陽性,影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此,開發(fā)免核酸擴(kuò)增的CRISPR/Cas系統(tǒng)是目前解決這一問題的有效途徑。

        2 免擴(kuò)增的CRISPR/Cas核酸檢測(cè)技術(shù)

        目前基于免核酸擴(kuò)增的CRISPR/Cas體系主要分為以下3 類[21](表2):1)微容量的CRISPR/Cas系統(tǒng)。通過減小反應(yīng)體系體積和核酸擴(kuò)增來增加靶標(biāo)濃度,反應(yīng)體系中的靶標(biāo)濃度是影響Cas蛋白切割活性和效率的重要因素;2)生物傳感器。將Cas蛋白的反式切割活性與電化學(xué)生物傳感器串聯(lián)使用,傳感器收集微弱的信號(hào),將其進(jìn)行放大輸出,從而增加檢測(cè)體系的靈敏度;3)Cas介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)通過對(duì)微弱信號(hào)分子的層級(jí)放大以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的高靈敏度檢測(cè)。目前基于免核酸擴(kuò)增的CRISPR/Cas技術(shù)大多用于新型冠狀病毒SARS-Cov-2等傳播性病毒的檢測(cè),針對(duì)食源性致病菌檢測(cè)的應(yīng)用較少,其在食品快速檢測(cè)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

        表2 幾種免擴(kuò)增CRISPR/Cas體系Table 2 Several amplification-free CRISPR/Cas systems

        2.1 微室CRISPR/Cas系統(tǒng)

        當(dāng)靶標(biāo)達(dá)到一定濃度時(shí)才可以被Cas蛋白識(shí)別并激活Cas蛋白的切割活性,例如Cas12a在存在10-11mol/L的DNA時(shí)才具有識(shí)別和切割能力[51]。Cas13a需要大約5×10-13mol/L的靶標(biāo)RNA存在時(shí)才可以識(shí)別和切割[52]。CRISPR/Cas體系與核酸擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合就是為了增加靶標(biāo)物質(zhì)的濃度,從而有效地被Cas蛋白識(shí)別并切割,但是擴(kuò)增技術(shù)的引入無疑增加了污染風(fēng)險(xiǎn)并延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間。為克服以上缺陷,Tian Tian等[53]建立了一種基于Cas13a的RNA檢測(cè)系統(tǒng)(圖4)。目標(biāo)RNA觸發(fā)的Cas13a復(fù)合物被限制在細(xì)胞樣大小的反應(yīng)器中,從而增加目標(biāo)物的濃度。與微升體積的批量反應(yīng)條件相比,所創(chuàng)建皮升體積的Cas13a系統(tǒng)檢測(cè)靈敏度提高了104倍以上,并且能夠?qū)崿F(xiàn)靶標(biāo)RNA的絕對(duì)定量。此外研究人員將CRISPR/Cas13a核酸檢測(cè)系統(tǒng)與微室技術(shù)相結(jié)合,減小反應(yīng)體系的體積從而增大靶標(biāo)濃度,建立了能夠在單分子水平上快速檢測(cè)ssRNA的SATORI(CRISPR-based amplification-free digital RNA detection)平臺(tái),能夠快速靈敏地檢測(cè)SARS-Cov-2的全基因組RNA,檢出限可達(dá)5.7×10-15mol/L(3.4×106拷貝/mL),并可在5 min內(nèi)完成反應(yīng)[45]。與此同時(shí),CRISPR/Cas12a反應(yīng)體系與微室系統(tǒng)相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了單分子DNA水平的檢測(cè)[46]。因此,可以看出CRISPR/Cas系統(tǒng)與微室相結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同類型核酸的無擴(kuò)增檢測(cè),一些基于微室CRISPR/Cas系統(tǒng)不僅無需核酸擴(kuò)增,而且省略了核酸提取步驟,顯著節(jié)約了實(shí)驗(yàn)材料及時(shí)間等成本,但目前這些研究大多局限于病毒的檢測(cè),可能由于食品基質(zhì)成分復(fù)雜,這項(xiàng)技術(shù)還未廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測(cè)中。

        圖4 基于CRISPR/Cas13a的微室RNA檢測(cè)系統(tǒng)[53]Fig.4 CRISPR/Cas13a-based microchamber RNA detection system[53]

        2.2 CRISPR/Cas與生物傳感器聯(lián)用

        Cas蛋白的切割活性由目標(biāo)核酸物質(zhì)激活[54]。當(dāng)目標(biāo)核酸物質(zhì)濃度較低時(shí),Cas蛋白具有較弱的切割活性,此時(shí)輸出的信號(hào)也是微弱的。CRISPR/Cas通常通過液相或半固相完成檢測(cè),然后利用熒光讀數(shù)器對(duì)其產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。考慮到大多數(shù)靶核酸初始濃度較低,導(dǎo)致無擴(kuò)增的CRISPR/Cas系統(tǒng)可能產(chǎn)生較弱的反式切割活性,因此需要更靈敏的信號(hào)檢測(cè)方法來檢測(cè)微弱的輸出信號(hào)。生物傳感器具有靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、儀器便攜等優(yōu)勢(shì),與CRISPR/Cas系統(tǒng)聯(lián)用顯示出較大的優(yōu)勢(shì)[54-56]。

        電化學(xué)生物傳感器將物理和生物技術(shù)相結(jié)合,兼具物理學(xué)的高靈敏度、高準(zhǔn)確性和生物學(xué)的高特異性[57],因而被廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)領(lǐng)域。但電化學(xué)生物傳感器同時(shí)也存在潛在毒性、化學(xué)穩(wěn)定性較差等缺陷,與CRISPR/Cas技術(shù)的結(jié)合則可以有效地避免這些劣勢(shì)。最近,Li Ziyue等[58]開發(fā)的一種簡(jiǎn)單、多功能、電場(chǎng)增強(qiáng)的電化學(xué)生物傳感器,可用于檢測(cè)溶液中的DNA靶標(biāo)。通過脈沖電場(chǎng)富集電極表面的核酸,利用化學(xué)寡核苷酸探針和Cas蛋白之間對(duì)帶負(fù)電工作電極的擴(kuò)散性差異,能夠?qū)崿F(xiàn)簡(jiǎn)單而靈敏的電化學(xué)檢測(cè),對(duì)HPV-16病毒的檢測(cè)靈敏度為10-12mol/L?;贑as12a與亞甲基藍(lán)共軛的金納米粒子的電化學(xué)生物傳感器已被用于直接檢測(cè)許多其他病原體,例如登革熱病毒RNA檢出限為10-13mol/L[59]。通過將電化學(xué)生物傳感器與由Cas13a和催化發(fā)夾DNA電路組成的雙信號(hào)放大策略相結(jié)合,目標(biāo)RNA的檢出限可達(dá)5×10-17mol/L[47]。Cas12a與銀金屬化、方波伏安法結(jié)合使用時(shí)可以檢測(cè)到3.5×10-15mol/L的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌RNA[48]。

        此外,CRISPR/Cas系統(tǒng)與新型納米生物傳感器的聯(lián)用也是當(dāng)前研究的一大熱點(diǎn)[60]。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,F(xiàn)RET)傳感器是基于一定距離范圍內(nèi)供體熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜和受體熒光基團(tuán)的激發(fā)光譜重疊而產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[61]。結(jié)合CRISPR/Cas的反式切割活性,可以有效調(diào)節(jié)FRET中兩熒光基團(tuán)之間的距離從而實(shí)現(xiàn)熒光的增強(qiáng)或猝滅。CRISPR/Cas與Cu納米粒子結(jié)合實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA的高靈敏度檢測(cè)[62]。研究人員以金納米粒子表面修飾熒光標(biāo)記的DNA鏈形成的球形核酸作為熒光報(bào)告分子,當(dāng)存在目標(biāo)核酸時(shí),激活Cas12a對(duì)熒光信號(hào)分子的反式切割活性,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)核酸物質(zhì)的靈敏檢測(cè),檢出限可達(dá)10-14mol/L[63]。固態(tài)納米孔傳感器在檢測(cè)單分子方面也顯示出巨大潛力,是信號(hào)輸出放大的另一種方法。研究人員將Cas12a的高特異性和玻璃納米孔的高靈敏度有效結(jié)合,無需預(yù)擴(kuò)增即可檢測(cè)高于10 nmol/L的目標(biāo)核酸[64]。

        除電化學(xué)、納米材料等生物傳感器外,CRISPR/Cas還與其他多種生物傳感器聯(lián)合使用。例如,將CRISPR/Cas9蛋白與石墨烯相結(jié)合也可以完成對(duì)核酸的檢測(cè),這種生物傳感器被稱為CRISPR-Chip,它利用催化失活的Cas9蛋白的基因靶向能力與特定的sgRNA復(fù)合并固定在晶體管上,從而產(chǎn)生一種無標(biāo)記核酸檢測(cè)裝置,其輸出信號(hào)可以用一個(gè)簡(jiǎn)單的手持閱讀器測(cè)量,并可以實(shí)現(xiàn)15 min內(nèi)完成檢測(cè),靈敏度為1.7×10-15mol/L[49]。使用DFHBI-1T染料標(biāo)記的RNA發(fā)光適配體,當(dāng)目標(biāo)RNA存在時(shí),激活Cas13a的反式切割活性,使報(bào)告分子發(fā)生熒光猝滅[19]。由于RNA在體外易降解的特性,該體系可以實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)菌的檢測(cè),且能夠?qū)崿F(xiàn)在真實(shí)食品樣品中的檢測(cè),其檢出限為10 CFU。

        2.3 Cas介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)

        級(jí)聯(lián)放大是病毒、微生物檢測(cè)中常用的一種信號(hào)放大策略,因此也可用于CRISPR/Cas系統(tǒng)中。在目標(biāo)核酸物質(zhì)含量極低的情況下,引入級(jí)聯(lián)放大策略,也可有效地提高檢測(cè)靈敏度。研究人員將Cas13a和Cas14a結(jié)合在一起開發(fā)了casCRISPR系統(tǒng),其中Cas13a反式切割的產(chǎn)物作為Cas14a的激活劑,并進(jìn)一步觸發(fā)Cas14a的反式切割活性,放大輸出信號(hào)。casCRISPR系統(tǒng)的檢出限達(dá)到了1.33×10-15mol/L,比單獨(dú)使用Cas13a的靈敏度高1 000 倍[22]。Liu等[50]建立了通過將Cas13a和多亞基效應(yīng)器Csm6串聯(lián),實(shí)現(xiàn)了在20 min內(nèi)對(duì)每微升大約30 個(gè)RNA分子的有效檢測(cè)。

        除了以上方法外,還有很多其他信號(hào)放大策略可以與CRISPR/Cas系統(tǒng)串聯(lián)使用。例如,借助金屬增強(qiáng)熒光原理,將報(bào)告基因被切斷后釋放的熒光信號(hào)通過金納米粒子二次放大,實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)核酸的高靈敏檢測(cè)[65]。借助電化學(xué)發(fā)光背景信號(hào)低的優(yōu)點(diǎn)建立的免擴(kuò)增CRISPR-Dx,可以實(shí)現(xiàn)10-15mol/L靶標(biāo)核酸的檢測(cè)[66]。通過將由酶催化引起顏色變化的辣根過氧化物酶/3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺反應(yīng)和CRISPR/dCas9對(duì)病毒裂解物中RNA的特異性識(shí)別相結(jié)合,建立了一種基于比色分析的CRISPR病毒檢測(cè)平臺(tái)[67]。

        3 結(jié) 語

        針對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)的早期研究關(guān)注其作用機(jī)制及在基因編輯中的應(yīng)用。隨著研究的深入,CRISPR/Cas系統(tǒng)的特異性識(shí)別結(jié)合能力與核酸切割能力逐漸被深刻認(rèn)識(shí),目前CRISPR/Cas已成為一種有效的核酸檢測(cè)工具,迄今為止,已經(jīng)利用Cas9、Cas12和Cas13蛋白的切割活性以及Cas12和Cas13蛋白的反式切割活性開發(fā)了多種基于CRISPR/Cas的生物傳感器[49]。伴隨CRISPR技術(shù)的成熟,研究人員通過結(jié)合納米技術(shù)和各種生物傳感器技術(shù),實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)信號(hào)的放大,極大地提高了檢測(cè)的靈敏度,目前已將各種信號(hào)放大策略如微室系統(tǒng)、電化學(xué)生物傳感器、級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)等技術(shù)手段結(jié)合到CRISPR/Cas系統(tǒng)中,不僅使檢測(cè)靈敏度和特異性明顯提高,而且檢測(cè)對(duì)象也從核酸擴(kuò)展到離子、小分子、蛋白質(zhì)、酶、外泌體、細(xì)菌、病毒等[68-69]。幾種較為典型的擴(kuò)增型和非擴(kuò)增型CRISPR/Cas系統(tǒng)的特點(diǎn)如表3所示。

        表3 擴(kuò)增型和非擴(kuò)增型CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)比Table 3 Comparison of amplified and non-amplified CRISPR/Cas systems

        雖然目前CRISPR/Cas系統(tǒng)在快速檢測(cè)領(lǐng)域取得了較為顯著的成就,但其發(fā)展過程中還存在一些困難,需要進(jìn)一步探索。目前大多數(shù)的CRISPR/Cas檢測(cè)技術(shù)仍集中在核酸檢測(cè)領(lǐng)域,非核酸靶點(diǎn)的檢測(cè)還處于起步階段,因此對(duì)于非核酸靶點(diǎn)的檢測(cè)仍有待深入。此外,Cas蛋白的基本性質(zhì)也有待進(jìn)一步研究。近年來的研究表明,通過引入輔因子或修飾向?qū)NA可以提高Cas蛋白的切割活性,也可能為基于CRISPR/Cas的生物傳感系統(tǒng)的設(shè)計(jì)提供新思路[69-71]。隨著新特性的不斷發(fā)現(xiàn),現(xiàn)有傳感系統(tǒng)的性能會(huì)進(jìn)一步提高,甚至開發(fā)出一些新的生物傳感器。此外,大多數(shù)的基于CRISPR/Cas的生物傳感器都面臨著高背景信號(hào)的挑戰(zhàn)[72-73],尤其是在使用相對(duì)較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間時(shí),降低背景值也是亟待解決的關(guān)鍵問題之一。

        目前較為先進(jìn)的CRSIPR/Cas檢測(cè)體系大多用于病毒的快速高效檢測(cè),在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用較少且多為基礎(chǔ)的CRISPR/Cas平臺(tái),大多數(shù)檢測(cè)方法需要核酸提取及擴(kuò)增的步驟,操作復(fù)雜甚至?xí)绊憴z測(cè)的準(zhǔn)確性。此外,目前利用CRISPR/Cas系統(tǒng)檢測(cè)食源性致病菌多數(shù)針對(duì)單一病原菌,而實(shí)現(xiàn)多重病原菌檢測(cè)可有效提高效率。

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