任俊和，曾 平，陳思睿，易蘭花,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.香港中文大學(xué)藥劑學(xué)院，香港 999077；3.重慶市開州區(qū)疾病預(yù)防控制中心，重慶 405499）

果汁因富含糖類、VC、果膠及多酚等營(yíng)養(yǎng)成分而受到消費(fèi)者喜愛，隨著人們生活水平的提高，其加工量和消費(fèi)量也在不斷增長(zhǎng)。由于酸度較高，通常認(rèn)為果汁不是食源性病菌生存的適宜載體。然而，研究表明，某些病原菌可以通過適應(yīng)低pH值來維持生存[1]。美國(guó)疾病預(yù)防控制中心的報(bào)告指出，已暴發(fā)多次與飲用果汁有關(guān)的食源性疾病，其中涉及產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌、沙門氏菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（以下簡(jiǎn)稱單增李斯特菌）[2]。美國(guó)國(guó)家食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)于1977年將大腸桿菌O157:H7和單增李斯特菌確定為影響果汁食用安全的主要病原菌[3]。其中，由于可以在酸性條件和常規(guī)冷藏溫度（4 ℃）下生長(zhǎng)[4]，單增李斯特菌被認(rèn)為是影響果汁食用安全的主要風(fēng)險(xiǎn)因素，會(huì)提高人畜患腦膜炎、心肌炎、敗血癥等疾病的概率，且在免疫功能低下的人群中致死率相對(duì)較高（20%～30%）[5]。因此，抑制果汁中的病原微生物，尤其是單增李斯特菌，是保障果汁食品安全的迫切需要。

果汁中最初的微生物水平通常為1～8（lg（CFU/mL））[6-8]，但美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局頒布的危害分析和關(guān)鍵控制點(diǎn)要求將微生物水平控制在5（lg（CFU/mL））以下[1,9]。目前果汁加工業(yè)普遍采用的是熱殺菌技術(shù)，熱殺菌技術(shù)殺菌效果顯著，但會(huì)改變果汁的色澤，產(chǎn)生熱臭的異味，造成香氣、新鮮度損失，破壞營(yíng)養(yǎng)成分，從而影響果汁的感官特性和品質(zhì)。新興非熱殺菌技術(shù)，如脈沖電場(chǎng)、超高壓均質(zhì)和抗菌肽殺菌等，因其能在較低的溫度下達(dá)到殺菌鈍酶的目的，減少了高溫對(duì)果汁色、香、味、營(yíng)養(yǎng)成分及新鮮度等的影響，成為果汁殺菌技術(shù)的研究熱點(diǎn)[10]。其中，抗菌肽是由宿主產(chǎn)生的能抵御外界微生物侵害的一類小分子多肽，由于其抑菌譜廣、穩(wěn)定性好、抑菌機(jī)制獨(dú)特、不易殘留等優(yōu)勢(shì)，使其在醫(yī)藥行業(yè)和食品工業(yè)等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景[11]。其中，由乳酸菌產(chǎn)生的乳酸鏈球菌素（Nisin）是其中一種抗菌肽，因其能夠抑制腐敗細(xì)菌和致病菌的生長(zhǎng)，且不會(huì)對(duì)產(chǎn)品物理化學(xué)特性造成顯著的影響而被廣泛應(yīng)用于果汁中[12]?？咕目梢苑乐味喾N致病菌感染，目前已有大量報(bào)道表明抗菌肽對(duì)單增李斯特菌有明顯的抑菌功效[13-15]，然而，目前除了Nisin，將其他抗菌肽作為食品防腐劑應(yīng)用于果汁殺菌防腐的研究鮮有報(bào)道[16-17]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽zp3（GIIAGIIIKIKKNH2）由于具有較多的親水性氨基酸而對(duì)多種病原菌表現(xiàn)出良好的抗菌活性[18]。為了通過增加兩親性來提高抗菌肽zp3的抑菌活性，本課題組采用親水性氨基酸賴氨酸取代抗菌肽zp3第3位的異亮氨酸和第5位的甘氨酸，得到了抗菌肽zp37（GIKAKIIIKIKK-NH2）。本研究旨在明確抗菌肽zp37對(duì)單增李斯特菌的抑菌活性并分析其抑菌機(jī)制，為抗菌肽作為食品生物防腐劑應(yīng)用于果汁提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

單增李斯特菌CMCC54004由西南大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品貯藏與物流實(shí)驗(yàn)室保藏。

抗菌肽zp37（GIKAKIIIKIKK-NH2）通過將抗菌肽zp3上第3位點(diǎn)的異亮氨酸和第5位點(diǎn)的甘氨酸替換為賴氨酸得到[18]?？咕膠p37和用異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的抗菌肽zp37（FITC-zp37）由南京杰肽生物科技有限公司合成，隨后，經(jīng)反相高效液相色譜法純化至純度95%以上。

Live/Dead BacLight細(xì)菌活力試劑盒、SYTOX綠色染液、geneRuler 1 kb plus DNA marker 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；3,3’-二丙基硫代二碳氰碘化物（DiSC3(5)）熒光探針、2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）、Hoechst染液和尼羅紅染液 上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；PureLink?基因組DNA mini試劑盒 美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司；MH肉湯、LB肉湯和PALCAM選擇性培養(yǎng)基 美國(guó)BD公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Eclipse Ti2-E活細(xì)胞熒光成像系統(tǒng) 上海尼康儀器有限公司；96 孔黑色玻璃板 武漢賽爾維斯科技有限公司；SpectraMax iD3多功能酶標(biāo)儀 上海美谷儀器有限公司；VEGA3掃描電子顯微鏡 上海泰斯肯貿(mào)易有限公司；TCS SPE共聚焦顯微鏡 德國(guó)徠卡公司；NanoDropTMOneC微量紫外-可見分光光度計(jì) 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗菌肽zp37對(duì)單增李斯特菌抑菌活性分析

1.3.1.1 最小抑菌濃度測(cè)定

按照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)指南（2019年）中的肉湯稀釋法[19]，在96 孔板上用MH肉湯將抗菌肽zp3和抗菌肽zp37以2 倍逐級(jí)稀釋至質(zhì)量濃度分別為128、64、32、16、8、4、2 μg/mL，接種單增李斯特菌菌懸液至菌體終濃度為106CFU/mL，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察無(wú)菌體生長(zhǎng)的最低多肽質(zhì)量濃度即為最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.3.1.2 生長(zhǎng)曲線

將單增李斯特菌菌懸液接種到新鮮LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)2 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。隨后，加入抗菌肽zp37至終濃度分別為1、2、4、8 MIC，繼續(xù)培養(yǎng)10 h。每1 h取樣，測(cè)定其在600 nm波長(zhǎng)處的光密度值（OD600nm）。對(duì)照組以無(wú)菌水代替抗菌肽zp37溶液。

1.3.1.3 活/死細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液于6 500 r/min離心10 min，菌體用9 g/L NaCl溶液（無(wú)菌生理鹽水）重懸至OD600nm為0.2。然后將菌懸液等分為5 組，其中4 組加入抗菌肽zp37至終濃度分別為1、2、4、8 MIC，剩余一組加入等體積無(wú)菌水作為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)1 h。按照Live/Dead BacLight細(xì)菌活力試劑盒說明書進(jìn)行染色[18]，暗處?kù)o置20 min，置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光圖像，放大倍數(shù)均為100 倍。

1.3.2 不同果汁中細(xì)菌接種及計(jì)數(shù)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期單增李斯特菌液于6 500 r/min離心10 min，菌體用無(wú)菌生理鹽水重懸至OD600nm為0.5，然后將菌液分別加入滅菌后的草莓汁、獼猴桃汁和蘋果汁中，稀釋至終濃度為106～107CFU/mL，根據(jù)之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加入抗菌肽zp37至終濃度為2 MIC。每24 h取樣，采用稀釋涂布平板法，用選擇性培養(yǎng)基PALCAM計(jì)算菌落數(shù)。相同處理下，以無(wú)菌水代替抗菌肽zp37作為對(duì)照組（control）。

1.3.3 菌體的膜電位測(cè)定

使用熒光探針DiSC3(5)測(cè)定菌體的膜電位[18]。將單增李斯特菌在LB肉湯中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600nm為0.2），取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液離心。菌體在無(wú)菌生理鹽水中重懸至OD600nm為0.2。在菌懸液中加入KCl至終濃度為100 mmol/L，接著加入DiSC3(5)至終質(zhì)量濃度為1 μg/mL，避光反應(yīng)15 min。隨后在96 孔黑色玻璃板前3 列中，每孔加入150 μL菌懸液。最后將抗菌肽zp37按列分別加入至終質(zhì)量濃度分別為0.5、0.25、0.125 MIC[20]。在激發(fā)波長(zhǎng)620 nm、發(fā)射波長(zhǎng)670 nm條件下使用多功能酶標(biāo)儀連續(xù)測(cè)定12 min內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化[21]。相同處理下，以1 μmol/L纈氨霉素代替抗菌肽zp37作為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌水代替抗菌肽zp37作為陰性對(duì)照（control）。

1.3.4 細(xì)菌膜完整性測(cè)定

將單增李斯特菌接種在新鮮的LB肉湯中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后離心收集菌體，在無(wú)菌生理鹽水中重懸至OD600nm為0.2，加入SYTOX綠色染液至終質(zhì)量濃度為1 μg/mL，暗處?kù)o置5 min。在96 孔板前4 列中分別加入上述菌懸液150 μL。接著，按列分別加入抗菌肽zp37溶液至最終質(zhì)量濃度分別為1、2、4、8 MIC。在3 h內(nèi)每0.5 h使用酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，測(cè)定條件：激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)523 nm。相同處理下，以無(wú)菌水代替抗菌肽zp37作為陰性對(duì)照（control），以16 μg/mL的蜂毒肽代替抗菌肽zp37溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.5 掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

將菌體在LB肉湯中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600nm為0.2），加入抗菌肽zp37至終質(zhì)量濃度為2 MIC，37 ℃下培養(yǎng)2 h后離心收集菌體。菌體使用無(wú)菌生理鹽水洗滌3 次，之后在4 ℃下，用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液在無(wú)菌蓋玻片上固定過夜。使用10%、30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水并干燥。噴灑金粉后，使用掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，電壓20 kV、放大倍數(shù)20 000。相同處理下，以無(wú)菌水代替抗菌肽zp37作為對(duì)照。

1.3.6 細(xì)胞聚集率計(jì)算

參考Yi Lanhua等[19]的方法，取在LB肉湯中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液離心，菌體用無(wú)菌生理鹽水洗滌并重懸至OD600nm為0.5，加入抗菌肽zp37至終質(zhì)量濃度分別為0（control）、0.5、1、2 MIC，37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)1 h。之后菌體用無(wú)菌生理鹽水洗滌、重懸至OD600nm為1，室溫靜置，在36 h內(nèi)每12 h取200 μL的中間層菌懸液，用無(wú)菌生理鹽水稀釋至2 mL，測(cè)定OD600nm。按下式計(jì)算細(xì)胞聚集率。

式中：A0是0 h的OD600nm；At是每個(gè)測(cè)定時(shí)間的OD600nm。

1.3.7 激光共聚焦顯微鏡分析細(xì)胞作用位置

參考Zeng Peng等[22]方法并有所改動(dòng)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期單增李斯特菌菌體細(xì)胞先用Hoechst染液（10 μg/mL）染色20 min，再用尼羅紅染料（1 μg/mL）染色30 min，然后添加FITC-zp37至終質(zhì)量濃度為4 MIC。37 ℃處理1 h后，用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液固定細(xì)胞30 min，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光分布，放大倍數(shù)為630。

1.3.8 DNA結(jié)合測(cè)定

將單增李斯特菌在LB肉湯中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，使用PureLink?基因組DNA迷你試劑盒提取其基因組DNA[19]。將DNA稀釋至400 μg/mL后，取8 組30 μL的DNA稀釋液，加入等體積不同質(zhì)量濃度的抗菌肽zp37至終質(zhì)量濃度分別為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL和0 μg/mL?；旌暇鶆颍?7 ℃下處理1 h，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析DNA遷移。同時(shí)，使用紫外-可見分光光度計(jì)分別測(cè)定反應(yīng)上清液剩余的DNA質(zhì)量濃度。

1.3.9 胞內(nèi)活性氧測(cè)定

用DCFH-DA法測(cè)定單增李斯特菌產(chǎn)生的活性氧含量[23]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液離心，菌體用無(wú)菌生理鹽水洗滌并重懸至OD600nm為0.5。將上述菌懸液等分成若干組兩份，其中一份加入L-抗壞血酸至終濃度為20 mmol/L，之后在兩份菌懸液中添加抗菌肽zp37至終質(zhì)量濃度分別為0（control）、0.5、1、2、4、8 MIC，37 ℃下培養(yǎng)2 h。添加DCFH-DA至終質(zhì)量濃度為10 μg/mL，暗處放置20 min后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽zp37對(duì)單增李斯特菌的抑菌活性

2.1.1 MIC的確定

抗菌肽zp37對(duì)單增李斯特菌的MIC為16 μg/mL，而其模板抗菌肽zp3對(duì)單增李斯特菌的MIC大于64 μg/mL，結(jié)果表明，zp3上第3位異亮氨酸和第5位甘氨酸被替換為賴氨酸后得到的抗菌肽zp37對(duì)單增李斯特菌具有更強(qiáng)的抑制效果。另外，根據(jù)王雙童等[24]的研究，Nisin對(duì)單增李斯特菌的MIC為500 μg/mL。由此可見，抗菌肽zp37的抑菌活性遠(yuǎn)高于Nisin，具有很好的應(yīng)用前景。

2.1.2 生長(zhǎng)曲線

如圖1A所示，在新鮮的LB肉湯中培養(yǎng)后，1 MIC和2 MIC處理后的單增李斯特菌光密度值仍持續(xù)上升，但菌體密度與對(duì)照組相比有明顯的下降，表明低質(zhì)量濃度的抗菌肽zp37只能抑制部分菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)。這可能是由于加入抗菌肽zp37時(shí)，單增李斯特菌的菌體密度（約108CFU/mL）遠(yuǎn)高于測(cè)定MIC時(shí)的菌體密度（約106CFU/mL），低質(zhì)量濃度抗菌肽zp37不足以抑制菌體生長(zhǎng)。4 MIC處理后光密度值基本不再增大，說明單增李斯特菌的生長(zhǎng)已被基本抑制。8 MIC處理后，生長(zhǎng)曲線略有下降，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，表明此質(zhì)量濃度下的抗菌肽zp37處理可以導(dǎo)致單增李斯特菌的死亡，部分細(xì)胞甚至可能發(fā)生了裂解。該結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的抗菌肽zp37對(duì)單增李斯特菌的生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用，且抑菌能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。

圖1 不同質(zhì)量濃度zp37對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of zp37 on the growth of L.monocytogenes

2.1.3 活細(xì)胞和死細(xì)胞對(duì)比

Live/Dead試劑盒包含兩種熒光染料：SYTO9和PI，兩種熒光染料透過細(xì)胞膜的能力不同，在熒光顯微鏡下，活細(xì)胞呈現(xiàn)SYTO9的熒光，即綠色，而死細(xì)胞呈現(xiàn)PI的熒光，即紅色。由圖1B可知，對(duì)照組細(xì)胞幾乎全部顯示綠色熒光，表示細(xì)胞死亡率很小；隨著抗菌肽zp37質(zhì)量濃度的增大，呈現(xiàn)橙紅色熒光的菌體密度逐漸增加，綠色熒光逐漸減少。從圖1B4中可以看出，只有很少的綠色熒光顯現(xiàn)，表明用8 MIC的抗菌肽zp37處理1 h后絕大部分菌體已經(jīng)死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗菌肽zp37對(duì)單增李斯特菌的致死作用隨質(zhì)量濃度增加逐漸增強(qiáng)，該結(jié)果與2.1.2節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證。

2.2 抗菌肽zp37對(duì)不同果汁中單增李斯特菌的抑制作用

由圖2可知，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，草莓汁、獼猴桃汁和蘋果汁對(duì)照組中單增李斯特菌活菌數(shù)逐漸下降，這可能是由于目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)的鮮榨果汁均為低pH值（小于4.0）[6,25]，可以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。但是，在貯藏后期，對(duì)照組單增李斯特菌活菌數(shù)下降趨勢(shì)減緩，可能是由于少部分菌體已表現(xiàn)出酸適應(yīng)性，能夠在酸性條件下長(zhǎng)期存活。根據(jù)田牧雨等[26]的報(bào)道，單增李斯特菌在低pH值下會(huì)發(fā)生強(qiáng)烈的誘導(dǎo)性耐酸響應(yīng)，這種機(jī)制可以使其在酸性條件下無(wú)法被完全殺滅。在加入抗菌肽zp37后，草莓汁、獼猴桃汁和蘋果汁中單增李斯特菌細(xì)胞菌落數(shù)下降趨勢(shì)較對(duì)照組更為明顯，且在第7天均可以降至檢測(cè)限以下。這表明在果汁中加入抗菌肽zp37可以逐漸殺死所有單增李斯特菌，包括其中的耐酸菌，從而保障果汁的食用安全。此外，抗菌肽zp37對(duì)不同果汁的抑菌活性動(dòng)態(tài)變化不同，可能與抗菌肽與果汁介質(zhì)體系的相互作用有關(guān)[27]。

圖2 zp37對(duì)不同果汁中單增李斯特菌的抑制作用Fig.2 Inhibition of L.monocytogenes in different fruit juices by zp37

2.3 抗菌肽zp37對(duì)單增李斯特菌膜電位的影響

熒光探針DiSC3(5)是一種陽(yáng)離子膜電位敏感熒光染料，當(dāng)細(xì)胞膜完好時(shí)，染料在磷脂雙分子層內(nèi)聚集，熒光被猝滅?？咕衔锟梢栽黾蛹?xì)胞膜離子滲透性，使膜去極化后，電位消失，染料會(huì)迅速釋放到介質(zhì)中，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度與電位減少程度成正比[28-30]。如圖3所示，陰性對(duì)照的單增李斯特菌細(xì)胞發(fā)生熒光猝滅?？咕膠p37處理后，抑制了熒光的猝滅，熒光強(qiáng)度逐漸上升，并且各質(zhì)量濃度zp37處理組的上升趨勢(shì)均與陽(yáng)性對(duì)照纈氨霉素組相似。纈氨霉素是一種典型的離子載體抗生素，它作為鉀離子特異性轉(zhuǎn)運(yùn)體，能夠促進(jìn)鉀離子的擴(kuò)散，可引起膜電位的耗散，使染料釋放到介質(zhì)中，造成熒光強(qiáng)度增加[30]。同時(shí)，對(duì)比相同時(shí)間下各質(zhì)量濃度zp37處理組的熒光強(qiáng)度，可以看出抗菌肽zp37質(zhì)量濃度越大，發(fā)出的熒光越強(qiáng)烈，說明在一定范圍內(nèi)，抗菌肽zp37質(zhì)量濃度越高，對(duì)細(xì)胞膜的去極化作用效果越明顯。該結(jié)果表明，抗菌肽zp37在較低質(zhì)量濃度下可以作用于細(xì)胞膜，引起膜離子通透性改變，導(dǎo)致膜內(nèi)外電勢(shì)改變，從而抑制單增李斯特菌生長(zhǎng)。

圖3 不同質(zhì)量濃度的zp37和1 μmol/L纈氨霉素對(duì)單增李斯特菌膜電位的影響Fig.3 Effects of different concentrations of zp37 versus 1 μmol/L valinomycin on the membrane potential of L.monocytogenes

2.4 抗菌肽zp37對(duì)單增李斯特菌膜完整性的影響

根據(jù)上述膜電位研究結(jié)果，推測(cè)抗菌肽zp37可以影響細(xì)胞膜通透性，因此，進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞膜完整性。SYTOX是非膜通透性染料，不能進(jìn)入具有完整細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞膜被破壞時(shí)，SYTOX可進(jìn)入細(xì)胞，與DNA結(jié)合，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度上升。蜂毒肽可以在細(xì)胞膜上形成大的孔洞，從而破壞細(xì)胞膜完整性，被廣泛用作細(xì)胞膜完整性研究的陽(yáng)性對(duì)照，包括在破壞單增李斯特菌細(xì)胞膜完整性的研究中[23]。如圖4所示，蜂毒肽處理0.5 h時(shí)，熒光強(qiáng)度就出現(xiàn)了劇烈上升，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)基本保持穩(wěn)定，說明蜂毒肽能夠快速破壞單增李斯特菌細(xì)胞膜的完整性。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，1 MIC和2 MIC抗菌肽zp37處理只引起了熒光強(qiáng)度的微弱升高。隨著抗菌肽zp37處理質(zhì)量濃度的增加，熒光強(qiáng)度的上升趨勢(shì)較為明顯，尤其是8 MIC zp37處理組。該結(jié)果表明，抗菌肽zp37能破壞單增李斯特菌細(xì)胞膜完整性，且與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，但是與蜂毒肽相比，zp37膜破壞能力較弱。同時(shí)，隨著抗菌肽zp37處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞膜的破壞能力逐漸增強(qiáng)。結(jié)果說明，抗菌肽zp37對(duì)細(xì)胞膜的作用具有時(shí)間累積效應(yīng)。因此推測(cè)，抗菌肽zp37能夠破壞單增李斯特菌細(xì)胞膜完整性，但并不是通過形成大的孔洞，可能是通過形成較小的微孔，導(dǎo)致胞內(nèi)小分子物質(zhì)滲漏，從而影響細(xì)胞的生理代謝，甚至殺死單增李斯特菌細(xì)胞。

圖4 不同質(zhì)量濃度的zp37和16 μg/mL蜂毒肽對(duì)單增李斯特菌膜完整性的影響Fig.4 Effects of different concentrations of zp37 versus 16 μg/mL melittin on the membrane integrity of L.monocytogenes

2.5 掃描電子顯微鏡觀察抗菌肽zp37對(duì)單增李斯特菌細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖5A所示，對(duì)照組具有表面光滑和輪廓完整的正常細(xì)胞，且細(xì)胞間分散較均勻。然而，經(jīng)抗菌肽zp37處理后，部分菌體的細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)了明顯變化（圖5B紅色箭頭）：一些細(xì)胞表面變得不光滑，出現(xiàn)大的凹坑和凹痕；有的變形嚴(yán)重，細(xì)胞膜出現(xiàn)明顯殘缺；部分細(xì)胞聚集成堆。該形態(tài)變化結(jié)果表明，經(jīng)過抗菌肽zp37處理后，可能會(huì)引起細(xì)胞被膜的損傷、裂解、甚至溶解，從而導(dǎo)致部分細(xì)胞質(zhì)流出，細(xì)胞出現(xiàn)凹陷變形。該細(xì)胞形態(tài)變化結(jié)果與2.1.2節(jié)生長(zhǎng)曲線中高質(zhì)量濃度下OD600nm降低、細(xì)胞膜完整性破壞等結(jié)果一致。

圖5 單增李斯特菌的掃描電子顯微鏡圖Fig.5 Scanning electron microscopic pictures of L.monocytogenes

2.6 抗菌肽zp37對(duì)單增李斯特菌細(xì)胞聚集的影響

掃描電子顯微鏡觀察到抗菌肽zp37處理會(huì)導(dǎo)致部分細(xì)胞聚集成堆，因此進(jìn)一步分析不同質(zhì)量濃度抗菌肽zp37處理對(duì)單增李斯特菌細(xì)胞聚集性的影響。由圖6可知，隨著時(shí)間的推移，抗菌肽zp37處理促進(jìn)了單增李斯特菌聚集，并且細(xì)胞聚集能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)用0.5 MIC的抗菌肽zp37處理時(shí)，前24 h細(xì)胞的聚集能力與對(duì)照組的聚集能力基本相同，在經(jīng)過36 h處理后，細(xì)胞的聚集能力才明顯增強(qiáng)。由此可知，當(dāng)抗菌肽zp37質(zhì)量濃度較低時(shí)，處理效果需經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間才能有所顯現(xiàn)。根據(jù)Yi Lanhua等[19]的研究，推斷抗菌肽zp37處理引起細(xì)胞聚集能力增強(qiáng)的原因可能是抗菌肽zp37處理后，細(xì)胞被膜完整性被破壞，細(xì)胞表面物質(zhì)的含量和分布發(fā)生了改變，引起細(xì)胞表面電荷分布發(fā)生了變化，從而導(dǎo)致細(xì)胞間的疏水相互作用減弱，呈現(xiàn)細(xì)胞聚集能力增強(qiáng)。

圖6 不同質(zhì)量濃度的zp37對(duì)單增李斯特菌細(xì)胞聚集的影響Fig.6 Effects of different concentrations of zp37 on the cell aggregation of L.monocytogenes

2.7 抗菌肽zp37對(duì)單增李斯特菌細(xì)胞的作用位置

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗菌肽zp37的作用機(jī)理可能與破壞細(xì)胞被膜的完整性有關(guān)，但抗菌肽zp37是否能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并對(duì)胞內(nèi)其他物質(zhì)產(chǎn)生作用并不清楚。因此，進(jìn)一步研究抗菌肽zp37在單增李斯特菌菌體中的作用位置。利用Hoechst染液對(duì)細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行染色，尼羅紅染液對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行染色，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗菌肽zp37以追蹤抗菌肽zp37在細(xì)胞中的作用位置。如圖7A、C、D所示，大量的綠色熒光與紅色熒光重疊并聚集在細(xì)胞膜表面，表明抗菌肽zp37在4 MIC處理下，大量累積在單增李斯特菌的細(xì)胞膜上。該結(jié)果印證了上述抗菌肽zp37抑菌作用與細(xì)胞膜的相互作用有關(guān)。同時(shí)，由圖7A、B、C可知，也有一部分細(xì)胞顯示綠色熒光和藍(lán)色熒光相重疊，這與Zeng Peng等[22]對(duì)抑菌肽對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的抗菌機(jī)理研究結(jié)果相似，表明抗菌肽zp37的作用機(jī)制可能也與其對(duì)DNA的影響有關(guān)。圖7的熒光標(biāo)記結(jié)果表明，抗菌肽zp37在單增李斯特菌細(xì)胞中的作用位置包括細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。

圖7 激光共聚焦顯微鏡觀察zp37對(duì)單增李斯特菌的作用位置Fig.7 Action sites of zp37 on L.monocytogenes observed by laser confocal microscope

2.8 抗菌肽zp37對(duì)單增李斯特菌DNA的影響

熒光示蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗菌肽zp37能夠進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，可能與DNA結(jié)合，因此，進(jìn)一步分析抗菌肽zp37與DNA的相互作用。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)m（DNA）∶m（zp37）≤200∶50時(shí)，抗菌肽zp37會(huì)干擾DNA遷移，DNA殘留在上樣孔中（圖8A）。同時(shí)，在m（DNA）∶m（zp37）≤200∶100時(shí)，測(cè)得上清液中殘留的DNA質(zhì)量濃度顯著降低，尤其是m（DNA）∶m（zp37）＝200∶200時(shí)。因此，當(dāng)抗菌肽zp37質(zhì)量濃度大于DNA質(zhì)量濃度的1/4時(shí)，可以發(fā)生明顯的抗菌肽-DNA結(jié)合作用。當(dāng)抗菌肽zp37質(zhì)量濃度大于或等于DNA質(zhì)量濃度時(shí)，抗菌肽zp37可使絕大部分DNA發(fā)生沉淀。根據(jù)李冠楠等[11]對(duì)抗菌肽的作用機(jī)理的研究報(bào)道，抗菌肽與細(xì)菌的DNA結(jié)合是一種常見的抑菌機(jī)制，抗菌肽與細(xì)胞DNA結(jié)合時(shí)，可以阻斷細(xì)胞DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞的生命活動(dòng)，從而使細(xì)胞失去生命活性。這可能也是抗菌肽zp37抑制單增李斯特菌生長(zhǎng)的機(jī)理之一。

圖8 zp37對(duì)單增李斯特菌DNA的影響Fig.8 Effect of zp37 on L.monocytogenes DNA

2.9 抗菌肽zp37對(duì)單增李斯特菌胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的影響

DCFH-DA可與活性氧反應(yīng)產(chǎn)生具有熒光的2’,7’-二氯二氫熒光素（dichlorodihydro-fluoroscein，DCF），因此，通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度即可反映產(chǎn)生的活性氧水平。結(jié)果如圖9所示，在L-抗壞血酸存在下，不同質(zhì)量濃度抗菌肽zp37處理后的細(xì)胞熒光強(qiáng)度基本沒有變化。其原因是L-抗壞血酸是一種抗氧化劑，可還原體系內(nèi)產(chǎn)生的活性氧[23]。然而，對(duì)于只有抗菌肽處理組，加入抗菌肽zp37后，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，并且隨著抗菌肽zp37質(zhì)量濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸上升，均高度顯著高于含有L-抗壞血酸組。該結(jié)果表明，加入抗菌肽zp37后會(huì)誘導(dǎo)單增李斯特菌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，并且隨著抗菌肽zp37質(zhì)量濃度的升高，活性氧產(chǎn)生量不斷上升。根據(jù)張超等[31]研究，活性氧是形成單增李斯特菌菌膜必不可缺的信號(hào)分子，單增李斯特菌中存在類似于負(fù)責(zé)產(chǎn)生活性氧的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶，由NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生的適量活性氧對(duì)維持菌細(xì)胞正常生命活動(dòng)有至關(guān)重要的意義，過多或過少均會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的殺滅作用。因此，誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生可能是抗菌肽zp37進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后殺死單增李斯特菌的另一種作用機(jī)制。

圖9 zp37對(duì)單增李斯特菌產(chǎn)生活性氧的影響Fig.9 Effect of zp37 on the production of ROS in L.monocytogenes

3 結(jié) 論

控制果汁中單增李斯特菌的數(shù)量對(duì)于保障果汁食品安全性至關(guān)重要，但目前缺乏有效的抑制果汁中單增李斯特菌的食品生物防腐劑。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一種抗菌肽zp37，并通過一系列相關(guān)實(shí)驗(yàn)，揭示了抗菌肽zp37對(duì)果汁中單增李斯特菌的抑制活性及作用機(jī)制。研究結(jié)果表明，抗菌肽zp37在體外及果汁中均表現(xiàn)出良好的抑制單增李斯特菌能力?？咕膠p37對(duì)單增李斯特菌的抑菌機(jī)制包括作用于細(xì)胞被膜和作用于胞內(nèi)物質(zhì)。首先，zp37能夠作用于細(xì)胞被膜，破壞細(xì)胞膜完整性、改變膜電位、引起細(xì)胞變形和聚集；進(jìn)一步，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，抗菌肽zp37與DNA結(jié)合，并且誘導(dǎo)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生。本研究結(jié)果對(duì)于將抗菌肽zp37作為一種生物防腐劑抑制果汁或其他食品中的病原菌具有一定的指導(dǎo)作用。