鄭 茜，張 勇，楊東偉，王東偉

心力衰竭以心臟結(jié)構(gòu)或功能損害導(dǎo)致一系列終末期臨床綜合征為特點(diǎn)，發(fā)病率和死亡率均較高[1]。心肌細(xì)胞凋亡為心力衰竭心肌病理?yè)p傷的重要病理生理機(jī)制，目前普遍認(rèn)為抑制細(xì)胞凋亡可改善心臟病理組織變化[2]。microRNAs(miRNAs)是一組由短基因編碼、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄且天然存在的非編碼RNA，可與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(untranslated area，UTR)結(jié)合，促進(jìn)mRNA降解或抑制mRNA翻譯，進(jìn)而調(diào)節(jié)生理和病理過(guò)程[3]。相關(guān)研究顯示，miR-199a-5p可靶向抑制細(xì)胞增殖、遷移與侵襲并誘導(dǎo)凋亡[4-6]。轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白激酶B(transcription factor activated protein kinase B，JunB)是激活蛋白-1轉(zhuǎn)錄因子家族成員，可與位于靶基因順式調(diào)控域中的認(rèn)知結(jié)合序列結(jié)合，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、增殖和凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程[7]。目前關(guān)于miR-199a-5p是否可靶向JunB調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡的報(bào)道較少，故本研究通過(guò)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支誘導(dǎo)構(gòu)建心肌梗死后心力衰竭大鼠模型，探討抑制miR-199a-5p表達(dá)和miR-199a-5p過(guò)表達(dá)時(shí)預(yù)測(cè)靶基因JunB表達(dá)及心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡的變化，以期為改善心力衰竭病理?yè)p傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性7周齡Wistar大鼠120只，體質(zhì)量(200±20)g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào)SCXK(鄂)2015-0018；H9C2心肌細(xì)胞系購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 miR-199a-5p Antagomir、miR-199a-5p Agomir、Antagomir對(duì)照及Agomir對(duì)照液均購(gòu)自蘇州吉瑪基因股份有限公司；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenylte-trazolium chloride，TTC)染色試劑盒、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定法(TUNEL)染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；兔抗活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-aspartate specific cysteine protease 3，Cleaved-Caspase 3)、JunB、淋巴細(xì)胞瘤-2(blymphoma 2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 related X protein，Bax)購(gòu)自美國(guó)CST公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；Olympus光學(xué)顯微鏡購(gòu)自上海通灝光電科技有限公司；總RNA提取試劑盒(離心柱型)、一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Super Real熒光定量預(yù)混試劑-增強(qiáng)版試劑盒均購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)ProteinSimple公司。

1.2 方法

1.2.1 分組、心力衰竭大鼠模型建立及給藥 恒溫(22±2)℃、恒濕(55±5)%環(huán)境下普通飼養(yǎng)，12 h光/暗交替適應(yīng)飼養(yǎng)1周。將120只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、Antagomir對(duì)照組、Antagomir組、Agomir對(duì)照組及Agomir組。假手術(shù)組大鼠18只，余下大鼠均用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)誘導(dǎo)麻醉，打開(kāi)胸腔，剪開(kāi)心包暴露左冠狀動(dòng)脈前降支，6-0尼龍線結(jié)扎，心肌組織染色由紅變白及心電圖出現(xiàn)ST段抬高改變證實(shí)冠狀動(dòng)脈閉塞，假手術(shù)組穿線后不結(jié)扎，其他操作與造模步驟一致。成功誘導(dǎo)冠狀動(dòng)脈閉塞大鼠94只，剔除4只，模型組、Antagomir對(duì)照組、Antagomir組、Agomir對(duì)照組及Agomir組隨機(jī)分為18只。持續(xù)結(jié)扎2周后分別給予Antagomir對(duì)照組、Antagomir組、Agomir對(duì)照組及Agomir組大鼠心肌內(nèi)分點(diǎn)注射2×1010PFU/mL miR-199a-5p Antagomir對(duì)照液、Antagomir液、Agomir對(duì)照液及Agomir稀釋液各100 μL，假手術(shù)組與模型組大鼠注射等量生理鹽水。

1.2.2 樣品采集與處理 注射48 h后用1%戊巴比妥鈉麻醉，脫頸致死，解剖大鼠，采集部分心臟用于TTC染色；取心肌組織，使用冷磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution，PBS)洗去多余血跡，分別保存于4%多聚甲醛和-80 ℃低溫冰箱。

1.2.3 TTC染色測(cè)定心肌梗死面積 將新鮮心臟于-20 ℃放置10 min，進(jìn)行2 mm冠狀冷凍切片，之后于37 ℃的2%TTC染液中溫浴30 min(梗死區(qū)域?yàn)榘咨?，4%多聚甲醛中固定24 h，采用Image J圖像分析軟件計(jì)算心肌梗死面積，心肌梗死面積=白色面積/總面積×100%。

1.2.4 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察各組大鼠心肌組織病理變化 將心肌組織于4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋制備5 μm厚度組織切片，二甲苯脫蠟至水，滴加適量蘇木素染核5 min，1%鹽酸乙醇分化10 s，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗后滴加適量伊紅染液染色30 s，流水沖洗，將切片脫水透明，晾干后中性樹(shù)膠封片，于400倍放大鏡下觀察并采集圖片。

1.2.5 TUNEL染色觀察心肌細(xì)胞凋亡 常規(guī)石蠟包埋制備5 μm厚度石蠟切片，二甲苯中脫蠟，100%乙醇及95%乙醇水化，蛋白酶K通透，磷酸鹽緩沖液洗滌3～5次，于預(yù)冷的TUNEL工作液中反應(yīng)，過(guò)氧化物酶封閉后與底物二氨基聯(lián)苯胺混合液反應(yīng)顯色，光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中見(jiàn)有棕色顆粒，即為凋亡細(xì)胞，400倍放大鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞凋亡指數(shù)=(TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中miR-199a-5p、JunB 基因相對(duì)表達(dá)水平 根據(jù)RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組大鼠心肌組織總RNA，測(cè)定RNA濃度；根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以其為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，引物利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，交由華大基因合成，引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min充分延伸。制備RT-qPCR反應(yīng)體系，以2 000 r/min離心5 min，于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀內(nèi)進(jìn)行定量檢測(cè)。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算最終目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 miR-199a-5p、JunB及內(nèi)參引物序列

1.2.7 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因分析 利用TargetScan(http://www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)JunB可能是miR-199a-5p的潛在靶點(diǎn)。為驗(yàn)證此結(jié)論，將野生型(wild type，WT)和突變型(mutant，MUT)JunB的3′-UTR基因片段克隆到pmirGLO雙熒光素酶miRNA報(bào)告載體，將重組報(bào)告載體與miR-199a-5p Agomir及Agomir對(duì)照共轉(zhuǎn)染至25孔板H9C2細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后，加入裂解液裂解細(xì)胞，12 000×重力加速度，4 ℃離心10 min，收集上清液，立即使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)。報(bào)告基因相對(duì)活性=螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.2.8 免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)Cleaved-Caspase 3、JunB、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況 取心肌組織，研缽加入液氮碾碎后收集到無(wú)菌離心管內(nèi)，RIPA裂解液裂解，12 000×重力加速度，4 ℃離心10 min，取上清液。測(cè)定蛋白濃度并加熱變性，十二烷硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(濃縮膠60 V 22 min，分離膠120 V 70 min)，轉(zhuǎn)膜(200 mA，120 min)，5%脫脂乳封閉PVDF膜2 h，一抗(1∶500)稀釋4 ℃孵育過(guò)夜；次日洗膜，換液3～6次，二抗(1∶8 000)稀釋孵育2 h，洗膜3～6次，電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯影，利用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)曝光并拍照記錄。采用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白Cleaved-Caspase 3、JunB、Bcl-2、Bax與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積比較 TTC染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌組織整體呈均勻玫瑰紅色，模型組、Antagomir對(duì)照組、Antagomir組、Agomir對(duì)照組及Agomir組大鼠心肌均可見(jiàn)不同程度的梗死灶。6組大鼠心肌梗死面積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌梗死面積增大(P<0.05)；與模型組比較，Antagomir對(duì)照組及Agomir對(duì)照組大鼠心肌梗死面積比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Antagomir組大鼠心肌梗死面積縮小(P<0.05)，Agomir組大鼠心肌梗死面積增大(P<0.05)；與Antagomir對(duì)照組比較，Antagomir組大鼠心肌梗死面積縮小(P<0.05)；與Agomir對(duì)照組比較，Agomir組大鼠心肌梗死面積增大(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1、表2。

圖1 各組大鼠心肌梗死面積TTC染色圖(A為假手術(shù)組；B為模型組；C為Antagomir對(duì)照組；D為Antagomir組；E為Agomir對(duì)照組；F為Agomir組)

表2 各組大鼠心肌梗死面積比較(±s)單位：%

2.2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心臟組織切片細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，有完整的細(xì)胞膜、細(xì)胞核和規(guī)則心肌紋路；模型組、Antagomir對(duì)照組及Agomir對(duì)照組大鼠心臟組織切片結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞排列錯(cuò)亂不規(guī)則或呈波浪狀纖維，炎性白細(xì)胞浸潤(rùn)；Antagomir組大鼠心肌細(xì)胞有完整的細(xì)胞膜及橢圓形細(xì)胞核，心肌細(xì)胞間排列變得有序；Agomir組大鼠有明顯心肌細(xì)胞肥大，細(xì)胞間隙增寬，心肌纖維受損嚴(yán)重。詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠心臟組織HE染色圖(×400)(A為假手術(shù)組；B為模型組；C為Antagomir對(duì)照組；D為Antagomir組；E為Agomir對(duì)照組；F為Agomir組)

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 TUNEL染色結(jié)果顯示，6組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。進(jìn)一步兩組間比較結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)升高(P<0.05)；與模型組比較，Antagomir對(duì)照組及Agomir對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Antagomir組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)降低，Agomir組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)升高(P<0.05)；與Antagomir對(duì)照組比較，Antagomir組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)降低(P<0.05)；與Agomir對(duì)照組比較，Agomir組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表3、圖3。

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(±s)單位：%

圖3 各組大鼠心臟組織TUNEL染色圖(×400)(A為假手術(shù)組；B為模型組；C為Antagomir對(duì)照組；D為Antagomir組；E為Agomir對(duì)照組；F為Agomir組)

2.4 各組大鼠心肌組織miR-199a-5p、JunB mRNA相對(duì)表達(dá)水平 RT-qPCR結(jié)果顯示，6組大鼠心肌組織miR-199a-5p、JunB mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步兩組間比較結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠miR-199a-5p mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高，JunB mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低(P<0.05)；與模型組比較，Antagomir對(duì)照組及Agomir對(duì)照組大鼠心肌組織內(nèi)miR-199a-5p、JunB mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Antagomir組大鼠miR-199a-5p mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低，JunB mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高，Agomir組大鼠miR-199a-5p mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高，JunB mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低(P<0.05)；與Antagomir對(duì)照組比較，Antagomir組大鼠心肌組織miR-199a-5p mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低，JunB mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高(P<0.05)；與Agomir對(duì)照組比較，Agomir大鼠心肌組織miR-199a-5p mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高，JunB mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠心肌組織內(nèi)miR-199a-5p、JunB mRNA相對(duì)表達(dá)水平(±s)

2.5 miR-199a-5p與JunB靶向關(guān)系 經(jīng)生物信息學(xué)分析，JunB被預(yù)測(cè)為miR-199a-5p的潛在靶基因。雙熒光素酶基因報(bào)告結(jié)果顯示，與Agomir對(duì)照組比較，miR-199a-5p Agomir組細(xì)胞中JunB-WT相對(duì)活性降低(P<0.001)。詳見(jiàn)圖4、表5。

圖4 TargetScan靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果(白色部分序列為結(jié)合序列)

表5 兩組細(xì)胞JunB熒光活性相對(duì)表達(dá)量比較(±s，n=5)

2.6 各組大鼠心肌組織Cleaved-Caspase 3、JunB、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較 Western Blot結(jié)果顯示，6組大鼠心肌組織內(nèi)Cleaved-Caspase 3、JunB、Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織內(nèi)Cleaved-Caspase 3、Bax蛋白表達(dá)水平升高，JunB、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與模型組比較，Antagomir對(duì)照組及Agomir對(duì)照組大鼠心肌組織內(nèi)Cleaved-Caspase 3、Bax、JunB、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Antagomir組大鼠Cleaved-Caspase 3、Bax蛋白表達(dá)水平降低，JunB、Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，Agomir組大鼠Cleaved-Caspase 3、Bax蛋白表達(dá)水平升高，JunB、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與Antagomir對(duì)照組比較，Antagomir組大鼠心肌組織內(nèi)Cleaved-Caspase 3、Bax蛋白表達(dá)水平降低，JunB、Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與Agomir對(duì)照組比較，Agomir組大鼠Cleaved-Caspase 3、Bax蛋白表達(dá)水平升高，JunB、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表6、圖5。

表6 各組大鼠心肌組織Cleaved-Caspase 3、JunB、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況(±s)

圖5 各組大鼠心臟組織Cleaved-Caspase 3、Bax、JunB、Bcl-2蛋白表達(dá)條帶圖(A為假手術(shù)組；B為模型組；C為Antagomir對(duì)照組；D為Antagomir組；E為Agomir對(duì)照組；F為Agomir組)

3 討 論

心力衰竭是急性心肌梗死的常見(jiàn)并發(fā)癥[8]，miRNA是這一病理過(guò)程的重要信號(hào)標(biāo)志[9]。本研究結(jié)扎心臟左冠狀動(dòng)脈前降支，發(fā)現(xiàn)大鼠心肌組織大面積梗死，正常組織結(jié)構(gòu)改變，心肌細(xì)胞凋亡，且miR-199a-5p mRNA水平升高，提示成功構(gòu)建心力衰竭大鼠模型。

miR-199a-5p Antagomir為miR-199a-5p拮抗劑，與體內(nèi)成熟的miR-199a-5p競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，進(jìn)而抑制其作用發(fā)揮；miR-199a-5p Agomir為miRNA激動(dòng)劑，可模擬內(nèi)源性miR-199a-5p調(diào)節(jié)靶基因mRNA表達(dá)，miR-199a-5p過(guò)表達(dá)是導(dǎo)致并促進(jìn)心臟病(心房顫動(dòng)和心力衰竭)發(fā)展、病理生理改變的主要原因[10-12]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，抑制miR-199a-5p表達(dá)可縮小心力衰竭大鼠心肌梗死面積，減輕心肌組織病理變化，減少細(xì)胞凋亡；過(guò)表達(dá)miR-199a-5p后，心力衰竭大鼠心肌組織病理?yè)p傷加重，提示miR-199a-5p對(duì)心力衰竭大鼠心肌損傷的誘導(dǎo)作用。

激活蛋白-1是炎癥和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其亞基JunB可作為針對(duì)細(xì)胞因子和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡防御機(jī)制的調(diào)節(jié)劑，過(guò)表達(dá)時(shí)可保護(hù)細(xì)胞免于凋亡[13]。另有研究顯示，miR-199a-5p可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，過(guò)表達(dá)時(shí)可抑制人類(lèi)胚胎腎293T細(xì)胞中JunB表達(dá)[14]。本研究熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-199a-5p可降低JunB 3′WT-UTR的活性，對(duì)靶點(diǎn)JunB 3′MUT-UTR活性幾乎無(wú)影響，提示JunB為miR-199a-5p靶基因；同時(shí)結(jié)果顯示，與模型組比較，抑制miR-199a-5p表達(dá)時(shí)，miR-199a-5p mRNA降低，JunB mRNA表達(dá)水平升高，miR-199a-5p過(guò)表達(dá)時(shí)，miR-199a-5p mRNA升高，JunB mRNA表達(dá)水平降低，提示miR-199a-5p可直接靶向JunB基因的3′UTR抑制其轉(zhuǎn)錄活性，抑制miR-199a-5p表達(dá)時(shí)，JunB蛋白表達(dá)水平升高，而miR-199a-5p過(guò)表達(dá)時(shí)，JunB蛋白表達(dá)水平降低，證實(shí)miR-199a-5p可靶向介導(dǎo)JunB表達(dá)。參與細(xì)胞凋亡的外在和內(nèi)在途徑的蛋白包括Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9和Bcl-2家族蛋白(Bcl-2、Bax)[15-16]，其中，Caspase 3是需要半胱氨酸蛋白酶家族的重要成員，其激活可作為細(xì)胞凋亡發(fā)生的指標(biāo)[17]。Bcl-2認(rèn)為是細(xì)胞凋亡蛋白家族重要的調(diào)控蛋白，可抑制凋亡因子釋放，Bax因其BH3結(jié)構(gòu)域而促進(jìn)凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，抑制miR-199a-5p表達(dá)時(shí)，凋亡指示因子Cleaved-Caspase 3及Bax蛋白表達(dá)水平降低，JunB和抗凋亡因子Bcl-2升高，miR-199a-5p過(guò)表達(dá)時(shí)，相關(guān)蛋白表達(dá)情況相反，提示miR-199a-5p過(guò)表達(dá)可靶向抑制JunB表達(dá)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-199a-5p可誘導(dǎo)心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡，可能與靶向抑制JunB表達(dá)有關(guān)。