李佳璐，董 媛，王 宇，張曉莉

DNA甲基化是目前研究最廣泛、最深入的表觀遺傳修飾形式。它能夠引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，調(diào)控基因表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[1]。研究表明，腫瘤抑制基因啟動(dòng)子和5 '區(qū)域的DNA 超甲基化是癌發(fā)生的早期事件[2]。婦科腫瘤方面，科研工作者們也在不斷進(jìn)行基因DNA甲基化方向的研究。Doorbar等[3]發(fā)現(xiàn)，宮頸癌的發(fā)生與某個(gè)或多個(gè)基因的啟動(dòng)子甲基化造成的基因表達(dá)缺失有著密切關(guān)系。PAX1基因是一種可以參與脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)生的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[4]，經(jīng)常因基因甲基化在宮頸癌中被沉默[5]。Lai等[6]發(fā)現(xiàn)，以PAX1為代表的一系列宮頸癌特異性甲基化基因在檢測(cè)CIN3級(jí)及以上的樣本時(shí)有較高的診斷價(jià)值。在針對(duì)亞洲人的多項(xiàng) Meta分析研究中，Kon等[7]也發(fā)現(xiàn)在宮頸刮片中行PAX1基因甲基化和HPV檢測(cè)的準(zhǔn)確性要高于單獨(dú)HPV檢測(cè)。2019年，我國(guó)部分地區(qū)已批準(zhǔn)PAX1基因甲基化檢測(cè)作為細(xì)胞學(xué)輔助檢測(cè)手段[8]。本研究旨在分析PAX1基因甲基化水平與宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)病變及HR-HPV分型之間關(guān)系，以及PAX1基因甲基化指導(dǎo)ASCUS患者分流中的臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2021-06至2022-03在解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科就診患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)自愿進(jìn)行PAX1基因甲基化檢測(cè)；(2)進(jìn)行機(jī)會(huì)性篩查者；(3)因?qū)m頸病變治療后隨訪以及評(píng)價(jià)療效者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)生殖系統(tǒng)惡性腫瘤及免疫系統(tǒng)疾病患者；(2)妊娠期；(3)就診時(shí)有下生殖道及外陰、陰道、宮頸等急性感染性疾病者或合并其他性傳播疾病患者。根據(jù)專家共識(shí)[9]，選取TCT結(jié)果異?！菀饬x不明的非典型鱗狀細(xì)胞(ASCUS)和(或)高危人類乳頭狀病毒(high-risk human papillmavirus DNA，HR-HPV)陽(yáng)性患者194例；根據(jù)陰道鏡應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)，轉(zhuǎn)診陰道鏡下取病理活檢的患者共130例。入組患者分別進(jìn)行液基薄層細(xì)胞檢測(cè)(Thinprep cytologic test，TCT)和人乳頭瘤病毒-DNA(HPV-DNA)分型檢測(cè)、定量PAX1基因甲基化檢測(cè)。研究對(duì)象平均年齡(40.62±4.90)歲；其中未見上皮內(nèi)細(xì)胞病變(no intraepithelial cell lesions were found，NILM)為21例，意義不明確的非典型鱗狀細(xì)胞(atypical squamouscells of undtermined significance，ASC-US)為45例，不除外高度鱗狀上皮內(nèi)病變(atypical squamous cells cannot exclude high grade intraepithelial lesion，ASC-H)為5例，或低度鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)為37例，高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)為22例；單一感染HPV16、18和非HPV16/18陽(yáng)性患者分別為43、30和85例。本研究經(jīng)解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：2021-D04-09)。入組患者均自愿參加該項(xiàng)臨床研究且已簽署相關(guān)知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 宮頸脫落細(xì)胞收集 非月經(jīng)期內(nèi)予以取材，紗布或棉球拭凈宮頸表面分泌物，取材刷于宮頸表面及宮頸管內(nèi)順時(shí)針充分旋轉(zhuǎn)10周，將刷到的組織脫落細(xì)胞移入細(xì)胞固定液的瓶?jī)?nèi)保存。

1.2.2 TCT檢測(cè) 采用新柏氏薄層細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行處理，病理科醫(yī)師閱片診斷。細(xì)胞學(xué)診斷報(bào)告參考2014年修訂的宮頸細(xì)胞學(xué)結(jié)果分級(jí)系統(tǒng)(the bethesda system，TBS)，結(jié)果分為正常(NILM)、不明意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASC-US)、非典型鱗狀細(xì)胞不除外高度病變(ASC-H)、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)。

1.2.3 HR-HPV DNA檢測(cè) 采用Cobas 4800檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行HR-HPV DNA檢測(cè)。

1.2.4 PAX1基因甲基化檢測(cè) 核酸提取試劑盒(OC130)提取宮頸刮片細(xì)胞中的基因組DNA(gDNA)，兩步法PCR擴(kuò)增，對(duì)提取gDNA進(jìn)行甲基化處理后，兩步法PCR制備測(cè)序文庫(kù)，并對(duì)測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行定量與質(zhì)控，最后經(jīng)定量的文庫(kù)采用基因測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序。甲基化評(píng)分算法：以本試劑盒提供DNA內(nèi)參，根據(jù)PAX1基因與內(nèi)參基因的Cp值，計(jì)算△Cp。其中，PAX1基因甲基化數(shù)值的大小將反映PAX1基因甲基化的程度，PAX1基因甲基化數(shù)值的高低與PAX1基因甲基化的程度呈反比(即△Cp值越小，PAX1基因甲基化程度越大)。

1.2.5 陰道鏡檢查 由同一名陰道鏡醫(yī)師完成陰道鏡檢查，可疑部位取材活檢；若未見明顯異常，則在宮頸3、6、9、12點(diǎn)多點(diǎn)活檢。宮頸管內(nèi)可疑病變，必要時(shí)行頸管內(nèi)膜診刮術(shù)(endocervical curettage，ECC)。病理切片由同一名病理科醫(yī)師判讀，另一名病理科醫(yī)師審核結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0 軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用 Shapiro-Wiilk(S-W)方法進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，測(cè)定指標(biāo)值均不符合正態(tài)分布，采用四分位數(shù)[中位數(shù)(25%，75%)]來進(jìn)行描述，組間差異采用非參數(shù)秩和，兩獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)方法為Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多樣本間兩兩比較的非參數(shù)檢驗(yàn)方法為Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 活檢患者的PAX1基因甲基化程度 采集130例完整資料，其中CIN3+患者的甲基化程度為18.21(17.56，18.66)，高于正常/宮頸炎[20.5(20.07，20.80)]、CIN1[20.41(20.19，20.72)]及 CIN2[20.21(19.77，20.42)]患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 ASCUS患者PAX1基因甲基化程度 TCT診斷為ASCUS患者，最終取得病理的為45例。其中正常/CIN1患者23例，CIN2+(CIN2、CIN3和宮頸癌)患者23例。正常/CIN1患者的PAX1基因甲基化數(shù)值的CP值為20.51(20.19，20.73)；CIN2+的患者PAX1基因甲基化CP值為18.87(17.80，20.26)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 不同類型HPV感染患者PAX1基因甲基化程度 選擇單一感染HPV16、HPV18和非HPV16/18陽(yáng)性患者，比較其PAX1基因甲基化程度。單一感染HPV16患者的PAX1基因甲基化程度為19.10(17.97，19.88)，單一感染HPV18患者的PAX1基因甲基化程度19.49(18.65，20.31)，均高于非HPV16/18陽(yáng)性20.33(20.00，20.50)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，HPV18陽(yáng)性與非HPV16/18陽(yáng)性患者間的PAX1基因甲基化程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。但單一HPV16陽(yáng)性與單一HPV18陽(yáng)性患者的PAX1基因甲基化數(shù)值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

HPV在人體正常宮頸上皮細(xì)胞中持續(xù)性感染是宮頸癌發(fā)生的主要誘因之一[10]。TCT整個(gè)檢測(cè)流程受到人為因素影響較大，可能會(huì)導(dǎo)致低估患者宮頸上皮內(nèi)病變的程度，或?qū)Ψ磻?yīng)性改變做出一系列過度診斷。HPV-DNA檢測(cè)有較高的靈敏度，但特異性不高[11]。這可能會(huì)導(dǎo)致過度治療[12-13]。故尋找不依賴于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察、診斷效能更高且簡(jiǎn)便易行的分子生物學(xué)篩查標(biāo)記物十分重要。Kelly和Fang等[14-15]研究發(fā)現(xiàn)，基因DNA甲基化與宮頸癌的發(fā)生和進(jìn)展有相關(guān)性。Liu等[16]也發(fā)現(xiàn)PAX1基因甲基化程度在宮頸癌患者中顯著高于其他宮頸病變患者。

本文研究結(jié)果顯示，PAX1基因甲基化數(shù)值高低與宮頸病變進(jìn)展程度有關(guān)，PAX1基因的甲基化水平隨著宮頸病變程度的加深而逐漸增高。高危型HPV感染后3～5年即可進(jìn)展為高級(jí)別病變，但由高級(jí)別病變進(jìn)展成宮頸癌可能需要20～30年[3]。這為臨床上我們進(jìn)行宮頸癌的早期篩查以及在癌前病變階段實(shí)行有效的干預(yù)措施提供了可能。

ASCUS是一種十分“令人頭疼”TCT檢測(cè)結(jié)果。2018年JAMA指南指出：在中國(guó)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查的患者中，有10%的結(jié)果診斷為ASCUS和LSIL[17]。ASCUS的患者需在6～12個(gè)月重復(fù)細(xì)胞學(xué)檢查，或利用HR-HPV DNA分流。但HPV-DNA檢驗(yàn)的特異性差，重復(fù)檢查浪費(fèi)醫(yī)療資源。本研究也發(fā)現(xiàn)，ASCUS患者中，CIN2+的PAX1基因甲基化數(shù)值顯著高于正常/CIN1。結(jié)果表明定量PAX1基因甲基化檢測(cè)有助于早期識(shí)別ASCUS宮頸高級(jí)別病變，也有助于降低ASCUS陰道鏡轉(zhuǎn)診率。

王文杰等[18]研究表明，感染最高風(fēng)險(xiǎn)致癌型HPV16/18陽(yáng)性比與非HPV16/18陽(yáng)性患者PAX1檢出率不同。筆者發(fā)現(xiàn)，其中單一HPV16陽(yáng)性、單一HPV18陽(yáng)性患者的PAX1基因甲基化的數(shù)值顯著高于非HPV16/18陽(yáng)性患者。推測(cè)HPV16/18的感染機(jī)制不同于非HPV16/18陽(yáng)性。高危型HPV16/18對(duì)于PAX1基因甲基化過程的的影響更大，且HPV16型強(qiáng)于HPV18型。國(guó)外研發(fā)了六基因(ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17 和 ZNF671)DNA甲基化標(biāo)記物組，發(fā)現(xiàn)它具有更高特異性和較高的靈敏度。目前該項(xiàng)檢測(cè)已被開發(fā)為GynTect，已于2015年9月獲得上海國(guó)際臨床檢驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)室設(shè)備展覽會(huì)(CEIVD)認(rèn)證[19]。相比于其它的宮頸癌DNA甲基化標(biāo)記物，如CADM1、MAL、miR124、FAM19A4、ZNF582、SOX1和NKX6-1，GynTect檢測(cè)顯示相似的靈敏度，且具優(yōu)勢(shì)的特異性[20]。

今后研究中，課題組將聯(lián)合應(yīng)用多基因甲基化檢測(cè)，組織前瞻性、大規(guī)模的臨床試驗(yàn)，進(jìn)行更深入的研究以尋找更好的生物學(xué)篩查標(biāo)記物。