沈璞，韓振國，張玉龍，霍宇琪

(山西醫(yī)科大學第三醫(yī)院·山西白求恩醫(yī)院·山西醫(yī)學科學院·同濟山西醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科，太原 030032)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，根據(jù)全球腫瘤流行病統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020年全球CRC新發(fā)病例占全部癌癥新發(fā)病例的10.0%，死亡病例占9.4%，分別位于所有惡性腫瘤的第三位和第二位[1]。目前，臨床對CRC的預后及相關(guān)治療策略主要依據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會和國際抗癌聯(lián)盟發(fā)布的TNM分期系統(tǒng)，然而長期臨床實踐發(fā)現(xiàn)，盡管處于相同的腫瘤組織學分期，患者的臨床結(jié)果仍可能出現(xiàn)顯著差異[2]。一些晚期癌癥患者可以保持病情穩(wěn)定多年，而大約25%的TNM Ⅰ～Ⅱ期CRC患者盡管進行根治性手術(shù)切除且無殘留腫瘤負荷或遠處轉(zhuǎn)移,仍會出現(xiàn)快速的腫瘤進展及死亡。這是由于傳統(tǒng)分期系統(tǒng)主要通過腫瘤細胞本身預測疾病進展，忽略了宿主整體的免疫狀況及腫瘤組織微環(huán)境特征的影響[3]。研究證實，腫瘤的免疫環(huán)境(即免疫細胞的類型、功能定位、密度和位置)可能是臨床結(jié)果的決定性因素[4]。基于此，有學者提出了免疫評分(immunoscore，IS)系統(tǒng)，即通過免疫組化技術(shù)對腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞進行量化分析，從而預測患者的生存周期[5]。目前，國內(nèi)外多項研究證實，IS系統(tǒng)對CRC患者預后的預測及療效評估有重要作用。本文將重點闡述IS系統(tǒng)在CRC中的研究進展。

1 IS系統(tǒng)

目前認為，腫瘤的進展是侵襲性過程和宿主防御系統(tǒng)之間動態(tài)作用的結(jié)果，臨床上所表現(xiàn)出的癌癥均提示免疫系統(tǒng)無法單獨消除或控制腫瘤細胞，并進入到“免疫逃逸”階段。因此，為了控制腫瘤的繼續(xù)進展和擴散，免疫細胞在腫瘤腺體、周圍基質(zhì)、腫瘤浸潤邊緣和腫瘤附近形成的第三級淋巴結(jié)構(gòu)進行免疫過濾[3]。早在1986年Jass[6]便首次提出，直腸腫瘤高淋巴細胞浸潤是獨立于TNM分期的良好預后因素。隨后這一結(jié)果在更多的實體瘤中得到證實，且隨著簇分化抗原識別技術(shù)的發(fā)展與革新，進一步被用于鑒別和計數(shù)腫瘤部位的淋巴細胞亞群[7]。研究發(fā)現(xiàn)，由于腫瘤內(nèi)免疫浸潤的異質(zhì)性，CRC中腫瘤中心(tumor center, CT)和腫瘤浸潤邊緣(invasive margin, IM)區(qū)域的免疫細胞群密度與患者的無病生存率(disease-free survival，DFS)和總生存率(overall survival，OS)呈顯著相關(guān)性，且將這兩個腫瘤區(qū)域免疫細胞密度相結(jié)合，可進一步提高預后準確性[8]。因此，有學者將與腫瘤患者DFS和OS相關(guān)的各種獲得性免疫因素統(tǒng)稱為“免疫結(jié)構(gòu)”，即獲得性免疫細胞在不同腫瘤區(qū)域的類型、功能定位、密度和位置[4]。免疫結(jié)構(gòu)主要由CT及IM中的CD8+細胞毒性T淋巴細胞和記憶T細胞、第三級淋巴結(jié)構(gòu)、輔助T細胞相關(guān)因子(干擾素γ重組蛋白、T盒轉(zhuǎn)錄因子、干擾素調(diào)節(jié)因子1、白細胞介素12)以及趨化因子等構(gòu)成[5]。在此基礎(chǔ)上，Mlecnik等[9]提出了IS這一概念,即通過量化腫瘤免疫結(jié)構(gòu)中的T細胞和細胞毒T細胞密度來預測患者預后情況。

一項納入602例CRC患者的大型回顧性隊列研究對腫瘤區(qū)域(CT和IM)中CD8+、CD3+和CD45RO+進行染色分析后發(fā)現(xiàn)，高免疫浸潤及低免疫浸潤患者5年復發(fā)率(4.8%和75%，P<0.000 1)及死亡率(13.8%和72.5%,P<0.000 1)有顯著差異[10]。其中，CD45RO+記憶T細胞密度與CD3+T細胞密度高度重疊，但由于CD45RO+腫瘤切片背景染色和抗原性極易丟失，其被排除在分析之外。最終，IS系統(tǒng)主要通過CT和IM區(qū)域中CD3+和CD8+淋巴細胞群體的計數(shù)進行評分。隨后，為促進IS系統(tǒng)應用于臨床，Pagès等[11]建立了標準化的檢驗方法：將相關(guān)CRC組織制作成石蠟組織切片，用免疫組織化學法對CD3+及CD8+進行染色，并使用專用圖像分析軟件(Immunoscore?Analyzer)對CT和IM中的CD3+和CD8+細胞密度進行檢測和量化，根據(jù)平均密度百分位數(shù)對IS進行分類，IS=0～1分為低CD3+和CD8+淋巴細胞浸潤(0～25%)；IS=2分為中度CD3+和CD8+淋巴細胞浸潤(25%～75%)；IS=3～4分為高度CD3+和CD8+淋巴細胞浸潤(75%～100%)。

2 IS系統(tǒng)在CRC中應用的研究進展

2.1 對不同分期CRC預后的指導作用

2.1.1 局限性CRC 為進一步驗證IS系統(tǒng)在臨床中的可行性及其評估預后的具體效能，由美國癌癥免疫治療學會(society for immunotherapy of cancer，SITC)牽頭組成的國際聯(lián)盟對TNM Ⅰ～Ⅲ期(即未發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移)的局限性結(jié)腸癌患者的IS進行的回顧性研究發(fā)現(xiàn)：(1)IS對患者DFS和OS的預測價值明顯優(yōu)于現(xiàn)有的腫瘤預后風險參數(shù)，如TNM分期、微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)狀態(tài)、血管淋巴神經(jīng)侵犯及腫瘤分化程度等；(2)IS可作為預測局限性結(jié)腸癌復發(fā)時間的獨立預測因子，高IS的患者5年復發(fā)風險最低(高、中和低IS組患者的5年復發(fā)率分別為8%、19%和32%，P<0.000 1)；(3)IS能有效預測II期局限性結(jié)腸癌高危及低?；颊撸M一步證實了將免疫參數(shù)納入當前TNM分期的可能性，可作為后續(xù)結(jié)腸癌患者預后的一個強有力的分層工具[11。隨后，多項多中心國際研究均證實了IS系統(tǒng)在預測局限性結(jié)腸癌患者復發(fā)風險、DFS和OS等方面的可行性、可重復性、有效性和穩(wěn)定性[12-14]。Zeitoun等[15]及Anitei等[16]對局限性直腸癌患者預后的研究表明，IS與DFS和OS顯著相關(guān)(均P<0.005)，且在預測復發(fā)率及生存率方面明顯優(yōu)于TNM分期。2019年突尼斯醫(yī)院對106例局限性CRC患者預后標志物的研究表明，IS同樣適用于非洲及阿拉伯CRC人群[17]。

2.1.2 轉(zhuǎn)移性CRC CRC肝轉(zhuǎn)移瘤的切除會顯著提高患者長期存活率，并提供了治愈的可能性。然而，經(jīng)切除轉(zhuǎn)移治療的患者腫瘤復發(fā)率為70%，其中一半復發(fā)將是致命的[18]。對轉(zhuǎn)移瘤標本的分子病理表現(xiàn)和免疫參數(shù)的分析或可為腫瘤的侵襲性及治療效果評估提供重要信息。一項針對105例接受完全根治性轉(zhuǎn)移切除的IV期CRC患者所有轉(zhuǎn)移瘤的研究發(fā)現(xiàn)，同一患者的轉(zhuǎn)移瘤均為異質(zhì)性浸潤，且對治療的反應各不相同，其中獲得病理和放射學應答的轉(zhuǎn)移灶發(fā)生免疫高浸潤頻率明顯更高。浸潤最少的轉(zhuǎn)移瘤的IS與患者預后的相關(guān)性最強，且IS具有高特異性，能正確識別≥90%低免疫浸潤患者[19]。盡管如此，由于腫瘤的高轉(zhuǎn)移異質(zhì)性，要準確識別高度浸潤的患者仍需要評估多個活檢[20]。在涉及轉(zhuǎn)移性切除術(shù)后相關(guān)臨床病理因素的多變量分析中，IS仍是影響DFS和OS的唯一有統(tǒng)計學意義的參數(shù)(P<0.001)，且效果優(yōu)于當前腫瘤回歸分級等臨床病理因素。最新一項針對CRC肝轉(zhuǎn)移瘤的研究表明，IS是影響復發(fā)時間和OS的主要預后因素，同時證實了適應性免疫反應在預防轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(metastatic colorectal cancer, mCRC)腫瘤復發(fā)中的重要作用[21]。自然免疫和記憶T細胞的持久能力以及免疫編輯的作用可能對患者的生存起著核心作用，這也為后續(xù)免疫治療提供進一步支持，即把調(diào)節(jié)原有的免疫狀況作為癌癥治療的基礎(chǔ)。

總之，無論是在局限性或轉(zhuǎn)移性腫瘤中，還是在完全切除的腫瘤標本或腫瘤活檢中，對免疫浸潤的評估都提供了大量的預后信息。臨床可通過IS預測CRC患者的預后，對患者進行個性化管理。為了將IS的應用擴展到其他實體腫瘤中，目前正在進行一些泛癌癥研究(臨床試驗NCT01688232和NCT02274753)，以評估IS在多種實體惡性腫瘤中的預后價值。

2.2 IS系統(tǒng)對免疫治療的指導作用

IS不僅能有效指導CRC患者預后，還可識別從免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitor, ICI)治療中獲益的患者。在對接受奧沙利鉑、氟尿嘧啶加貝伐珠單抗和不加貝伐珠單抗治療的mCRC患者的兩項隨機Ⅲ期試驗的回顧性分析中發(fā)現(xiàn)，微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定(microsatellite instability-high, MSI-H)腫瘤患者的IS顯著高于其他人群(P≤0.000 1)，IS可作為錯配修復功能缺陷(deficient mismatch repair, dMMR)mCRC的生物標志物[22]。然而只有5%的mCRC患者是dMMR/MSI-H，由于缺乏足夠的臨床益處，目前暫無免疫療法被批準用于錯配修復功能完整(proficient mismatch repair, pMMR)或微衛(wèi)星穩(wěn)定性(microsatellite stable, MSS)的腫瘤。單一ICI對pMMR mCRC尚未顯示出臨床獲益，然而目前多項臨床試驗均證明通過使用不同類型免疫療法進行組合(癌癥疫苗、雙特異性抗體、抗淋巴細胞活化基因-3單抗、抗轉(zhuǎn)化生長因子β等)可打破腫瘤耐藥性[22]，因此迫切需要一個精確可靠的生物標志物來預測患者對這些特定治療的反應。Mlecnik等[23]研究發(fā)現(xiàn)，MSI早期腫瘤患者可從T細胞免疫激活療法中獲益最多，并且更頻繁地出現(xiàn)與程序性死亡受體1表達增強相關(guān)的高IS，且高IS的MSI及MSS患者可從T細胞療法中受益。隨后，一項對40例dMMR CRC和pMMR CRC患者(Ⅰ～Ⅲ期)療效評價的研究表明，治療后dMMR腫瘤均出現(xiàn)顯著腫瘤退縮，而只有少數(shù)PMMR腫瘤出現(xiàn)腫瘤退縮，且無病理反應患者的IS明顯較低[24]。IS可對免疫療法獲益患者進行預測和分層，并通過指導新輔助免疫治療進一步改善早期CRC患者預后。

2.3 IS系統(tǒng)對輔助放化療的指導作用

SITC一項針對763例Ⅲ期結(jié)腸癌患者IS的研究表明，只有中或高IS的患者對化療有反應，且相較于未接受化療的患者擁有更長的生存期(P=0.001)。相反，低IS的患者無論處于低危組(T1-3和/或N1)還是高危組(T4和/或N2)，均未從化療中明顯受益[15]。隨后一項3期臨床試驗評估了接受FOLFOX(氟尿嘧啶+亞葉酸鈣+奧沙利鉑)或卡培他濱+奧沙利鉑輔助治療3或6個月的Ⅲ期結(jié)腸癌患者的非劣效性[25]，發(fā)現(xiàn)無論是在低危組還是高危組，中或高IS的患者均能從6個月治療中明顯受益(HR=0.53，95%CI0.37～0.75；P=0.000 4)，而低IS的患者不但未能從FOLFOX治療中受益，且同時面臨復發(fā)風險增高的危險。

直腸癌目前主要通過全直腸系膜切除手術(shù)及新輔助放化療(neoadjuvant chemoradiotherapy, nCRT)等聯(lián)合治療策略減少局部復發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移。大約20%的局部進展期直腸癌(locally advanced colon cancer，LARC)患者在nCRT后獲得完全的病理反應(即無殘留腫瘤)，這種狀態(tài)與遠處和局部復發(fā)的低風險相關(guān)[26]。因此，Jones等[27]提出一種“觀察等待”的保守治療策略，以避免根治性手術(shù)、術(shù)后并發(fā)癥和術(shù)后短期較差的生活質(zhì)量。盡管有專家提出部分腫瘤組織或血液中的分子生物標記物可作為nCRT療效的預測指標，但均未進入臨床階段[28]?？紤]到nCRT引起的結(jié)構(gòu)和組織學變化不能通過經(jīng)典IS進行評估，有學者提出在nCRT前對組織進行診斷性活檢免疫評分(immunoscore in initial diagnostic biopsies, ISB)，以評價初始免疫浸潤情況。一項納入249例接受nCRT治療后行根治性手術(shù)的LARC患者的多中心隊列研究表明，ISB水平與nCRT的組織學反應程度相關(guān)(P<0.001),80%～90%低水平ISB患者的nCRT治療效果差。ISB結(jié)合放化療后的T分期，可提高對病理組織學良好反應者(TNM 0-I)預測的準確性。并且在nCRT后臨床完全緩解(TNM 0)的“觀察等待患者”(n=73)隊列中，證實了復合生物標記物的臨床實用性。在隨訪期間，ISB高的患者未觀察到復發(fā)[29]。因此，ISB可能作為一種新的標志物用于臨床篩選符合觀察和等待策略的患者。此外，ISB同樣還可用于預測LARC患者對其他治療方法的反應，如輔助化療、完全新輔助治療或大劑量CRT[30,31]。

3 總結(jié)與展望

最新的第5版世界衛(wèi)生組織消化系統(tǒng)腫瘤分類中首次提出“免疫反應可作為CRC基本和理想的診斷標準”，并支持將IS引入到傳統(tǒng)TNM分期，即TNM-I分期[32]，這是第一個基于患者免疫狀況的標準化癌癥分類方法。IS不但可以為CRC患者提供更準確的預后信息，還可對從輔助化療中受益的患者進行分層，在活檢的IS基礎(chǔ)上識別可能對新輔助治療有反應并符合非侵入性治療策略的直腸癌患者。同時，IS也可以作為評估免疫療法反應的強有力工具。未來，有必要在更多腫瘤中驗證IS的預測效能，增強其作為生物標志物進入臨床的可能性。