雷乾 ，劉娜，趙俊芳，孫鵬 ，盧曾軍，李志勇

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056021；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046；3.溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035）

塞內(nèi)卡病毒A 型是導(dǎo)致豬傳染性豬塞內(nèi)卡病毒病的主要病原，該病毒于2015 年在不改變病毒名稱的情況下由國際病毒分類委員會(huì)（ICTV）允許將種名稱由“Seneca valley virus”改為“Seneca virus A”。SVA 病毒是2002 年首次在美國的一家公司進(jìn)行腺病毒培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜母細(xì)胞上偶然發(fā)現(xiàn)的一種病毒，并猜想其可能來源于豬胰蛋白酶體或胎牛血清中，且在2005 年確定了第一個(gè)完整的基因組序列。塞內(nèi)卡病毒A（Seneca virus A，SVA）為單股、正鏈、無囊膜的小核糖核酸病毒科，是塞內(nèi)卡病毒屬唯一代表性的病毒株，最近研究發(fā)現(xiàn)該病毒是與心臟病毒屬成員密切相關(guān)的單鏈RNA 病毒，是一種能在人的癌細(xì)胞中復(fù)制的一種溶瘤性微小RNA 病毒，因此目前有研究將SVA 作為一種溶瘤病毒用于治療某些人類神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。

2002～2013 年期間，SVA 在美國和加拿大呈散狀發(fā)生；在2007 年的美國部分區(qū)域一些豬的口鼻和蹄冠部出現(xiàn)水泡、潰瘍等癥狀，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室檢測判定為SVA 陽性，養(yǎng)殖行業(yè)的人們這才開始關(guān)注SVA 病毒帶來的危害；2014 年巴西有大量的SVA 病例發(fā)生，由該病毒引起新生仔豬死亡率在30%～70%，從那以后這種疾病在養(yǎng)豬業(yè)中逐漸受到重視；同年11 月，北美地區(qū)暴發(fā)SVA 疫情的數(shù)目逐漸增多，廣東省首次于2015年5 月出現(xiàn)SVA 引起的豬水皰病，并開始擴(kuò)散，湖北省在2016 年開始涌現(xiàn)散發(fā)個(gè)案，2016 年12 月份黑龍江分離到塞內(nèi)卡毒株。截至2019 年12 月，在廣東、河南、湖北、黑龍江等地已經(jīng)報(bào)道了由SVA 引起的豬水泡病疫情，且SVA 毒株在不停的變異。SVA 臨床癥狀和口蹄疫病癥十分相似難以區(qū)分，對(duì)仔豬的危害性較大并給畜牧業(yè)帶來巨大的財(cái)產(chǎn)損失。本文對(duì)塞內(nèi)卡病毒臨床特征和檢測技術(shù)進(jìn)行綜述，以期為SVA 病毒檢測防控提供技術(shù)參考。

1 臨床特征

SVA 感染豬后，育肥豬、經(jīng)產(chǎn)母豬和公豬在鼻腔和口腔有潰瘍，鼻部和冠狀動(dòng)脈束帶上有紅色聚集性侵蝕和破裂的小泡，偶見發(fā)燒跛行及腹瀉，仔豬在出生后的第一周表現(xiàn)出肌肉無力、嗜睡、流涎過多、皮膚充血、消瘦，神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)和腹瀉等臨床癥狀；一些仔豬發(fā)生急性死亡。臨床癥狀持續(xù)3～10 天，然后在存活的仔豬中消失。

2 塞內(nèi)卡診斷技術(shù)

2.1 SVA 病毒的分離與鑒定

分離病毒時(shí)采集的樣品組織應(yīng)為病變明顯的部位，SVA 病毒應(yīng)采集食道和眼部的分泌物，頜下淋巴結(jié)，水泡液及水泡皮去進(jìn)行體外的分離培養(yǎng)，用于SVA 培養(yǎng)的細(xì)胞系包括人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞（PER-C6），豬睪丸細(xì)胞（ST）等，病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病變作用（CPE）可作為病毒感染的直接指標(biāo)，而SVA 的CPE 需要較長的時(shí)間，并且必須具備相關(guān)的知識(shí)積累和實(shí)驗(yàn)技能才能作出判斷，所以SVA 病毒在細(xì)胞上的分離鑒定來確診不是便捷有效的方法。

2.2 SVA 病毒的原位雜交和免疫組化

SVA 診斷可以通過原位雜交（ISH）和免疫組織化學(xué)（IHC）檢測組織中的抗原或核酸來實(shí)現(xiàn)，也可用于檢測組織樣本中的病原體可以顯示病原微生物在組織細(xì)胞內(nèi)的定位與分布。原位雜交技術(shù)最早由Pardue 和Gall、John 于1969年建立，它的原理是利用核酸的特性（即它們彼此特異性退火形成雜合體的能力）在細(xì)胞內(nèi)鑒定特定序列，將這些特定序列的DNA 或RNA 定位到特定細(xì)胞或染色體位點(diǎn)。Resende 等，在2017 開發(fā)了一種新的原位雜交技術(shù)——RNAscope （ISH）來檢測感染組織中的SVA 的RNA，通過靶向VP1 基因區(qū)域的特定RNA 探針來確認(rèn)水皰病變中的病毒，并表現(xiàn)出高水平的特異性。這種新穎的原位雜交平臺(tái)將SVA 和組織學(xué)病變聯(lián)系起來，補(bǔ)充了qRT-PCR 作為一種診斷技術(shù)來研究潛在的新興病原體。Leme 等人對(duì)死后不久的仔豬進(jìn)行常規(guī)尸檢，組織通過浸入10% 緩沖福爾馬林溶液中進(jìn)行固定，并進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)估，選擇來自口腔囊泡和皮膚損傷的組織切片用于免疫組織化學(xué)（IHC）測定，該測定采用單克隆抗體技術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄PCR 測定出腹瀉仔豬小腸中的SVA，證明了SVA 在腸上皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的能力。

原位雜交技術(shù)的缺點(diǎn)是難以識(shí)別具有低DNA 和RNA 拷貝的靶標(biāo)，雖然免疫組織化學(xué)可以通過檢測與組織學(xué)病變相關(guān)的抗原來克服這一問題，但它需要特定的抗體，而這些抗體獲取需要一定難度并且特異性和敏感性較差。

2.3 分子生物學(xué)診斷

2.3.1 PCR

這項(xiàng)名為聚合酶鏈反應(yīng)即PCR 技術(shù)，能在短時(shí)間內(nèi)高效地?cái)U(kuò)增基因或特定核酸序列，廣泛應(yīng)用于傳染病、腫瘤、法醫(yī)學(xué)、寄生蟲病、動(dòng)物和考古學(xué)等領(lǐng)域的診斷和研究，PCR 法檢測SVA病毒也是一種實(shí)驗(yàn)室常用的方法。Leme 等設(shè)計(jì)了一套引物以在RT-PCR 測定中擴(kuò)增塞內(nèi)卡病毒基因組VP3/VP1 區(qū)域的542 bp 產(chǎn)物大?。环痘鄣仍诜治隽薙VA 的基因組后在5’UTR 和3D基因區(qū)域設(shè)計(jì)了三對(duì)PCR 引物并篩選出最合適引物對(duì)，通過優(yōu)化擴(kuò)增體系和條件最終建立了RT-PCR 檢測方法。

2.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

熒光定量PCR 是在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中加入熒光報(bào)告基團(tuán)，在PCR 反應(yīng)的每個(gè)周期通過收集熒光信號(hào)的產(chǎn)生來進(jìn)行監(jiān)測。因此，出色的靈敏度和特異性、可重復(fù)的數(shù)據(jù)、低污染風(fēng)險(xiǎn)和減少的手動(dòng)操作時(shí)間（無需進(jìn)行PCR 后分析）相結(jié)合，使實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)成為傳統(tǒng)PCR 的有力的替代品。林彥星等依據(jù)SVA 病毒上3D基因序列在軟件中設(shè)計(jì)最佳引物和探針，創(chuàng)建了檢測SVA 的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 法，該方法可檢測較低的敏感性；重復(fù)性好。陳鑫等根據(jù)對(duì)國內(nèi)18 株塞內(nèi)卡病毒的序列比對(duì)分析結(jié)果，在SVA的5’UTR 區(qū)域設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物和Taqman 探針，采用Taqman 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立定量檢測SVA 的方法。

2.3.3 數(shù)字PCR

微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）是按照將含有核酸分子的反應(yīng)體系等分到大量獨(dú)立的反應(yīng)單元去進(jìn)行擴(kuò)增，目的核酸分子的絕對(duì)定量分析是根據(jù)陽性比例和泊松分布原理去計(jì)算的。數(shù)字PCR 消耗品成本較低，不存在已知濃度的參考物質(zhì)，與實(shí)時(shí)PCR 相比，在低濃度下目標(biāo)定量的精確度以及對(duì)不同類型樣品的抑制劑的高抗性，ddPCR 在油相中產(chǎn)生液滴，可以避免液滴之間的非特異性擴(kuò)增和交叉污染。除了用作診斷工具外，RT-ddPCR 還用于評(píng)估本項(xiàng)目的生物樣本，以便在不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況下提供SVA RNA 的絕對(duì)定量。Oliveira 等研究表明ddRTPCR 在測試豬血清時(shí)，其性能優(yōu)于RT-PCR，單步RT-ddPCR 和RT-qPCR。ddRT-PCR 用作SVA 的輔助診斷工具和生物樣品中病毒RNA的絕對(duì)定量，是水皰疾病控制計(jì)劃的有效工具。張洲等建立了一種檢測SVA 病毒3D 基因的逆轉(zhuǎn)錄微滴數(shù)字PCR （RT-ddPCR）的方法，該檢測方法的靈敏度比逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR 檢測方法高約10 倍，特異性實(shí)驗(yàn)表明與其他豬水皰病病原體無任何交叉反應(yīng)。

2.3.4 巢式PCR

巢式PCR 是指先后利用2 套PCR 引物進(jìn)行擴(kuò)增的PCR 技術(shù)。Feronato 等設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物對(duì)SVA 的VP1 基因組片段進(jìn)行擴(kuò)增。在對(duì)18頭的豬群進(jìn)行RT-PCR 和巢式PCR 檢測時(shí)陽性率分別為11 頭（61.1%）和16 頭（88.9%）結(jié)果表明，與常規(guī)的RT-PCR 相比，巢式PCR 是巢式PCR 是一種靈敏、高效、簡單、經(jīng)濟(jì)的診斷方法；因此，巢式PCR 可以用作一種有效的診斷工具。

2.4 血清學(xué)檢測方法

2.4.1 病毒中和試驗(yàn)

病毒中和試驗(yàn) （Virus Neutralization Assay）是一種血清學(xué)試驗(yàn)，用于檢測阻止病毒傳染性的功能性全身抗體的存在和數(shù)量，是病毒學(xué)的經(jīng)典方法之一。VNT 檢測是一種高度敏感和特異的檢測方法，該方法是基于在血清中存在中和抗體的情況下抑制細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒感染性。作為SVA 感染的診斷，常規(guī)VNT 的特異性和敏感性均略高于競爭性ELISA。劉福曉等使用反向遺傳學(xué)構(gòu)建了重組SVA CH-LX-01-2016，并被證明能夠在體外有效表達(dá)增強(qiáng)的綠色熒光蛋白（eGFP），這種熒光的跟蹤特性極大地促進(jìn)了病毒中和試驗(yàn)（VNT）的檢測效果。在此研究中，這種新方法比使用傳統(tǒng)方法更敏感和特異性，因?yàn)椴《局泻蛯?shí)驗(yàn)的最終結(jié)果將取決于綠色熒光蛋白，這種新型VNT 可廣泛用于臨床診斷。

2.4.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

通過使用酶標(biāo)記的偶聯(lián)物和酶底物獲得的顏色變化來顯示抗原-抗體反應(yīng)并用于識(shí)別生物體液中分子的存在和濃度的定量分析方法通常被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），主要包括液相阻斷ELISA、固相競爭ELISA、間接ELISA等，可按照不同的檢測要求去進(jìn)行選擇；孫培培等利用塞內(nèi)卡的重組VP2 蛋白及其相應(yīng)的辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的單克隆抗體，建立了檢測SVA 抗體的阻斷ELISA 方法；柴茂等建立基于VP2 蛋白、VP3 蛋白檢測豬塞內(nèi)卡病毒A 抗體間接ELISA 方法；Goolia 等開發(fā)了競爭性酶聯(lián)免疫吸附測定（eELISA）作為SVA 抗體的篩選，這些試驗(yàn)都可適用于檢測豬SVA 的臨床診斷。

3 其他新型檢測技術(shù)

3.1 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

基于核酸的技術(shù)被認(rèn)為是遺傳學(xué)診斷中最準(zhǔn)確的工具。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)就是其中之一，近年來得到了廣泛的應(yīng)用。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于快速、高效、靈敏、經(jīng)濟(jì)，它在等溫條件下工作，并使用具有鏈置換活性的DNA 聚合酶擴(kuò)增目標(biāo)基因。迄今為止，該方法已廣泛應(yīng)用于病原體檢測、作物生長發(fā)育和疾病診斷等不同研究領(lǐng)域。

田瑤等針對(duì)SVA 高度保守區(qū)域，設(shè)計(jì)了5對(duì)特異性LAMP 引物，并通過反應(yīng)條件優(yōu)化、敏感性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)以及臨床樣本檢測，建立了一種新型塞內(nèi)卡病毒LAMP 可視化快速檢測方法，曾凡文等特異性擴(kuò)增了SVA 的VP1 和VP2 區(qū)域用于開發(fā)實(shí)時(shí)RT-LAMP 的方法,該實(shí)驗(yàn)證明實(shí)時(shí)RT-LAMP 比實(shí)時(shí)RT-PCR 的結(jié)果更優(yōu)越。

3.2 RPA

重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）是一種高靈敏度和選擇性的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在37℃～42℃條件下工作，樣品制備要求低，能夠在不到20 分鐘的時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增低至1～10 個(gè)DNA 靶標(biāo)。它已被用于擴(kuò)增來自各種生物體和樣品的各種靶標(biāo)，包括RNA，miRNA，ssDNA 和dsDNA。此外，RPA 可以與不同的檢測策略結(jié)合，從側(cè)流層析試紙條到實(shí)時(shí)熒光檢測等。王慧寶等開發(fā)了一種簡單、快速和準(zhǔn)確的診斷方法，結(jié)合重組酶聚合酶擴(kuò)增和側(cè)向流動(dòng)試紙條 （RPA-LF）來檢測SVA 感染，結(jié)果可直接在試紙條上觀察到。林彥星等建立了一種熒光RT- RPA 快速檢測法具有特異性強(qiáng)，簡便快速，重復(fù)性好，靈敏度高，比實(shí)時(shí)熒光RTPCR 法靈敏度低兩個(gè)數(shù)量級(jí)的特點(diǎn)。

4 討論與展望

SVA 的天然宿主是豬且與豬的水皰病緊密相關(guān)，對(duì)仔豬的危害較大給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，臨床上的病癥無法和口蹄疫區(qū)分開來，需要立即去進(jìn)行排除診斷，中國的SVA 病例在多省份零星發(fā)生。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，SVA 的診斷技術(shù)已經(jīng)日益成熟，朝著更快速、準(zhǔn)確、便捷的方面發(fā)展。目前已經(jīng)開發(fā)了各種診斷方法，從病毒分離實(shí)驗(yàn)到競爭性和封閉抗原的ELISA 等常規(guī)方法到RT-PCR 和RT-LAMP 等基于分子的方法。盡管基于ELISA 的方法具有良好的診斷靈敏度和特異性，但分子檢測方法的優(yōu)勢在于檢測最小病毒RNA 具有更高的分析靈敏度。盡管有這些準(zhǔn)確和可靠的SVA 檢測方法，研究人員一直在開發(fā)替代方法，以嘗試克服一些實(shí)際挑戰(zhàn)，例如繁瑣的程序和配備訓(xùn)練有素的現(xiàn)場人員的設(shè)備齊全的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，開發(fā)了橫向流動(dòng)裝置并將便攜式RT-PCR、RT-LAMP 和RT-RPA 與LF 技術(shù)相結(jié)合，以提高SVA 檢測的靈敏度。然而，這些檢測從實(shí)驗(yàn)室到現(xiàn)場實(shí)際應(yīng)用的轉(zhuǎn)化仍然有限，需要解決各種技術(shù)和成本問題，以開發(fā)一種更靈活、更實(shí)惠的診斷工具，可廣泛用于SVA 檢測。