◎薛 磊

（山西開(kāi)放大學(xué)，山西 太原 030000）

當(dāng)前，我國(guó)的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，為了滿(mǎn)足消費(fèi)需求，市場(chǎng)中的食品類(lèi)型越來(lái)越多樣化。為了保障食品安全，必須強(qiáng)化食品質(zhì)量安全檢測(cè)工作，而食品微生物含量檢測(cè)是食品檢測(cè)工作中的重要組成部分，因?yàn)橹T多食物腐爛變質(zhì)的原因就在于微生物含量超標(biāo)，一旦食用，極易損害人體健康，甚至威脅生命，所以必須針對(duì)食品微生物進(jìn)行有效檢測(cè)。在此過(guò)程中建議應(yīng)用PCR 技術(shù)，因?yàn)槠渚哂懈咝院蜏?zhǔn)確性的特點(diǎn)，可以有效提升食品微生物檢測(cè)工作的質(zhì)量和效率[1]。

1 PCR 技術(shù)

1.1 概念和原理

PCR 技術(shù)誕生于1985 年，一經(jīng)問(wèn)世即成為基因工程中的主要技術(shù)手段之一，食品微生物檢測(cè)工作也因此更加便捷和有效。當(dāng)前，我國(guó)對(duì)于PCR 技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)發(fā)展至針對(duì)各類(lèi)日常食品的微生物含量進(jìn)行檢測(cè)。PCR 技術(shù)的基本原理如下：在PCR 體系下加熱食物，如果食物中含有微生物，則相應(yīng)的核酸序列能夠受到溫度變化影響，出現(xiàn)變形情況。通常情況下，PCR 體系投入應(yīng)用的初始階段，可以將其溫度調(diào)節(jié)至94 ℃，微生物DNA 能在此溫度環(huán)境下裂解成為單鏈，但是需要注意對(duì)PCR 體系中的溫度進(jìn)行合理控制，若溫度過(guò)高，則會(huì)直接殺死微生物。在微生物DNA 裂解成為單鏈以后，再進(jìn)行降溫處理，將PCR 體系溫度調(diào)節(jié)至55 ℃，之后再調(diào)節(jié)至72 ℃，使引物與模板DNA 結(jié)合，DNA 聚合酶則可合成新DNA 鏈，之后反復(fù)進(jìn)行上述步驟，確認(rèn)檢測(cè)對(duì)象中有無(wú)特異性DNA 片段，即可確定食品中有無(wú)微生物以及微生物含量。同時(shí)，特異性引物只能在微生物上生長(zhǎng)，且檢測(cè)便捷性大于微生物，所以應(yīng)用PCR 技術(shù)的便捷性和準(zhǔn)確性均更高[2]。

1.2 原料

在應(yīng)用PCR 技術(shù)的過(guò)程中，需要應(yīng)用的原料主要包括引物、dNTPs、DNA 聚合酶、緩沖液、Mg++、核酸模板。

2 以PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法

PCR 技術(shù)當(dāng)前已經(jīng)在食品微生物檢測(cè)工作中得到了廣泛應(yīng)用，可針對(duì)綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等多種微生物進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，還可對(duì)食品樣品中的物質(zhì)進(jìn)行微量檢測(cè)工作，可精確至1 pg[3]?？梢?jiàn)PCR 技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中，能夠呈現(xiàn)較高的應(yīng)用價(jià)值。以此為基礎(chǔ)，將PCR 技術(shù)實(shí)際應(yīng)用于食品微生物檢測(cè)工作中，可以根據(jù)其主要形式劃分為不同的檢測(cè)方法。

2.1 常規(guī)PCR 檢測(cè)法

將目標(biāo)物質(zhì)相應(yīng)的DNA 模板以及引物混合，再加入適量聚合酶。在適宜的溫度環(huán)境和催化條件下，聚合酶可以加速目標(biāo)物質(zhì)DNA 模板序列的擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)數(shù)次DNA 復(fù)制，即可獲取DNA 片段，且這一DNA 片段即循環(huán)DNA 模板，可繼續(xù)復(fù)制和擴(kuò)增。將目標(biāo)物質(zhì)放大以后，針對(duì)其中的特定DNA 開(kāi)展標(biāo)記測(cè)定工作，即能夠獲取物質(zhì)中的微生物含量。

2.2 多重PCR 檢測(cè)方法

將多個(gè)模板與多條引物混合于同一反應(yīng)體系中，并分別進(jìn)行特異擴(kuò)增，形成不同的目的條帶，或是單一模板DNA 與多條引物在一個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中，針對(duì)同一模板中的不同片段進(jìn)行擴(kuò)增，也可針對(duì)超長(zhǎng)片段實(shí)施擴(kuò)增處理[4]。相對(duì)于常規(guī)形式的PCR 檢測(cè)方法，其能夠呈現(xiàn)產(chǎn)物特異性高、擴(kuò)增效率高以及經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，適用于食品檢測(cè)工作中多種致病菌的檢測(cè)。

2.3 PR-PCR 檢測(cè)方法

該檢測(cè)方法屬于常規(guī)PCR 檢測(cè)方法的變形，首先針對(duì)檢測(cè)目標(biāo)中的一條RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄并獲取能夠與其互補(bǔ)的DNA，然后將DNA 鏈作為模板，使用常規(guī)PCR 技術(shù)擴(kuò)增復(fù)制DNA。在這一過(guò)程中，難點(diǎn)為RNA的逆轉(zhuǎn)錄，必須保障RNA 模板處于完整狀態(tài)，并且其中不可含有雜質(zhì)（如DNA、蛋白質(zhì)等）[5]。

3 PCR 技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

PCR 技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確率高的特點(diǎn)，因此得到了迅速發(fā)展。同時(shí)，應(yīng)用范圍不斷得到拓展，不僅能夠在基因篩選、基因克隆、制備特異探針和基因表達(dá)調(diào)控等方面進(jìn)行應(yīng)用，而且當(dāng)前已在農(nóng)業(yè)科學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)、考古學(xué)以及環(huán)境科學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域受到了充分重視。例如，將PCR技術(shù)應(yīng)用于食品微生物檢測(cè)工作中，能夠起到較好的應(yīng)用效果。

3.1 食品樣品致病菌檢測(cè)

開(kāi)展食品樣品致病菌檢測(cè)工作時(shí)，若應(yīng)用傳統(tǒng)方法，不僅過(guò)程煩瑣，而且局限性顯著，需要首先富集培養(yǎng)被檢測(cè)微生物，直至其數(shù)量增長(zhǎng)至可檢測(cè)水平，方可分離微生物，并針對(duì)其形態(tài)特征進(jìn)行觀(guān)察，最后開(kāi)展生理化鑒定。同時(shí)，對(duì)于人工培養(yǎng)難度較大的微生物來(lái)說(shuō)，應(yīng)用傳統(tǒng)樣品難以有效開(kāi)展檢測(cè)工作。在細(xì)菌中，編碼rRNA 的基因具有較強(qiáng)的保守性，當(dāng)應(yīng)用PCR 技術(shù)時(shí)，其中的DNA 片段可以適當(dāng)擴(kuò)張，也就可以對(duì)樣品中的細(xì)菌及致病菌進(jìn)行快速且準(zhǔn)確的檢測(cè)，即使針對(duì)人工無(wú)法培養(yǎng)的各種微生物，也可起到良好的檢測(cè)效果。在應(yīng)用PCR 技術(shù)檢測(cè)食品樣品致病菌時(shí)，需要針對(duì)靶DNA 進(jìn)行抽提，采用過(guò)濾或者離心的方式獲取樣品中的細(xì)菌細(xì)胞，再裂解細(xì)胞，實(shí)施核酸純化，使其適用于PCR 技術(shù)，即可開(kāi)展檢測(cè)工作。

3.2 乳酸菌檢測(cè)

可以產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌均可被稱(chēng)為乳酸菌，當(dāng)前多數(shù)乳酸菌屬于有益菌，可起到促進(jìn)胃腸消化、優(yōu)化腸道功能和降低血清膽固醇含量等多方面作用，有利于提升機(jī)體免疫力和維持人體健康，但是有少數(shù)乳酸菌會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害，所以購(gòu)買(mǎi)食物時(shí)，消費(fèi)者會(huì)仔細(xì)查看食品乳酸菌含量，所以需要準(zhǔn)確檢測(cè)食品中的乳酸菌含量。

我國(guó)針對(duì)乳酸菌檢測(cè)工作的研究開(kāi)展時(shí)間較早，當(dāng)前已經(jīng)可以明確，乳酸菌DNA 序列1 414～1 432位置上的21 個(gè)堿基排列具有顯著代表性，并且多種類(lèi)型的乳酸菌具有這一堿基排列，目前可以確認(rèn)包含雙歧桿菌在內(nèi)的32 類(lèi)乳酸菌均是如此。所以，針對(duì)乳酸菌含量開(kāi)展檢測(cè)工作的主要內(nèi)容，即為針對(duì)上述的21 個(gè)堿基排列進(jìn)行檢測(cè)，獲取這一序列時(shí)，應(yīng)該使用SDS 方法裂解乳酸菌細(xì)胞，再借助蛋白酶去掉細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，即能獲取乳酸菌核酸，且可保障其完整性，之后提取所需的基因片段并對(duì)相應(yīng)的引物進(jìn)行研究。因?yàn)檫@一片段為乳酸菌特有的類(lèi)型，所以引物不會(huì)與其他物質(zhì)結(jié)合，也就可以對(duì)乳酸菌含量進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)[6]。

3.3 生活飲用水細(xì)菌檢測(cè)

飲用水水質(zhì)檢測(cè)工作內(nèi)容主要為檢測(cè)大腸桿菌類(lèi)以及人類(lèi)糞便污染的大腸桿菌。傳統(tǒng)的檢測(cè)方式需要共同培養(yǎng)細(xì)菌與將要進(jìn)行檢測(cè)的可以利用乳糖的革蘭氏陰性菌，整體過(guò)程較為煩瑣，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。若能利用-半乳糖苷酶，則可使用明確的底物開(kāi)展檢測(cè)工作，更有利于提升檢測(cè)效率。但是，部分大腸桿菌不能對(duì)-葡萄糖醛酸苷酶進(jìn)行表達(dá)，所以檢測(cè)必然存在一定的失敗概率，導(dǎo)致檢測(cè)工作的效率受到影響。應(yīng)用PCR技術(shù)開(kāi)展-半乳糖苷酶以及-葡萄糖醛酸苷酶基因檢測(cè)工作，其中的靈敏性和特異性可得到顯著提升。由于PCR 技術(shù)可以起到擴(kuò)增-半乳糖苷酶以及-葡萄糖醛酸苷酶基因的作用，能夠從水樣中分別檢測(cè)到大腸桿菌類(lèi)以及大腸桿菌。通常情況下，選擇應(yīng)用經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的-半乳糖苷酶為活體開(kāi)展培養(yǎng)工作，可以同時(shí)檢測(cè)到同一類(lèi)型的大腸桿菌類(lèi)，而使用經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的-葡萄糖醛酸苷酶進(jìn)行檢測(cè)，則可檢測(cè)出一種大腸桿菌以及志賀氏菌。另外，應(yīng)用PCR 技術(shù)，僅需數(shù)小時(shí)即可完成檢測(cè)工作，準(zhǔn)確性和效率較高[7]。

3.4 啤酒腐敗菌檢測(cè)

當(dāng)前，我國(guó)啤酒產(chǎn)量大且種類(lèi)多，市場(chǎng)廣闊，啤酒生產(chǎn)過(guò)程中需要發(fā)酵，且乳酸桿菌在其中占據(jù)重要地位。與此同時(shí)，啤酒花中含有異A 酸，其能起到抑菌作用，能夠?qū)θ樗峋a(chǎn)生一定的影響。根據(jù)相關(guān)研究顯示，乳酸桿菌之所以能起到抑制異A 酸生長(zhǎng)的作用，原因在于其中含有horA 基因，這一基因易引起啤酒變質(zhì)，即horA 基因能夠?qū)ζ【苹óa(chǎn)生抗性。啤酒敗菌檢測(cè)方法是以horA 基因順序?yàn)榛A(chǔ)合成相應(yīng)的特異性產(chǎn)物，再加入DNA 聚合酶以及乳酸桿菌DNA提取液，通過(guò)電泳檢測(cè)混合產(chǎn)物的檢測(cè)方法。應(yīng)用這一方法檢測(cè)啤酒中的腐敗菌，僅需耗時(shí)6 h，相對(duì)于傳統(tǒng)模式下的檢測(cè),效率顯著提升。

4 結(jié)語(yǔ)

一直以來(lái)，食品安全問(wèn)題是我國(guó)社會(huì)發(fā)展過(guò)程中的重點(diǎn)問(wèn)題，所以必須重視食品檢驗(yàn)檢測(cè)工作PCR 技術(shù)具有高準(zhǔn)確度、高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用效果良好，未來(lái)仍需積極推動(dòng)該技術(shù)發(fā)展，以促使我國(guó)食品安全監(jiān)管工作水平的不斷提升。