趙惠葉 劉紅利 田金悅△ 趙重陽 李 洋

(1.河北省石家莊市第二醫(yī)院糖尿病中醫(yī)科，河北 石家莊 050035；2.河北省石家莊市中醫(yī)院兒科，河北 石家莊 050011；3.河北省石家莊市糖尿病精準診療技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050035；4.河北省糖尿病基礎醫(yī)學研究重點實驗室，河北 石家莊 050035)

糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，是導致終末期腎病的重要原因之一，近年研究發(fā)現(xiàn)DKD患者體內(nèi)存在持續(xù)的微炎癥狀態(tài)[1]。微炎癥狀態(tài)是一種有別于病原體感染的炎癥，其表現(xiàn)為全身循環(huán)低水平、持續(xù)性的炎癥因子升高而并無明確的病原體感染[2]。在DKD早期即可出現(xiàn)微炎癥狀態(tài)，隨著病情逐漸加重，會加快患者腎功能的降低及腎實質(zhì)的損傷。因此調(diào)節(jié)DKD的微炎癥狀態(tài)成為減緩疾病進展的治療新思路。目前，現(xiàn)代醫(yī)學主要采用降壓、降糖、降脂等方法治療，中醫(yī)從整體出發(fā)，辨證論治，在治療DKD方面有一定優(yōu)勢。DKD屬中醫(yī)學“消渴”“水腫”“尿濁”等病證范疇，在疾病早期多表現(xiàn)為脾腎兩虛，夾瘀夾濁[3]，病位在脾腎，瘀濁內(nèi)蘊，傷及五臟。因此我們制定了以“健脾益腎，降濁化瘀”為治療原則的健脾益腎降濁方。健脾益腎降濁方以《金匱要略》防己黃芪湯為基本方，加用固腎化瘀降濁之品以著重增強益腎通絡、化瘀降濁之效。本實驗研究主要觀察不同劑量的健脾益腎降濁方對DKD大鼠炎癥因子的影響，以期為健脾益腎降濁方的臨床研究提供實驗基礎，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠60只，日齡90天，體質(zhì)量(150±20)g。購自北京維通利華動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2019-0009。于河北省糖尿病基礎醫(yī)學研究重點實驗室進行飼養(yǎng)，觀察1周后開始實驗。

1.2 藥品及試劑

1.2.1 藥品 纈沙坦膠囊(80 mg，常州四藥制藥有限公司，國藥準字H20010824)；健脾益腎降濁方(由神威藥業(yè)集團有限公司提供中藥顆粒劑)藥物組成：黃芪20 g，防己15 g，白術(shù)15 g，山藥15 g，山茱萸15 g，地龍10 g，蒲黃15 g，澤蘭15 g，生半夏6 g。

1.2.2 試劑 鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)；血肌酐(SCr)、血糖、24 h尿微量白蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Anti-白細胞介素6(IL-6)抗體、Anti-IL-8抗體、Anti-腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體、Anti-C Reactive Protein(CRP)抗體(美國美源伯根公司)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(購于北京索萊寶生物科技有限公司)。

1.3 儀器 ELx800TM酶標儀(美國Bio-Tek公司)；Leica RM2235石蠟切片機(德國徠卡公司)；AU2700全自動生化分析儀(日本奧林巴斯公司)；CX31顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型建立 將SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，按照隨機數(shù)字表法分為正常組(n=10)和造模組(n=50)。正常組大鼠予普通飼料飲食，造模組大鼠予高糖高脂飼料(含豬油30%、白糖30%、蛋黃6%、普通飼料44%)。5周后禁食12 h，造模組大鼠予腹腔注射STZ 30 mg/kg，每日1次，連續(xù)注射3天。正常組大鼠予注射等容積0.9%氯化鈉注射液，每日1次，連續(xù)注射3天。然后取造模組鼠尾靜脈血，測血糖≥16.7 mmol/L，確認糖尿病造模成功。連續(xù)喂養(yǎng)4周后，監(jiān)測大鼠的24 h尿蛋白定量>30 mg且尿液葡萄糖呈陽性，則認為DKD模型成功[4]。3只大鼠造模失敗，剔除。

1.4.2 分組與給藥 將大鼠分為正常組10只，將47只DKD大鼠按隨機數(shù)字表法分為：模型組10只，纈沙坦組10只，健脾益腎降濁方低、中、高劑量組各9只。依據(jù)人與大鼠藥物劑量折算公式[5]，纈沙坦組予纈沙坦膠囊0.131 g/kg灌胃，健脾益腎降濁方低、中、高劑量組分別予健脾益腎降濁方1.032、2.064、4.128 g/kg灌胃，正常組、模型組大鼠予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日1次。期間每周檢測體質(zhì)量并調(diào)整灌胃劑量，連續(xù)12周。

1.5 觀察指標及方法 各組大鼠灌胃12周后禁食不禁水12 h，使用異氟烷吸入麻醉，腹主動脈取血，離心機3000 r/min離心10 min，分離血清和血漿。采用生化分析儀檢測空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2 hPG)、SCr；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清IL-6、IL-8、TNF-α、CRP水平。用代謝籠收集大鼠尿液，檢測24 h尿微量白蛋白水平。將大鼠左腎沿縱軸切開，取多塊腎皮質(zhì)組織，取5 μm厚腎皮質(zhì)置于4% 多聚甲醛中性溶液中固定，石蠟包埋，用于HE染色。于200倍光鏡下觀察大鼠的腎臟組織。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FPG、2 hPG水平比較 與正常組比較，模型組大鼠FPG、2 hPG水平均升高(P<0.05)；與模型組、纈沙坦組、健脾益腎降濁方低劑量組比較，健脾益腎降濁方中、高劑量組大鼠FPG、2 hPG水平均降低(P<0.05)。健脾益腎降濁方中、高劑量組組間大鼠FPG、2 hPG水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組、健脾益腎降濁方低劑量組、纈沙坦組FPG、2 hPG水平組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠FPG、2 hPG水平比較

2.2 各組大鼠SCr水平比較 各組大鼠SCr水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠SCr水平比較

2.3 各組大鼠24 h尿微量白蛋白比較 與正常組比較，模型組大鼠24 h尿微量白蛋白水平升高(P<0.05)；與模型組比較，纈沙坦組及健脾益腎降濁方中、高劑量組大鼠24 h尿微量白蛋白水平均降低(P<0.05)，健脾益腎降濁方低劑量組無明顯改善(P>0.05)；與健脾益腎降濁方低劑量組比較，健脾益腎降濁方中、高劑量組大鼠24 h尿微量白蛋白水平均降低(P<0.05)；與健脾益腎降濁方中劑量組比較，健脾益腎降濁方高劑量組大鼠24 h尿微量白蛋白降低(P<0.05)。纈沙坦組與各中藥組24 h尿微量白蛋白水平組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠24 h尿微量白蛋白比較

2.4 各組大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α、CRP水平比較 與正常組比較，模型組大鼠IL-6、IL-8、TNF-α、CRP水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，纈沙坦組及健脾益腎降濁方中、高劑量組大鼠IL-6、IL-8、TNF-α、CRP水平均降低(P<0.05)，健脾益腎降濁方低劑量組IL-8、CRP水平均降低(P<0.05)，IL-6、TNF-α水平無明顯改善(P>0.05)；與纈沙坦組比較，健脾益腎降濁方低劑量組IL-6、IL-8、TNF-α、CRP水平無明顯改善(P>0.05)，健脾益腎降濁方中劑量組IL-8、CRP水平降低(P<0.05)，IL-6、TNF-α水平無明顯改善(P>0.05)，健脾益腎降濁方高劑量組IL-6、IL-8、TNF-α、CRP水平均降低(P<0.05)；與健脾益腎降濁方低劑量組比較，健脾益腎降濁方中劑量組大鼠IL-6、IL-8、TNF-α水平均降低(P<0.05)，CRP水平無改善(P>0.05)，健脾益腎降濁方高劑量組大鼠IL-6、IL-8、TNF-α、CRP水平均降低(P<0.05)；與健脾益腎降濁方中劑量組比較，健脾益腎降濁方高劑量組大鼠IL-6、IL-8、TNF-α、CRP水平均降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α、CRP水平比較

2.5 各組大鼠腎臟病理變化 正常組大鼠腎臟組織病理表現(xiàn)為腎小球結(jié)構(gòu)清晰，上皮細胞排列整齊，無炎癥細胞浸潤。模型組大鼠的腎臟組織發(fā)生病理改變，系膜細胞和系膜組織增生，腎小球肥大，基底膜增厚，可見到炎癥細胞浸潤。與模型組大鼠的病理改變比較，各藥物干預組大鼠腎組織病理有不同程度的改善。健脾益腎降濁方中劑量組、健脾益腎降濁方高劑量組改善明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟病理圖(HE，×200)

3 討論

DKD是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一，也是導致終末期腎病的重要原因之一。流行病學提示約25%的糖尿病患者出現(xiàn)DKD，其中50%發(fā)展為終末期腎病[6]。本病的發(fā)病原因復雜，氧化應激、慢性低水平的炎性反應是導致DKD發(fā)病的關鍵因素。越來越多的證據(jù)表明持續(xù)的微炎癥狀態(tài)是導致終末期腎病的重要原因[7]。與外源性感染不同，微炎癥狀態(tài)是指DKD患者體內(nèi)持續(xù)存在低水平的炎癥狀態(tài)。DKD患者因糖脂代謝紊亂，體內(nèi)激活及催生了大量炎癥因子的分泌，TNF-α、IL-6、IL-8這些炎癥因子刺激血管活性物質(zhì)釋放，使腎小球的系膜細胞增生，內(nèi)皮細胞通透性增加，加速腎臟損傷的進展。在本實驗中，模型組大鼠的24 h尿微量白蛋白升高，TNF-α的水平明顯升高，且DKD腎臟損傷的程度與TNF-α的升高成正比。在其他的DKD小鼠實驗中也可見相似的結(jié)果[8]。本研究結(jié)果顯示，健脾益腎降濁方中、高劑量組大鼠IL-6、IL-8、CRP、TNF-α水平均降低(P<0.05)，健脾益腎降濁方低劑量組大鼠IL-8、CRP水平均降低(P<0.05)。IL-6、IL-8是白細胞介素家族成員，IL-6可使血管內(nèi)皮細胞上黏附分子的表達增加，通過黏附過多的炎癥細胞，導致毛細血管的通透性異常，從而促進DKD的發(fā)生發(fā)展[9-10]，同時在調(diào)節(jié)免疫應答、抗感染和炎性反應中發(fā)揮重要的作用[11]。有研究發(fā)現(xiàn)隨著DKD病情嚴重程度的增加，IL-6明顯增加，與尿微量白蛋白/肌酐比值(UACR)呈正相關性，提示IL-6加快疾病的進展[12]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的健脾益腎降濁方可以不同程度地降低DKD大鼠的血清中IL-6的水平，且隨著藥物濃度的升高，中藥組大鼠血清IL-6、IL-8的水平下降。CRP是一種非特異性急性期反應蛋白，在急慢性炎癥及DKD患者中均明顯升高，是提示微炎癥的可靠指標，在本實驗中，DKD大鼠的炎癥水平明顯升高，高濃度的中藥可以更明顯地降低CRP的水平。在本實驗中還可發(fā)現(xiàn)，健脾益腎降濁方中、高劑量組大鼠24 h尿微量白蛋白水平下降(P<0.05)，說明中高劑量的健脾益腎降濁方可以不同程度的改善大鼠的腎臟功能，且具有濃度依賴性。DKD疾病的發(fā)生發(fā)展與血糖水平的持續(xù)偏高相關，體內(nèi)高血糖水平狀態(tài)可以導致腎臟微血管的損傷，本實驗發(fā)現(xiàn)，健脾益腎降濁方中、高劑量組可以降低大鼠FPG、2 hPG水平(P<0.05)。因此我們推測健脾益腎降濁方可以從降低血糖水平、降低炎癥因子水平，從而改善腎臟的損傷。

DKD屬中醫(yī)學“尿濁”“水腫”“脹滿”“關格”等范疇。近年來，中醫(yī)藥對DKD微炎癥狀態(tài)的理論及臨床研究不斷取得進展，現(xiàn)代醫(yī)家將DKD歸屬于“消渴腎病”。中醫(yī)學認為，DKD病因為先天稟賦不足，久病消渴。臟腑柔弱是導致DKD的內(nèi)在因素，勞傷太過、六淫邪毒、情志失調(diào)、房勞過度為外在因素。與肺、脾、腎關系密切。腎為先天之本，腎主封藏，腎中精氣虧虛，開闔失司，不能濡養(yǎng)他臟，遂逐漸出現(xiàn)口干口燥，精微下泄。脾胃為后天之本，飲食通過脾胃的運化轉(zhuǎn)輸，輸注于各臟腑，如若長期飲食不節(jié)，恣食肥甘厚味，使脾胃損傷，后天之精化生不足，臟腑失養(yǎng)，加之先天之精匱乏，則腎失封藏，精微丟失，進一步導致濕濁、痰濁、瘀血等病理產(chǎn)物的產(chǎn)生，而病理產(chǎn)物的形成又會進一步導致臟腑的虧虛，形成以脾腎虧虛為本，濁毒、血瘀、氣滯、痰濕為標，本虛標實，虛實夾雜的病因病機。在《圣濟總錄》中記載：“消渴……久則滲漏脂膏，脫耗精液，下流胞中，與水液渾濁，隨小便利下膏凝……”說明病久是DKD發(fā)生發(fā)展的重要因素。DKD遷延日久不愈，傷陰耗氣，腎絡瘀阻，易形成微型癥瘕，故治療當在健脾益腎、化瘀降濁的基礎上加用通絡之品，以加強化瘀軟堅散結(jié)之效。本實驗中健脾益腎降濁方便是由健脾利濕的名方防己黃芪湯化裁而成。防己黃芪湯出自《金匱要略·水氣病脈證并治》：“風水，脈浮，身重，汗出惡風者，防己黃芪湯主之。”防己黃芪湯補氣健脾，除濕祛風，利水消腫，歷代醫(yī)家化裁應用于脾虛、虛勞病、風水、皮水、水氣癥的治療。清代醫(yī)家將此方應用于婦人虛性水腫的治療。健脾益腎降濁方以防己黃芪湯為主方，加用益腎降濁及活血通絡之品以起健脾益腎，利水降濁通絡之效。本方組成為黃芪、防己、白術(shù)、山藥、山茱萸、地龍、蒲黃、澤蘭、半夏。方中以黃芪、防己為君藥，黃芪，味甘，性溫，入肺、脾兩經(jīng)，是健脾益氣、升陽舉陷的要藥，既可健脾肺以扶正，又可益氣固表及消腫；防己同為君藥，性寒，入脾、胃經(jīng)，具有利濕行水之功。半夏、白術(shù)、山藥、山茱萸為臣藥，健脾益腎，山茱萸以益腎養(yǎng)陰，還可收斂固澀；半夏、白術(shù)、山藥健脾化濕。澤蘭、地龍、蒲黃為佐藥，活血化瘀利水，地龍為蟲類藥加強走竄通絡之效。黃芪與山藥配伍，為施今墨治療糖尿病經(jīng)典的對藥，可達到補脾益腎，斂精固澀之效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液可以降低DKD大鼠TNF-α的水平[13]；黃芪總黃酮可能通過MAPK信號通路調(diào)控TNF-α、IL-1β和IL-6的生成，發(fā)揮抗炎作用[14]；黃芪和山藥配伍可降低DKD大鼠血糖、24 h尿微量白蛋白，改善腎功能指標，說明黃芪和山藥的配伍對大鼠腎臟病理損傷得到一定程度保護[15]；蒲黃總黃酮干預則能抑制IL-6基因表達，減少IL-6分泌[16]；地龍可降低炎癥因子細胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達，阻止炎癥細胞對腎組織的浸潤，進而防止腎小球硬化，延緩DKD進展，還能發(fā)揮抗氧化作用，對抗氧化應激對患者機體的進一步損傷，還可以調(diào)節(jié)DKD相關的細胞因子和抑制腎小球系膜細胞增殖，避免炎癥因子的浸潤和細胞外基質(zhì)的積聚，防止腎小球硬化發(fā)生和發(fā)展[17]。

綜上所述，中高濃度的健脾益腎降濁方可以降低DKD大鼠的血糖、24 h尿微量白蛋白及炎癥因子的水平，改善大鼠腎組織損傷，進而延緩DKD發(fā)展，為進一步的臨床研究提供了實驗基礎。