鄭秋玲，劉軍鵬，鄭媛媛，王建萍，盧建聲，肖慧琳，劉萬好，唐美玲，陳景輝，徐維華，孫行杰

（1. 山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東煙臺(tái) 265500；2. 煙臺(tái)水禾土生物科技有限公司，山東煙臺(tái) 264003；3. 龍口市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，山東龍口 265701；4. 山東省釀酒葡萄與葡萄酒技術(shù)創(chuàng)新中心，山東煙臺(tái) 264000）

葡萄具有見效快、收益高等特點(diǎn)，種植面積呈增長態(tài)勢，已經(jīng)成為很多地方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的支柱產(chǎn)業(yè)，在鄉(xiāng)村振興和精準(zhǔn)扶貧中發(fā)揮著重要作用[1-3]。葡萄為喜肥果樹，且在不同生育期對(duì)氮、磷、鉀、鈣、鎂等礦質(zhì)元素的需求規(guī)律不同[4-5]，傳統(tǒng)的重施氮磷鉀肥而忽視鈣鎂肥的方式不僅導(dǎo)致樹體生長失衡、果實(shí)品質(zhì)下降，也會(huì)造成肥料利用率下降和生產(chǎn)成本增加[6]。液體肥通過水肥一體化技術(shù)施用具有肥效高、容易吸收、養(yǎng)分均勻、配方可調(diào)、施用方便等優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)精確供給[7-8]。目前，關(guān)于液體肥在葡萄上的應(yīng)用效果主要集中在提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)方面。于會(huì)麗等[9]試驗(yàn)證明海藻水溶肥配施可提高葡萄產(chǎn)量、增加果實(shí)香氣；王振龍[10]認(rèn)為，適當(dāng)補(bǔ)充腐殖酸、氨基酸以及有益功能菌可以提高葡萄的花色苷及多酚含量；呂中偉等[11]證實(shí)不同類型液體肥可增加‘陽光玫瑰’葡萄可溶性固形物及Vc含量，同時(shí)可提高‘紅地球’葡萄產(chǎn)量，改善果實(shí)品質(zhì)[12]，而針對(duì)液體肥影響葡萄土壤根際微生物的研究較少。

土壤根際微生物在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用，其種類受土壤類型、植物種類、種植模式等因素影響[13-14]。目前葡萄園土壤微生物的研究多集中在水分管理[15-17]、產(chǎn)區(qū)[18-19]及土壤管理方式[20-21]等農(nóng)藝措施對(duì)微生物多樣性的影響。本研究以‘夏黑’葡萄為試材，采用Illumina PE250平臺(tái)對(duì)其進(jìn)行16S細(xì)菌rRNA和ITS真菌高通量測序分析，探討施用液體肥后葡萄根際土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)變化情況，闡明不同液體肥對(duì)葡萄根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)間的影響，為液體肥的推廣和應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蓬萊試驗(yàn)基地進(jìn)行。園區(qū)土壤pH值6.51，有機(jī)質(zhì)含量1.45%，堿解氮（AN）41.2 mg·kg-1，速效磷（AP）34.5 mg·kg-1，速效鉀（AK）132.5 mg·kg-1。試材為5年生‘夏黑’葡萄，株行距為3 m×4 m，龍干棚架，水平葉幕?；ü芾恚夯ㄇ耙恢鼙Ａ羲爰?～7 cm，盛花期采用25 mg·L-1GA3＋2 mg·L-1CPPU噴果穗，花后2周采用25 mg·L-1GA3進(jìn)行膨大處理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和取樣方法

液體肥來自煙臺(tái)水禾土科技有限公司，主要成分為：枯草芽孢桿菌（有效活菌數(shù)≥5億 cfu·mL-1）、殼寡糖（氨基酸≥100 g·L-1，Zn＋B≥20 g·L-1，殼寡糖5%）、魚蛋白（氨基酸≥100 g·L-1，N＋P2O5＋K2O≥150 g·L-1，有機(jī)質(zhì)≥300 g·L-1）、植物免疫蛋白（0.1%超敏蛋白，氨基酸≥100 g·L-1，Zn＋B≥20 g·L-1）、海藻寡糖（腐殖酸≥6%，N＋P2O5＋K2O≥26%，有機(jī)鉀≥18%，海藻寡糖≥5%）。

試驗(yàn)處理：液體肥復(fù)合處理（T）采用煙臺(tái)水禾土科技有限公司的系列產(chǎn)品，對(duì)照（CK）為常規(guī)土壤施肥，處理方案見表1。每個(gè)處理3個(gè)小區(qū)，每小區(qū)10株，共計(jì)30株，小區(qū)隨機(jī)分布。施肥方式為：常規(guī)施肥采用溝施，距樹干30 cm處開溝（深、寬均為20 cm溝），固體肥料撒施入溝內(nèi)，覆土后澆透水；液體肥采用溝施與葉面噴施相結(jié)合的方式進(jìn)行，液體肥料稀釋100倍后澆入溝內(nèi)，覆土后澆水。

表1 不同處理施肥時(shí)期、方法及用量Table 1 Fertilization period, method and amount of different treatments

取樣方法：葡萄采收期用不銹鋼取土器配合橡膠錘采集樹干與施肥溝間的土壤，采集深度為0～30 cm，每個(gè)處理采集3個(gè)混合土樣，每個(gè)樣本由15個(gè)采樣點(diǎn)的土壤混合而成，1個(gè)混合土樣1000 g，混合均勻后土壤樣品分為兩組，一組液氮速凍，置于﹣80 ℃冰箱保存，送樣進(jìn)行土壤微生物測定；另一組自然風(fēng)干過篩后測定相關(guān)理化指標(biāo)。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤理化指標(biāo)

土壤有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法-稀釋熱法測定；pH用1∶1水土比，pH計(jì)測定；堿解氮采用堿解擴(kuò)散法；有效磷采用NaHCO3浸提，硫酸鉬銻抗比色法；土壤速效鉀：醋酸銨浸提，火焰光度法測定；交換性鈣鎂采用1 mol·L-1NH4OAc溶液浸提，原子吸收分光光度計(jì)測定。

1.3.2 微生物群落分析

用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（Omega Bio-tek, Norcross，GA，US）試劑盒提取土壤總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。土壤細(xì)菌擴(kuò)增引物為341F（5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'）和806R（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'），土壤真菌擴(kuò)增引物為ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25個(gè)循環(huán)，最后于72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收，回收的產(chǎn)物由上海凌恩生物科技有限公司基于Illumina PE250平臺(tái)高通量測序。測序得到的PE reads根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，用Usearch軟件和gold數(shù)據(jù)庫，采用denovo和reference結(jié)合的方式去除嵌合體，區(qū)分樣本后進(jìn)行分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU）聚類分析和物種分類學(xué)分析，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析（置信度閾值為0.7），比對(duì)數(shù)據(jù)庫為Silva（細(xì)菌）和Unite（真菌），統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。

不同指數(shù)的計(jì)算方法如下：

Chao：是用chao1算法估計(jì)樣本中所含OTU數(shù)目的指數(shù)，chao1在生態(tài)學(xué)中常用來估計(jì)物種總數(shù)，由Chao（1984）最早提出。本次分析使用計(jì)算公式如下：

其中，Schao1為估計(jì)的OTU數(shù)；Sobs為實(shí)際觀測到的OTU數(shù)；n1為只含一條序列的OTU數(shù)目；n2為只含兩條序列的OTU數(shù)目。

Simpson：用來估算樣本中微生物多樣性指數(shù)之一，由Edward Hugh Simpson (1949) 提出，在生態(tài)學(xué)中常用來定量描述一個(gè)區(qū)域的生物多樣性。Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低。

其中，Sobs為實(shí)際觀測到的OTU數(shù)；ni為第i個(gè)OTU所含的序列數(shù)；N為所有的序列數(shù)。

Shannon：用來估算樣本中微生物多樣性指數(shù)之一。它與Simpson多樣性指數(shù)常用于反映α多樣性指數(shù)。Shannon值越大，說明群落多樣性越高。

其中，Sobs為實(shí)際觀測到的OTU數(shù)；ni為第i個(gè)OTU所含的序列數(shù)；N為所有的序列數(shù)。

Coverage：是指各樣本文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測出的概率越高，而沒有被測出的概率越低。該指數(shù)反映本次測序結(jié)果是否代表了樣本中微生物的真實(shí)情況。

其中，ni為第i個(gè)OTU所含的序列數(shù)；N為所有的序列數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用Excel 2010，顯著性分析用SPSS 19.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 液體肥處理對(duì)土壤理化性狀的影響

由表2可知，與對(duì)照相比，液體肥處理顯著提高了土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷、速效鉀及交換性鈣含量，分別增加了19.62%、39.64%、12.10%、19.49%、33.97%；pH值、交換性鎂與對(duì)照相比沒有顯著性差異。

表2 施肥處理對(duì)土壤理化指標(biāo)的影響Table 2 Effect of the fertilization treatment to physical and chemical properties of tested soil samples

2.2 液體肥處理對(duì)根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 施肥處理對(duì)根際土壤細(xì)菌多樣性的影響

由表3可知，液體肥處理與常規(guī)施肥葡萄植株根際土壤細(xì)菌的Coverage指數(shù)均在98%以上，表明測序結(jié)果可代表樣本中細(xì)菌的真實(shí)狀況。液體肥處理的葡萄根際土壤的OTU數(shù)、Chao指數(shù)、Simpson指數(shù)顯著高于對(duì)照，Shannon指數(shù)無顯著性差異。

表3 不同處理土壤中細(xì)菌α多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 3 Alpha diversity index statistics of bacteria in the rhizosphere soil of different treatments

2.2.2 施肥對(duì)根際土壤細(xì)菌門分類水平的影響

本研究中檢測到的根際土壤細(xì)菌OTU歸類到36門97綱230目359科700屬，表4為不同處理‘夏黑’根際土壤中細(xì)菌在門分類學(xué)水平上的主要物種分布種類及豐度。施用液體肥與常規(guī)肥的葡萄根際土壤中，占比大于1%的優(yōu)勢菌門分別為10個(gè)和11個(gè)。共有的超過10%的優(yōu)勢菌門有4個(gè)：變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）；低于介于1%～10%的優(yōu)勢菌門為：擬桿菌門（Bacteroidota）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）、疣微菌門（Verrucomicrobiota）、粘球菌門（Myxococcota）、Atescibacteria、硝化螺旋菌門（Nitrospirota）。

表4 根際土壤細(xì)菌門分類水平組成與豐度Table 4 Relative abundance of bacteria phylum in rhizosphere soil%

與常規(guī)施肥相比較，液體肥處理的變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門、Atescibacteria豐度增加9.53、0.87、0.12、1.99、0.61、1.12個(gè)百分點(diǎn)；酸桿菌門、疣微菌門、粘球菌門、硝化螺旋菌門、Methylomirabilota豐度降低10.90、0.83、0.68、0.11、1.26個(gè)百分點(diǎn)。

2.2.3 根際土壤細(xì)菌屬分類水平

本研究測定的葡萄根際土壤微生物中，相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢細(xì)菌屬共有15個(gè)，其中液體肥處理的1%優(yōu)勢細(xì)菌屬有14個(gè)，常規(guī)施肥處理的有13個(gè)（表5），液體肥處理的葡萄根際土壤中富集羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）、鏈霉菌屬（Streptomyces）優(yōu)勢細(xì)菌屬，常規(guī)施肥處理富集了酸性細(xì)菌屬（Acidobacteriales）特有優(yōu)勢細(xì)菌屬。

表5 根際土壤細(xì)菌屬分類水平組成與豐度Table 5 Relative abundance of bacteria genus in rhizosphere soil %

液體肥復(fù)合處理相對(duì)豐度前4位的分別為RB41、芽單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、Gaiellales；常規(guī)對(duì)照的相對(duì)豐度前4位的屬為：酸桿菌屬、RB41、Gaiellales、芽單胞菌屬。

與常規(guī)施肥相比，液體肥復(fù)合處理的葡萄根際土壤中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、RB41、Candidatus Udaeobacter、黃色桿菌科及兩個(gè)優(yōu)勢菌屬相對(duì)豐度分別增加了2.28、0.22、0.46、0.21、0.51、0.11、0.10個(gè)百分點(diǎn)；酸桿菌屬、Gaiellales、Roseiflexaceae_uncultured、Vicinamibacteraceae_norank、慢生根瘤菌屬優(yōu)勢菌屬相對(duì)豐度分別下降了2.36、1.27、0.12、2.05、0.21個(gè)百分點(diǎn)。

2.3 液體肥對(duì)葡萄根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 根際土壤真菌多樣性

由表6看出，不同處理的葡萄根際土壤的Coverage指數(shù)均在99%以上，說明測試結(jié)果代表樣本中真菌的真實(shí)情況。施肥處理的OTU數(shù)、Chao指數(shù)、Simpson指 數(shù)顯著高于對(duì)照；Shannon指數(shù)顯著低于對(duì)照。

表6 不同處理中土壤中真菌α多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 6 Index statistics for alpha diversity of fungi in the rhizosphere soil of different treatments

2.3.2 根際土壤真菌菌門分類水平

不同處理‘夏黑’根際土壤真菌OTU歸類到7門25綱145目145科277屬，液體肥復(fù)合處理和常規(guī)施肥的葡萄根際土壤中，相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢真菌門有3個(gè)（表7），分別為：子囊菌門（Ascomycota）、毛霉菌門（Mucoromycota）、擔(dān)子菌門（Asidiomycota）；其中液體肥復(fù)合處理根際土壤中三者的相對(duì)豐度分別為78.70%、11.37%和4.21%，常規(guī)施肥處理葡萄植株根際土壤中三者的相對(duì)豐度分別為62.04%、14.66%、16.68%?？梢钥闯?，采用液體肥料復(fù)合施用使葡萄根際土壤真菌優(yōu)勢菌門占比發(fā)生變化，子囊菌門占比增加，毛霉菌門和擔(dān)子菌門占比減少。

表7 根際土壤真菌門分類水平組成與豐度Table 7 Relative abundance of fungi phylum in rhizosphere soil%

2.3.3 根際土壤真菌屬分類水平

液體肥復(fù)合處理和常規(guī)施肥的葡萄根際土壤中，相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢真菌屬分別為15個(gè)和13個(gè)（表8），不同處理富集的優(yōu)勢菌屬不同，液體肥處理的葡萄根際土壤富集了頭束霉屬、Fusicolla、枝孢屬、瓶毛殼屬、Podospora、Dendrostilbella特有的優(yōu)勢真菌屬；常規(guī)施肥處理根際土壤富集了毛霉菌屬、Phoma、小不整球殼屬、柄孢殼屬特有優(yōu)勢菌屬。

表8 根際土壤真菌屬分類水平組成與豐度Table 8 Relative abundance of fungi genus in rhizosphere soil%

兩處理共有的優(yōu)勢菌屬有9個(gè)，分別為毛葡孢屬（Botryotrichum）、鐮刀菌屬（Fusarium）、被孢霉屬（Mortierella）、腐質(zhì)霉屬（Humicola）、短柄菌屬（Solicoccozyma）、Gibellulopsis、毛殼菌屬（Chaetomium）、盤菌屬（Tricharina）、Tausonia。與常規(guī)施肥相比，水溶肥復(fù)合處理的葡萄根際土壤中毛葡孢屬、鐮刀菌屬、短柄菌屬、Gibellulopsis、盤菌屬的相對(duì)豐度分別增加9.08、2.70、1.49、1.24、0.61個(gè)百分點(diǎn)，被孢霉屬、腐質(zhì)霉屬、毛殼菌屬、Tausonia的相對(duì)豐度分別降低3.29、8.05、0.38、3.21個(gè)百分點(diǎn)。

2.4 土壤微生物與礦質(zhì)元素的冗余分析

通過對(duì)液體肥處理和常規(guī)施肥處理的葡萄根際土壤樣品細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的RDA冗余分析，可直觀看出土壤有機(jī)質(zhì)、pH、速效磷、速效鉀及交換性鈣鎂等指標(biāo)對(duì)土壤微生物細(xì)菌（圖1左）和真菌（圖1右）影響作用一致，細(xì)菌中變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門與有機(jī)質(zhì)、pH、速效磷、速效鉀及交換性鈣鎂等指標(biāo)正相關(guān)；真菌門水平的子囊菌門與有機(jī)質(zhì)、pH值、速效磷、速效鉀及交換性鈣鎂等指標(biāo)正相關(guān)。

圖1 細(xì)菌（左）和真菌（右）門水平群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)間的冗余分析Figure 1 Redundancy analysis of bacterial (Left) and fungal (Right) community structure and soil

3 討論

土壤中的微生物是提高土壤生態(tài)功能的重要群體，在有機(jī)質(zhì)周轉(zhuǎn)、物質(zhì)循環(huán)等活動(dòng)中起著舉足輕重的作用[23]。前人研究表明，不同施肥處理對(duì)土壤細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)和生物多樣性產(chǎn)生一定影響。本研究中發(fā)現(xiàn)施用液體肥可顯著提高土壤部分礦質(zhì)元素及有機(jī)質(zhì)含量，這是因?yàn)橐后w肥中含有的氨基酸態(tài)氮、腐殖酸和有機(jī)酸等成分，通過螯合作用和酸溶解作用促使土壤中固化的氮素、磷素和鉀素轉(zhuǎn)化為更易吸收的礦化態(tài)[22-24]，因此提高了土壤中氮、磷、鉀的有效性。施用液體肥處理的葡萄根際土壤的細(xì)菌和真菌的OTU數(shù)、Chao指數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)高于常規(guī)施肥處理，這可能是由于施入液體肥，為微生物提供了可直接利用的營養(yǎng)物質(zhì)，增加了微生物的數(shù)量及多樣性[25]，這與桑文等[26]在番茄中的研究結(jié)果一致。

本研究表明，施用液體肥對(duì)土壤微生物結(jié)構(gòu)及活性影響較大，尤其是對(duì)細(xì)菌影響較大。施用液體肥處理的變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門的豐度高于常規(guī)施肥處理，這些菌門有助于根系吸收更多的鉀、磷和其他微量營養(yǎng)元素[27]。本研究中通過門水平群落結(jié)構(gòu)與土壤理化指標(biāo)間的冗余分析也得出變形菌門、放線菌門、擬桿菌門與土壤礦質(zhì)元素指標(biāo)之間存在正相關(guān)，說明兩者之間可能存在互相促進(jìn)的關(guān)系。施用液體肥處理提高了根際土壤中子囊菌門的豐度，降低了毛霉菌門和擔(dān)子菌門豐度。研究表明，子囊菌門是土壤有機(jī)質(zhì)和纖維素的主要分解者[28]，施入液體有機(jī)肥后，刺激了子囊菌門的生長，更有利于葡萄吸收土壤營養(yǎng)。Lauber等[29]研究發(fā)現(xiàn)，擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度與土壤中C/N和有效磷含量成反比，本研究中施用液體肥提高了土壤有機(jī)質(zhì)、有效磷等礦質(zhì)元素含量，冗余分析表明毛霉菌門和擔(dān)子菌門豐度與土壤理化指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，可能是土壤中擔(dān)子菌門豐度降低的原因。

4 結(jié)論

與常規(guī)肥相比，液體肥處理顯著提高了細(xì)菌和真菌的多樣性和豐度；細(xì)菌門水平上變形菌門、放線菌門、綠彎菌門等相對(duì)豐度增加，屬水平上鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、RB41等優(yōu)勢菌屬相對(duì)豐度增加；真菌門水平上葡萄根際土壤中優(yōu)勢菌群子囊菌門豐度增加，毛霉菌門、擔(dān)子菌門豐度有所下降，屬水平上毛葡孢屬、鐮刀菌屬、短柄菌屬等的相對(duì)豐度增加。土壤有機(jī)質(zhì)、pH、速效磷、速效鉀及交換性鈣鎂等指標(biāo)與微生物群落結(jié)構(gòu)存在相關(guān)性。