朱紹坤，孫凌俊，高圣華，喬軍，郭薦碩

（1. 遼寧省果樹科學研究所，遼寧營口 115009；2. 遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，遼寧營口 115009）

葡萄是世界重要水果之一，在世界范圍內種植廣泛，目前中國鮮食葡萄的產(chǎn)量與面積已居于世界第一[1]。葡萄產(chǎn)業(yè)在遼寧農(nóng)業(yè)中占重要地位，截止2020年葡萄栽培面積已達4.48萬 hm2，產(chǎn)量90.60萬 t，分別占全國葡萄的5.5%、6.5%，位居全國第五位和第四位。但遼寧省作為葡萄老產(chǎn)區(qū)，隨著種植年限的增加，葡萄連作引起的病蟲害加重、樹體衰弱、再植更新困難等問題，降低了葡萄品質與產(chǎn)量[2]，影響了果農(nóng)經(jīng)濟效益，阻礙了葡萄產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，間作已經(jīng)成為緩解連作障礙的有效措施之一，合理間作能促進植株生長[4]，提高作物產(chǎn)量[5]，降低病害發(fā)生率[6]，顯著改善土壤微生物的種群結構[7-8]。胡國彬等[9]研究發(fā)現(xiàn)，蠶豆與小麥間作使蠶豆的籽粒產(chǎn)量和百粒質量分別提高44.29%和12.17%，枯萎病病情指數(shù)降低57.14%。鄭亞強等[10]研究發(fā)現(xiàn)，玉米間作甘蔗使根際微生物功能多樣性提高，根際微生物活性增強。目前關于果樹間作的相關研究多集中在根系、水肥、光照的空間分布與利用等方面，涉及間作對連作果樹根際環(huán)境影響等方面的研究仍需深入和系統(tǒng)化。

葡萄育苗圃是連作危害較重的地塊之一，本研究基于前期試驗結果[11]，選取3種作物與‘貝達’葡萄間作種植，研究不同間作物對連作葡萄生長、根際環(huán)境的影響及其相互關系，探討葡萄間作系統(tǒng)中根際土壤養(yǎng)分、微生物群落結構等的變化規(guī)律及影響因素，旨在為連作葡萄間作效應的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試材為一年生‘貝達’葡萄扦插苗，間作物為大蔥（C）、花生（H）、苦荬菜（K），種子購自農(nóng)發(fā)源種子公司。試驗地點位于沈陽農(nóng)業(yè)大學葡萄試驗園，該園建立于1978年，期間對葡萄更新3次，供試連作土壤基本理化指標為：堿解氮為98.35 mg·kg-1、速效磷109.44 mg·kg-1、速效鉀189.8 mg·kg-1、有機質26.53 g·kg-1、pH為6.85。

1.2 試驗設計

采用槽式栽培方式（80 cm×65 cm×70 cm）。將栽于連作土中的‘貝達’分別與3種間作物定植，間作物與葡萄的行距分別設為5、10、15、20、25 cm， 共5個處理。葡萄苗株距為10 cm，兩側為作物種植行，間作物株距為7 cm，以不間作的葡萄苗為對照（CK）。葡萄單臂籬架，避雨栽培，常規(guī)統(tǒng)一管理。

1.3 試驗方法

1.3.1 葡萄生理指標測定

間作種植80 d（此時植株生長趨于平緩）后取葡萄植株測定地上部、地下部的鮮質量。

1.3.2 葡萄根際土壤的收集

用抖根法[12]收集葡萄根際土壤，混勻后統(tǒng)一過20目篩。一部分風干保存，用于理化性質測定；另一部分保存于﹣80 ℃，用于微生物結構測定。

1.3.3 葡萄根際土壤理化性質的測定

堿解氮采用堿解擴散法測定，速效磷采用鉬銻抗比色法測定，速效鉀采用火焰光度計法測定，有機質采用重鉻酸鉀容量法測定，pH值用pH測量儀測定[13]。

1.3.4 根際微生物結構多樣性測定

土壤微生物DNA提?。翰捎迷噭┖蟹椒ǎㄉzup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒）。細菌擴增采用968-GC-F和1401R[14]為引物擴增16S rDNA序列；真菌采用巢式PCR擴增，分別以ITS1F/ITS4[15]和ITS1-GC-F/ITS2[16]為第一輪和第二輪擴增引物。

PCR反應條件：第一輪條件為94 ℃變性7 min；94 ℃變性60 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)32次；最后72 ℃延伸15 min。取10 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，若均為清晰條帶進行第二輪擴增。第二輪條件為94 ℃變性7 min；94 ℃變性60 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)32次；最后72 ℃延伸15 min。瓊脂糖電泳檢測出現(xiàn)清晰條帶后，可進行變性梯度凝膠電泳。

變性梯度凝膠電泳所用變性梯度細菌為40%～60%，真菌為30%～60%，采用8%聚丙烯酰胺凝膠，電泳緩沖液為1×TAE，用微量注射器每孔上樣40 μL，60 ℃下180 V電壓運行6 h，電泳完成后用Genefinder染料進行避光染色30 min，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用化感效應指數(shù)（RI）分析生理指標，即

其中，T代表處理值，C0代表對照值；RI為正值表現(xiàn)促進，RI為負值表現(xiàn)抑制。

采用Quantity One軟件分析DGGE的指紋圖譜數(shù)據(jù)，用Shannon指數(shù)表示土壤微生物種群多樣性；H′= ﹣∑pi×㏑pi，其中pi為某一條帶密度占該泳道所有條帶密度之和的比值。

采用Excel 2010、SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結果與分析

2.1 間作對連作葡萄生長的影響

間作物對連作葡萄植株鮮質量的化感效應指數(shù)如圖1。間作大蔥處理對連作葡萄長勢的影響，除C5處理表現(xiàn)為抑制作用外，其他處理均增加植株總質量，促進作用隨距離的增加呈現(xiàn)先增強后降低的趨勢，其中C20處理促進作用最強；在間作花生處理中，間作5 cm處理呈現(xiàn)抑制作用，而10 cm處理具有明顯的促進作用；間作苦荬對葡萄質量均表現(xiàn)為抑制，K5處理抑制效果最強。

圖1 不同間作處理對葡萄總質量的影響Figure 1 Effects of the intercropping treatments on total mass of grape plants

2.2 間作對連作葡萄根際土壤理化性質的影響

根據(jù)對不同間作模式下葡萄根際土壤理化性質的測定結果（表1），可得出間作大蔥對各理化性質的影響，其中堿解N（C10除外）、速效P（C10除外）、有機質（C5除外）、pH（C5除外）與CK相比均無顯著性差異，而速效K（C15、C20除外）有降低的趨勢。與CK相比，間作花生處理降低了堿解N、速效P（H25除外）含量，提高了有機質含量（H5除外）；速效K中H5顯著高于CK，H15、H20顯著低于CK。苦荬處理中速效K（K5、K15除外）、pH值（K10、K20除外）顯著低于CK。

表1 不同間作模式對葡萄根際土壤理化性質的影響Table 1 Effect of intercropping treatments on physical and chemical properties of grapevine rhizophere soil

土壤肥力是土壤中各種理化性質的綜合反應，為評價不同間作模式下土壤理化性質綜合水平，將土壤養(yǎng)分指標進行主成分分析。其中，第一主成分方差貢獻率為48.67%，特征值為2.44；第二主成分方差貢獻率為21.92%，特征值為1.10。兩個主成分累計方差貢獻率達到70.58%，基本包含了主要土壤理化信息。

由表2可知，各間作處理土壤肥力綜合得分整體低于不間作處理；間作苦荬土壤養(yǎng)分綜合得分（除K5）高于間作大蔥；間作花生土壤養(yǎng)分綜合得分較低。

表2 主成分因子得分及土壤肥力水平綜合得分Table 2 Principal component factor score and comprehensive score of soil fertility level

2.3 間作對連作葡萄根際微生物結構多樣性的影響

通過PCR-DGGE分析不同間作處理對葡萄根際細菌和真菌結構多樣性的影響，如圖2。各間作處理降低了連作葡萄根際細菌結構多樣性，且間作苦荬處理對細菌多樣性的降低程度大于間作大蔥、花生處理。在間作大蔥模式下，微生物細菌多樣性為C20＞C25＞C15＞C10＞C5；間作花生處理中，隨間作距離的增加多樣性呈現(xiàn)低-高-低的趨勢；在苦荬間作中，各間作處理細菌多樣性差異不明顯。

圖2 葡萄根際微生物結構H'值Figure 2 The Shannon index on the structure of the rhizosphere microorganism in grapevines

如圖2所示，間作降低了根際土壤真菌的多樣性，間作苦荬處理的真菌多樣性受抑制程度低于間作大蔥、花生處理。在間作大蔥模式中，C25微生物中真菌多樣性抑制程度最低，C15真菌的抑制程度最高；間作花生處理下，H25處理對根際真菌多樣性降低程度最高，H10、H15處理降低幅度較低；而間作苦荬中，真菌多樣性表現(xiàn)為K5＞K25＞K20＞K10＞K15。隨間作距離的增加，真菌多樣性受抑制程度表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢。

圖3 為各間作模式下根際細菌與真菌結構多樣性比值，均無顯著性差異。間作大蔥、花生中細菌與真菌比值高于CK，苦荬間作處理的細菌與真菌比值小于CK。間作大蔥中，C20處理比值最高；花生處理中H10、H15處理的比值較高；間作苦荬處理中K5比值最低。

2.4 間作葡萄根際微生物結構多樣性與植株長勢、土壤理化性質相關性分析

通過對葡萄根際土壤微生物細菌、真菌多樣性比值與各處理葡萄植株總質量間的相關性分析發(fā)現(xiàn)，細菌、真菌多樣性比值與葡萄長勢（即總質量）間相關系數(shù)為0.901，存在極顯著正相關性。

通過對不同間作處理下葡萄根際微生物結構多樣性與各組分土壤理化性質進行相關性分析發(fā)現(xiàn)（表3），細菌的結構多樣性與根際土壤pH值間存在顯著相關性，真菌的結構多樣性與土壤堿解氮含量間存在顯著相關性。

表3 根際微生物結構多樣性指數(shù)與土壤理化性質相關性分析Table 3 Correlative analysis between the Shannon index of the microbial structure and the physical and chemical properties in rhizosphere soil

3 討論

3.1 間作對連作葡萄生長的影響

間作被認為是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式中的精華，不僅是一種高效的種植模式，而且有抗病、增產(chǎn)等優(yōu)勢[17-18]。間作可優(yōu)化根際土壤生物多樣性及群落組成[19]，顯著提高微生物總數(shù)，影響植物長勢[7-8,20]。本試驗發(fā)現(xiàn)，間作苦荬抑制連作葡萄植株總質量，而間作花生、大蔥提高了連作葡萄植株質量，促進了生長，改善了葡萄的連作障礙，這與前期研究結果一致[11]。

3.2 間作對連作葡萄根際土壤理化性質的影響

根際土壤環(huán)境在連作中占據(jù)極其重要的位置[21]，土壤養(yǎng)分、微生物及植物之間相互作用，共同維持著土壤環(huán)境[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，間作苦荬、花生、大蔥對根際土壤理化性質的影響無明顯規(guī)律性，但主成分分析表明，3種間作物均降低了根際土壤肥力水平。推測可能是間作物與葡萄之間存在部分養(yǎng)分競爭關系或部分作物間作后產(chǎn)生種間促進作用，提高了葡萄對土壤養(yǎng)分的吸收利用，從而降低了根際土壤肥力。這一推測與Li等[23]的研究相似，其發(fā)現(xiàn)蠶豆玉米間作后，蠶豆和玉米均增加了對土壤養(yǎng)分磷的吸收，且蠶豆和玉米分別增產(chǎn)26%、43%。

3.3 間作對連作葡萄根際微生物結構多樣性的影響

目前的研究普遍認為，連作障礙發(fā)生的重要原因是根際微生物群落失衡，由細菌型向真菌型轉變[24]，而間作可使土壤向健康的“細菌型”轉變[25]。本試驗通過微生物結構多樣性研究發(fā)現(xiàn)，間作大蔥、花生土壤中細菌與真菌的比值高于對照，而間作苦荬處理其比值低于對照，并發(fā)現(xiàn)細菌與真菌結構多樣性比值與葡萄植株長勢（即總質量）具有極顯著相關性，說明合理間作可提高土壤細菌比例，并可通過提高葡萄根際土壤細菌與真菌的比例，改善葡萄連作障礙。

3.4 間作葡萄根際土壤微生物與理化性質間的關系

前人研究表明根際土壤理化性質與微生物之間存在相互作用[26]；微生物多樣性受土壤理化性質變化的影響[27]，而土壤理化性質保持平衡的因素之一是微生物的多樣性[28]。李巧玲等[29]研究發(fā)現(xiàn)，pH在細菌群落多樣性中發(fā)揮著重要功能；而堿解N與土壤微生物多樣性呈顯著相關性[30]。本研究得出，根際土壤中細菌、真菌多樣性分別與土壤pH值、堿解氮存在顯著相關性。該結果證實了前人的研究，認為土壤理化性質中的堿解N與pH值在間作葡萄根際微生物結構多樣性中發(fā)揮著重要作用。

4 結論

間作大蔥、花生對連作葡萄長勢有促進作用，間作苦荬對連作葡萄有抑制作用。間作可以改變連作葡萄的根際土壤環(huán)境。間作大蔥、花生、苦荬降低了葡萄根際土壤肥力；間作大蔥、花生提高了根際土壤細菌與真菌結構多樣性比值，間作苦荬降低了其比值；根際土壤細菌與真菌結構多樣性比值與連作葡萄植株長勢具有極顯著相關性。因此認為，間作大蔥、花生通過提高根際土壤細菌與真菌結構多樣性比值，從而對葡萄連作障礙緩解發(fā)揮重要作用。