李芳嬋,韋志英,羅小莉,潘翠柳,吳秀彩,梁方耀,潘真真*,李耀華*(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗實訓(xùn)中心,南寧 50200;2. 廣西高校中藥提取純化與質(zhì)量分析重點實驗室,南寧 50200;. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南寧 50200)
目前,乳腺癌約占女性癌癥病例的24.5%,占癌癥死亡的15.5%,發(fā)病率和病死率均居首位,已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤[1],隨著生活水平日益提高、環(huán)境污染和人口老年化的加劇,預(yù)計2070年新發(fā)乳腺癌病例將達(dá)到440萬[2]。在我國乳腺癌每年新發(fā)病例約27.9萬,并以每年2%的速度遞增[3]。乳腺癌的主流治療方案一般以化學(xué)治療為主,配合手術(shù)切除和放射治療的綜合治療,化療藥物大多是小分子細(xì)胞毒性藥物,雖然能殺傷腫瘤細(xì)胞,但選擇性和靶向性差,會對人體正常的組織細(xì)胞實行“無差別攻擊”,使患者出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副作用,化療后期患者的生存質(zhì)量差,以至于化療難以持續(xù),在臨床中的應(yīng)用有很多局限性[4-5]。因此,探索更好的化學(xué)治療方案,提高乳腺癌治療水平具有深遠(yuǎn)的理論和現(xiàn)實意義。
姜黃素(curcumin,CUR)是從姜黃根莖中提取的一種脂溶性多酚,具有抗腫瘤、抗菌、抗抑郁、抗炎、抗氧化等多種藥理活性[6-9]。CUR的抗腫瘤作用,在近幾年受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注,文獻(xiàn)報道其通過調(diào)節(jié)如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor,NF-κB)及環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)等促炎因子和細(xì)胞因子的表達(dá)水平而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[10-12]。但因CUR為脂溶性多酚,難溶于水,口服給藥吸收差,在普通給藥方式下CUR的生物利用率很低,限制其臨床應(yīng)用。阿霉素(doxorubicin,DOX)是臨床一線廣譜抗腫瘤藥物,通過激發(fā)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ裂解DNA從而破壞DNA的三級結(jié)構(gòu),并觸發(fā)細(xì)胞凋亡途徑,是臨床治療乳腺癌的化療藥物之一[13-14]。但是,DOX選擇性較差,臨床應(yīng)用時出現(xiàn)明顯的毒副作用,對心、肝、腎等正常組織和器官造成損傷,長期使用會引起患者強烈的過敏反應(yīng)、心臟毒性和肝臟損傷[15-17]。聯(lián)合用藥是腫瘤治療的新方向之一,將不同作用機(jī)制的抗腫瘤藥物聯(lián)合起來,降低腫瘤對化療藥物的耐藥性,增強化療藥物對腫瘤的殺傷作用[18-20]。多項研究表明,CUR與DOX聯(lián)用,增強了DOX的抗腫瘤作用,降低了DOX的給藥劑量,從而降低DOX的毒副作用[21]。體外研究發(fā)現(xiàn)CUR和DOX聯(lián)合給藥,能夠有效提高乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDAMB-231對DOX的敏感性,降低DOX的半數(shù)抑制濃度(IC50)[22]。另一研究發(fā)現(xiàn),在DOX耐藥細(xì)胞中,CUR和DOX聯(lián)合給藥能有效抑制ABC(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運蛋白家族中的外排蛋白ABCB4的活性,從而逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的DOX耐藥[23]。此外,多項研究發(fā)現(xiàn)CUR能降低DOX誘導(dǎo)的心臟毒性。有研究揭示CUR可能是通過消除大鼠的炎癥、凋亡、改善DNA氧化損傷和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)氧化水平來改善DOX誘導(dǎo)的心臟毒性[24]。另有研究發(fā)現(xiàn),與單用DOX給藥的小鼠組相比,DOX和CUR聯(lián)合給藥組的小鼠血清心肌酶顯著降低,抗氧化能力提高;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CUR通過 PI3K/Akt/mTOR通路抑制DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡[25]。因此,研究DOX和CUR聯(lián)合用藥具有理論和現(xiàn)實意義。
本研究以三嵌段共聚物聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯(PCL-PEG-PCL)為載體,采用薄膜-水化-超聲法制備共載姜黃素/阿霉素膠束(CUR/DOX micelle)。以粒徑、包封率和載藥量為考察指標(biāo),單因素結(jié)合正交實驗對CUR/DOX micelle制備工藝進(jìn)行優(yōu)化,確定其最優(yōu)制備工藝條件。對CUR/DOX micelle進(jìn)行表征,并考察其體外細(xì)胞攝取率和抗腫瘤活性。本研究通過制備膠束實現(xiàn)共載姜黃素與阿霉素,采用聯(lián)合給藥模式發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用,為腫瘤治療提供新的思路。
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司);JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);LC2030高效液相色譜儀、RF-6000熒光分光光度計(日本島津儀器有限公司);EM10透射電子顯微鏡(德國蔡司公司);納米粒度分析儀(美國麥奇克有限公司);FreeZone 2.5冷凍干燥儀(美國Labconco公司);CT 15RE冷凍離心機(jī)(日本日立公司);Multiskan Sky型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司);LSR Fortessa流式細(xì)胞儀(BD公司)。
姜黃素原料藥(北京百靈威科技有限公司,批號:921105);姜黃素對照品(純度:99.50%,成都曼斯特生物科技有限公司,批號:MUST-21022710);阿霉素(大連美侖生物技術(shù)有限公司,對其進(jìn)行脫鹽處理);PCL8000-PEG6000-PCL8000(山東岱罡生物科技有限公司);甲基偶氮唑鹽(MTT,北京索萊寶科技有限公司,批號:829Z0513);人乳腺癌細(xì)胞MCF-7(中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所);胎牛血清(美國Gemini,批號:A87F82H);1640培養(yǎng)基(賽默飛世爾科技有限公司,批號:8120133);磷酸緩沖鹽(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,批號:20211210);其他試劑均為分析純。
采用薄膜-水化-超聲法制備CUR/DOX micelle。稱取處方量的CUR、脫鹽DOX(CUR∶DOX=5∶1)和PCL-PEG-PCL,加入適量的二氯甲烷-丙酮混合溶液(1∶1)使其溶解后,減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑,直至在瓶底形成一層橘紅色的薄膜。加入適量去離子水,水浴加熱水化。水化后于冰浴中探頭超聲處理(250 W),過0.22 μm微孔濾膜除去游離CUR和DOX,即得。同法制備不含藥的空白膠束、單載CUR膠束和單載DOX膠束。
采用高效液相色譜法對CUR進(jìn)行含量測定。色譜條件:流動相為甲醇-4%冰醋酸(48∶52),色譜柱為Hypersil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),檢測波長為430 nm,柱溫30℃;流速1 mL·min-1;進(jìn)樣量10 μL。經(jīng)方法學(xué)驗證表明方法的專屬性良好;回歸方程為Y=7.79×104X-5.95×103,r=0.9999(n=5),CUR在21.30~106.50 μg·mL-1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。精密度和重復(fù)性RSD分別為1.8%、2.1%(n=6);平均加樣回收率為99.17%,RSD為1.4%。
采用熒光分光光度法對DOX含量進(jìn)行測定(避光操作),激發(fā)波長為485 nm,發(fā)射波長為590 nm,測定其熒光強度?;貧w方程為Y=0.2203X+32.13,r=0.9999(n=5),結(jié)果表明DOX在400~6400 ng·mL-1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。精密度和重復(fù)性RSD分別為1.4%、1.0%(n=6);平均加樣回收率為99.33%,RSD為2.5%。
按“2.1”項下方法制備CUR/DOX micelle,并且取出部分進(jìn)行冷凍干燥。采用高速離心法測定其載藥量及包封率,稱取一定量CUR/DOX micelle,計為WM,加入一定量甲醇超聲10 min,超高速離心10 min(35 000 r·min-1),取上清液按“2.2”項下方法分別測定CUR和DOX的含量,計為Ws,投藥量記為W總。按載藥量及包封率的計算公式,分別計算CUR和DOX的包封率和載藥量。
載藥量(%)=WS/WM×100%;
包封率(%)=WS/W總×100%。
按“2.1”項下方法制備CUR/DOX micelle,分散在一定量的去離子水中,通過納米粒粒度儀測定其粒徑和多分散系數(shù)(PDI),平行測定3次,取其平均值。
2.5.1 正交實驗因素和水平 在前期單因素實驗基礎(chǔ)上,選取對膠束制備影響較大的因素藥物與PCL-PEG-PCL的比例(A)、水化溫度(B)、超聲時間(C)為考察因素,每個因素設(shè)定3個水平,以粒徑、CUR和DOX的平均包封率和平均載藥量為評價指標(biāo)。按照正交實驗設(shè)計表L9(34)設(shè)計實驗,因素水平表見表1。
表1 因素水平表Tab 1 Factor and level
2.5.2 正交實驗優(yōu)選制備工藝 按照表1的因素和水平進(jìn)行實驗,考察膠束制備過程中藥物與PCLPEG-PCL的比例(A)、水化溫度(B)、超聲時間(C)對CUR/DOX micelle制備工藝的影響,最終測定各實驗樣品膠束的粒徑、包封率和載藥量。采用加權(quán)評分法分析實驗結(jié)果,設(shè)定膠束粒徑的加權(quán)系數(shù)為0.5,包封率為0.25,載藥量的加權(quán)系數(shù)為0.25,綜合評分值=(粒徑最小值/粒徑×0.5+平均包封率/平均包封率最大值×0.25+平均載藥量/平均載藥量最大值×0.25)×100%。
正交實驗結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3,最終優(yōu)選的條件為A2B2C2,即藥物與PCL-PEGPCL投料比為1∶10,水化溫度為65℃,超聲時間為6 min。因此,CUR/DOX micelle的制備工藝為:稱取處方量的CUR、DOX(CUR∶DOX=5∶1)和PCL-PEG-PCL(藥物與PCL-PEG-PCL投料比為1∶10),加入適量的二氯甲烷-丙酮混合溶液(1∶1)使其溶解后,減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑,直至在瓶底形成一層橘紅色的薄膜。加入適量去離子水,65℃水浴加熱水化。水化后于冰浴中探頭超聲處理處理6 min(250 W),過0.22 μm微孔濾膜除去游離CUR和DOX,即得。
表2 正交實驗設(shè)計及結(jié)果(n=3)Tab 2 Orthogonal test design and results (n=3)
表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Variance analysis
2.5.3 處方工藝驗證 按照優(yōu)選工藝制備條件進(jìn)行3批驗證實驗,結(jié)果圖1A顯示CUR/DOX micelle的粒徑為150.0 nm,PDI為0.0573±0.02,CUR載藥量為6.80%,包封率為85.21%,DOX載藥量為1.28%,包封率為82.92%。透射電鏡(TEM)觀察CUR/DOX micelle的形態(tài)特征,取少量CUR/DOX micelle滴至水化后的銅網(wǎng)上,靜置后濾紙吸干,2%的磷鎢酸負(fù)染,自然揮干,測定。TEM結(jié)果顯示CUR/DOX micelle為球形,大小均一,結(jié)果見圖1B。
將CUR/DOX micelle按體積比1∶1分別分散在去離子水和含10%胎牛血清的水溶液中,于0、2、4、6、8、12、24、36、48、72 h分別測定其粒徑,考察其穩(wěn)定性,見圖1C。結(jié)果顯示在水溶液中納米粒的粒徑穩(wěn)定在(151.19±1.23)nm,72 h內(nèi)粒徑RSD為0.81%;在含10%胎牛血清的水溶液中,納米粒的粒徑穩(wěn)定在(151.47±1.73)nm,72 h內(nèi)粒徑RSD為1.1%,表明在水溶液及含10%胎牛血清的水溶液中CUR/DOX micelle均具有較好的穩(wěn)定性。
圖1 CUR/DOX micelle的粒徑分布(A)、TEM(B)及穩(wěn)定性(C)Fig 1 Particle size(A),TEM photograph(B)and stability(C)of CUR/DOX micelle
采用透析法考察膠束的體外釋藥行為,為模擬正常體液環(huán)境和腫瘤細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,選擇pH 7.4和pH 5.0的磷酸緩沖液(PBS)作為釋放介質(zhì),為保障疏水藥物CUR和DOX的釋放介質(zhì)加入0.1%的吐溫80作為表面活性劑。分別取一定量CUR/DOX micelle置于預(yù)處理的透析袋中,兩端封口,浸于裝有釋放介質(zhì)的裝置中,釋放溫度為37℃,搖床轉(zhuǎn)速為120 r·min-1。定時取樣(1、2、4、8、10、12、24、36、48、72、96 h),取樣量為1 mL,取樣后補加相應(yīng)的PBS 1 mL。樣品按“2.2”項下方法分別測定,計算累積釋放率(n=3)。以時間為橫坐標(biāo),累積釋放率為縱坐標(biāo)繪制體外釋藥曲線,結(jié)果見圖2。由體外釋藥曲線可知,CUR/DOX micelle表現(xiàn)出較好的緩釋作用,在pH 7.4的釋放介質(zhì)中,CUR/DOX micelle中的CUR和DOX釋放速率比較慢,24 h時膠束的CUR的累積釋放率為49.38%,DOX的累積釋放率為40.09%,96 h 時CUR的累積釋放率為64.08%,DOX的累積釋放率為60.13%,而在pH 5.0的釋放介質(zhì)中,釋放速度明顯加快,96 h時CUR的累積釋放率為84.60%,DOX的累積釋放率為85.59%,上述結(jié)果表明,釋放介質(zhì)的pH值對CUR/DOX micelle影響較大,這有可能是低pH條件下膠束中脂溶性脫鹽DOX和CUR,尤其是脫鹽DOX在酸性條件下質(zhì)子化,溶解度升高,釋放加快。CUR/DOX micelle的這種pH 敏感釋藥行為可以減少DOX在體液循環(huán)中的釋放,增加其在酸性環(huán)境如腫瘤細(xì)胞內(nèi)的釋放。
圖2 CUR/DOX micelle的體外釋藥曲線Fig 2 Release profile of CUR/DOX micelle in vitro
取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度,以5×104/孔的密度接種于24孔板中,進(jìn)行攝取實驗。實驗設(shè)置分別設(shè)置CUR/DOX micelle組,游離脫鹽DOX組,并設(shè)空白對照組。給藥時棄去原培養(yǎng)基,加入含不同樣品及10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基,每孔0.5 mL,確保DOX質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1。共孵育4 h,吸棄培養(yǎng)基,胰酶消化并離心收集細(xì)胞,冷PBS充分清洗3次,全程避光操作。最后加入PBS 0.5 mL重懸細(xì)胞,于流式細(xì)胞儀上檢測,測定細(xì)胞內(nèi)的熒光強度,并計算細(xì)胞攝取率,結(jié)果見圖3。可以看出,與空白對照組相比,游離脫鹽DOX組和CUR/DOX micelle組中的DOX均能進(jìn)入細(xì)胞,游離DOX的攝取效率為73.9%,而CUR/DOX micelle組的攝取效率為82.1%,與游離脫鹽DOX組相比,CUR/DOX micelle組的攝取效率明顯提高,表明膠束包裹DOX后能顯著提高腫瘤細(xì)胞的攝取效果。
圖3 CUR/DOX micelle的細(xì)胞攝取Fig 3 Cellular uptake of CUR/DOX micelle
取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞,消化收集并調(diào)整密度,接種于96孔板中,密度為5×103/孔,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行實驗。實驗設(shè)置空白對照組、空白納米粒組、游離CUR組、游離DOX組、單載CUR micelle組、單載DOX micelle組和CUR/DOX micelle組,CUR最終質(zhì)量濃度為:0、0.52、1.04、2.08、3.12、4.16、5.20、6.24、8.32、10.40 μg·mL-1,DOX最終質(zhì)量濃度為:0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 μg·mL-1,空白納米粒組采用培養(yǎng)基按給藥組相同體積比例進(jìn)行稀釋(n=6)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,加入5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL繼續(xù)孵育4 h,棄去培養(yǎng)液,每孔加0.2 mL二甲基亞砜,震蕩儀震蕩1 min后,酶標(biāo)儀490 nm下測定吸光度值(OD),按以下公式計算細(xì)胞存活率:
細(xì)胞存活率(%)=(實驗組平均OD值-空白納米粒組平均OD值)/(空白對照組平均OD值-空白納米粒組平均OD值)×100%。
實驗結(jié)果見圖4,空白納米粒組在相應(yīng)的濃度下對MCF-7細(xì)胞的生長無明顯毒性及抑制作用,可見載體PCL-PEG-PCL生物相容性較好。游離CUR組、游離DOX組、單載CUR micelle組、單載DOX micelle組和CUR/DOX micelle組均有不同程度的抑制腫瘤細(xì)胞生長作用,相較于游離DOX組、單載DOX micelle組和CUR/DOX micelle組,游離CUR組和單載CUR micelle組在相應(yīng)的給藥質(zhì)量濃度下(0.52~10.40 μg·mL-1)腫瘤細(xì)胞生長抑制作用較弱。通過擬合計算可知,游離DOX組的IC50為1.24 μg·mL-1,單載DOX micelle組的IC50為1.02 μg·mL-1,CUR/DOX micelle的IC50為0.79 μg·mL-1(以DOX給藥量濃度進(jìn)行擬合計算),這表明聯(lián)合應(yīng)用CUR和DOX增強了藥物的抗腫瘤作用。
圖4 CUR/DOX micelle的細(xì)胞毒性Fig 4 Cytotoxicity test of CUR/DOX micelle
根據(jù)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞在不同濃度的游離CUR、游離DOX和CUR/DOX micelle條件下的存活率,采用CompuSyn軟件分析聯(lián)合藥物指數(shù)(CI),結(jié)果見表4。從CompuSyn結(jié)果可知,抑制作用(Fa)為50%時CI值、75%CI值、90%CI值及95%CI值均小于1,表明CUR和DOX聯(lián)用具有協(xié)同作用。當(dāng)CUR質(zhì)量濃度大于5.2 μg·mL-1,DOX質(zhì)量濃度大于1 μg·mL-1時,隨著藥物濃度和抑制率的增加,CI值逐漸降低,這表明CUR和DOX協(xié)同作用逐漸增強。
表4 姜黃素和阿霉素的聯(lián)合藥物指數(shù)Tab 4 Combination index of curcumin and doxorubicin
采用GraphPad Prism 9統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
聯(lián)合用藥是目前腫瘤治療的新方向,中藥活性成分與化療藥物的作用靶點不同,兩者聯(lián)用,從機(jī)制的互補、作用的協(xié)同、不良反應(yīng)的減輕等方面發(fā)揮協(xié)同效應(yīng),提高治療效果。納米制劑的主要優(yōu)勢在于其能夠包裹溶解性差、穩(wěn)定性差的藥物并將藥物傳輸至體內(nèi)不同部位,降低藥物的毒副作用。采用納米技術(shù)共載化療藥物和中藥活性成分,能為中藥聯(lián)合化療藥物治療腫瘤提供新的思路。
本研究以PCL-PEG-PCL為載體,通過薄膜-水化-超聲法成功制備了CUR/DOX micelle,提高了CUR和DOX的有效利用度;有文獻(xiàn)報道,以PCL-PEG-PCL制備膠束時,PEG的分子量大小對納米膠束的載藥量、包封率和穩(wěn)定性影響比較大,相較于其他分子量的PEG(如PEG4000、PEG2000和PEG1000),PEG6000可以提供更加適宜的親水疏水比例,制備的膠束載藥量、包封率較高且穩(wěn)定性好[26-28],故本研究選擇PEG6000作為親水端。在前期研究中,采用單因素實驗對PCLPEG-PCL分子量、藥物與PCL-PEG-PCL的比例、有機(jī)溶劑的比例、水化溫度、超聲功率、超聲時間等因素進(jìn)行考察。在對PCL-PEG-PCL分子量的單因素實驗中分別考察了PCL4500-PEG6000-PCL4500、PCL10000-PEG6000-PCL10000和PCL8000-PEG6000-PCL8000,發(fā)現(xiàn)PCL8000-PEG6000-PCL8000制備的膠束最為合適;在正交實驗中,選擇對膠束制備影響較大的因素:藥物與PCL-PEG-PCL的比例、水化溫度和超聲時間作為考察因素進(jìn)行優(yōu)化,得到粒徑合適,分布均勻,載藥量和包封率均較為理想的膠束;本文采用最優(yōu)制備工藝制得的CUR/DOX micelle的粒徑為(150.0±0.6)nm,大小均一;穩(wěn)定性考察結(jié)果表明,72 h內(nèi)膠束在去離子水和含10%胎牛血清的水溶液中穩(wěn)定性良好;體外釋放考察表明CUR/DOX micelle具有緩釋作用;細(xì)胞攝取結(jié)果表明,在相同濃度下相較于游離DOX,CUR/DOX micelle的入胞能力更強,這有利于更好地發(fā)揮抗腫瘤作用;體外實驗結(jié)果顯示,對于人乳腺癌MCF-7細(xì)胞,載體PCL-PEG-PCL無明顯的生長抑制作用,CUR/DOX micelle組的抑制作用強于游離CUR組、游離DOX組、單載CUR組和單載DOX組,這可能是CUR和DOX聯(lián)用共同發(fā)揮了抗腫瘤作用,并且制成膠束后有效地提高了藥物的入胞能力。采用CompuSyn 軟件分析聯(lián)合藥物指數(shù),當(dāng)CUR質(zhì)量濃度大于5.2 μg·mL-1,DOX質(zhì)量濃度大于1 μg·mL-1時,CUR和DOX聯(lián)用具有協(xié)同作用。在后續(xù)的工作中,將進(jìn)一步研究CUR/DOX micelle的活性及抗腫瘤作用機(jī)制,為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。