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        基于UPLC-Q-Exactive-MS技術(shù)鑒定蒙藥蓽茇的化學(xué)成分

        2023-04-01 05:29:14張弘張慧文張晨劉宏許佳綺王煥蕓內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院呼和浩特010110
        中南藥學(xué) 2023年2期
        關(guān)鍵詞:氧基O型酰胺

        張弘,張慧文,張晨,劉宏,許佳綺,王煥蕓(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,呼和浩特 010110)

        蓽茇又名蓽拔、畢勃、蓽撥梨,為胡椒科植物蓽茇PiperlongumL.的干燥近成熟或成熟果穗,收載于歷版《中國(guó)藥典》。國(guó)內(nèi)主產(chǎn)于云南、兩廣地區(qū),國(guó)外主產(chǎn)于印度尼西亞、菲律賓、越南。蓽茇是藥食兩用中藥[1],蒙醫(yī)體系中也常見它的身影,但中藥學(xué)和蒙藥學(xué)對(duì)蓽茇的藥性認(rèn)識(shí)和臨床應(yīng)用不盡相同,范圍亦有差異[2]。目前臨床上主要用于脘腹冷痛,嘔吐,泄瀉,寒凝氣滯,胸痹心痛,頭痛,牙痛?,F(xiàn)代植物化學(xué)研究表明,蓽茇中含有的化學(xué)成分以生物堿類和揮發(fā)油類成分為主[3],同時(shí)含有少量黃酮類、有機(jī)酸類、萜類和甾醇類、氨基酸類以及微量無機(jī)元素等成分,其中酰胺類化合物為蓽茇的主要特征成分。蓽茇的藥理活性報(bào)道較多,但最新的研究側(cè)重于抗腫瘤、降脂、抗菌抗炎、抗抑郁和抗氧化等方面的作用[4]。

        蓽茇的化學(xué)成分復(fù)雜,闡述其化學(xué)成分的文獻(xiàn)很少,且研究方法相對(duì)單一。因此,全面且快速鑒定蓽茇的化學(xué)成分很有必要。近年來,液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)因其簡(jiǎn)便、快捷與準(zhǔn)確等特點(diǎn)常應(yīng)用于中藥化學(xué)成分的分離鑒定中。因此本試驗(yàn)采用UPLC-Q-Exactive-MS技術(shù)對(duì)蓽茇化學(xué)成分進(jìn)行分析,旨在探求其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ),為其進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

        1 材料

        1.1 儀器

        Q-Exactive 高效液相色譜-四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、UltiMate 3000 超高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo公司);AB 135-S 型十萬分之一分析天平(瑞士Metter Toledo公司);CF1524R高速冷凍型微量離心機(jī)(美國(guó)SCILOGEX);KQ-250 DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);WH-1微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠);FDU2110型冷凍干燥機(jī)(東京理化器械株式會(huì)社)。

        1.2 試藥

        甲醇(色譜純,Thermo公司);水為超純水。蓽茇(內(nèi)蒙古騰翔中藥飲片有限公司,批號(hào):170701,產(chǎn)地內(nèi)蒙古,經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室張慧文博士鑒定,均符合2020年版《中國(guó)藥典》一部規(guī)定)。

        2 方法

        2.1 供試品溶液的制備

        取蓽茇藥材,粉碎過40目篩,稱取200 g蓽茇粉末,甲醇超聲提取3次,每次1 h,合并提取液,減壓濃縮后,冷凍干燥制成蓽茇凍干粉。精密稱取蓽茇凍干粉1 g,精密稱定,置于50 mL具塞錐形瓶中,加入25 mL甲醇,稱定重量,超聲(功率100 W)處理20 min,放冷后補(bǔ)重,12 000 r·min-1離心10 min,取上清液即得蓽茇供試品溶液。

        2.2 分析條件

        2.2.1 色譜條件 Welch Ultimate C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;流動(dòng)相:甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脫(0~5 min,55%A,5~25 min,55%~90%A,25~50 min,90%~100%A);流速1 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)272 nm;柱溫30℃;進(jìn)樣量20 μL。

        2.2.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜條件:離子源為HESI源;正、負(fù)離子模式同時(shí)檢測(cè);正離子檢測(cè)模式下,輔助氣體輔助氣體體積流量30 L·min-1,噴霧電壓4.00 kV,離子傳輸管溫度300℃,輔助氣溫度100℃,碰撞能量(CE)45 eV;負(fù)離子模式下,輔助氣體體積流量30 L·min-1,噴霧電壓3.5 kV,離子傳輸管溫度300℃,輔助氣溫度100℃,CE為30 eV,檢測(cè)方式均為Full-MS/dd-MS2;Full MS分辨率70 000,dd-MS2分辨率17 500,掃描范圍m/z110~1000。

        2.3 蓽茇?cái)?shù)據(jù)庫的建立與分析鑒定

        通過Compound Discoverer 3.0軟件對(duì)所檢測(cè)樣本的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)初步篩查,再查閱Chemspider數(shù)據(jù)庫和蓽茇化學(xué)成分的相關(guān)中英文文獻(xiàn),收集整理蓽茇中已報(bào)道的化合物,將各化學(xué)成分進(jìn)行匯總,包括分子式、分子結(jié)構(gòu)式、相對(duì)分子質(zhì)量、分子離子、藥材來源、中英文名稱等,采用Xcalibur3.0軟件進(jìn)行峰提取、峰匹配等質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理方法,質(zhì)譜偏差范圍δ≤5×10-6,對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定,結(jié)合已有文獻(xiàn)信息[3,5-13]推測(cè)可能的化合物的裂解規(guī)律并進(jìn)行初步分析鑒定。

        3 結(jié)果與討論

        3.1 蓽茇藥材的UPLC-Q-Exactive-MS/MS鑒定

        正、負(fù)離子模式下蓽茇的總離子流圖如圖1所示。通過參考相關(guān)文獻(xiàn)、對(duì)比保留時(shí)間、精確質(zhì)譜信息等,對(duì)蓽茇的化學(xué)成分進(jìn)行確認(rèn),鑒定出57個(gè)可能的化學(xué)成分,包括16個(gè)A型酰胺類生物堿、13個(gè)B型酰胺類生物堿、9個(gè)C型酰胺類生物堿、10個(gè)D型酰胺類生物堿、3個(gè)E型酰胺類生物堿、6個(gè)O型化合物(4個(gè)酰胺化合物、1個(gè)羧酸、1個(gè)酯類化合物)。UPLC-Q-Exactive-MS/MS數(shù)據(jù)見表1。

        圖1 正離子模式(A)和負(fù)離子模式(B)下蓽茇的總離子流圖Fig 1 Total ion flow chromatogram of Piperlongum L. in the positive(A)and negative ion mode(B)

        表1 蓽茇化學(xué)成分結(jié)構(gòu)鑒定Tab 1 Structure identification of chemical components in Piperlongum L.

        續(xù)表1

        續(xù)表1

        3.2 成分鑒定過程

        蓽茇中的生物堿由不同的脂肪酸和胺部分組成,其中脂肪酸部分的差異集中在末端結(jié)構(gòu)(亞甲二氧基苯基和正戊基);胺部分由哌啶、異丁胺或吡咯組成。根據(jù)構(gòu)成生物堿的兩部分之間的差異可以將生物堿分為6類,分別為Type A、Type B、Type C、Type D、Type E、Type O型,Type A~E型結(jié)構(gòu)見圖2。其中,Type O型為其他化合物。鑒于相似結(jié)構(gòu)具有相同的裂解規(guī)律,選擇Type A型和Type C型兩類成分進(jìn)行詳細(xì)說明。

        圖2 Type A~E型結(jié)構(gòu)Fig 2 Structure of type A~E

        3.2.1 Type A型 Type A型結(jié)構(gòu)為吡啶結(jié)合末端帶有亞甲二氧基苯的不飽和脂肪酸,其質(zhì)譜裂解特點(diǎn)為胺部分容易失去一個(gè)中性哌啶(C5H11N,85.0886 Da)或甲?;哙ぃ–6H11NO,113.0835 Da),其末端結(jié)構(gòu)易產(chǎn)生m/z161.0597[C10H8O2+H]+的丙烯基亞甲二氧基苯和m/z135.0440[C8H6O2+H]+的甲基亞甲二氧基苯,共發(fā)現(xiàn)16個(gè)A型酰胺類生物堿。以胡椒堿為例來說明鑒別過程。胡椒堿可能的裂解規(guī)律見圖3,二級(jí)質(zhì)譜圖見圖4。在正離子模式下檢測(cè)到m/z286.1449[M+H]+的分子離子峰,丟失C5H11N形成m/z201.0554的碎片離子,再丟失CO形成m/z173.0603的離子碎片,以及脂肪酸末端產(chǎn)生的m/z161.0604[C10H8O2+H]+的丙烯基亞甲二氧基苯和m/z135.0446[C8H6O2+H]+的甲基亞甲二氧基苯。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及比對(duì)結(jié)果,確認(rèn)化合物為胡椒堿[8]。

        圖3 胡椒堿的質(zhì)譜裂解途徑Fig 3 Fragmentation pathway of piperine

        圖4 胡椒堿的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig 4 MS/MS spectrum of piperine

        3.2.2 Type B型 Type B型結(jié)構(gòu)為異丁胺結(jié)合末端帶有亞甲二氧基苯的不飽和脂肪酸,與Type A型結(jié)構(gòu)相比,其質(zhì)譜裂解特點(diǎn)為胺部分容易失去1個(gè)中性異丁胺(C4H11N,73.0886 Da)或甲酰基異丁胺(C5H11NO,101.0835 Da),其末端結(jié)構(gòu)的裂解模式與Type A型相同,共發(fā)現(xiàn)13個(gè)B型酰胺類生物堿。3.2.3 Type C型 Type C型結(jié)構(gòu)為異丁胺結(jié)合末端結(jié)構(gòu)為正戊基的不飽和脂肪酸,其質(zhì)譜裂解特點(diǎn)為胺部分容易失去1個(gè)中性異丁胺(C4H11N,73.0886 Da),有時(shí)會(huì)伴隨脫羰基(CO,27.9943 Da),也會(huì)產(chǎn)生一系列烷基碎片(并不是特征碎片),結(jié)構(gòu)中有共軛雙鍵,易發(fā)生α裂解脫烷基,共發(fā)現(xiàn)9個(gè)C型酰胺類生物堿。以N-isobutyl-(2E,4E)-dodecadienamide為例來說明鑒別過程。N-isobutyl-(2E,4E)-dodecadienamide可能的裂解規(guī)律見圖5,二級(jí)質(zhì)譜圖見圖6。在正離子模式下檢測(cè)到m/z252.2334 [M+H]+的分子離子峰,丟失C4H8形成m/z196.1706的碎片離子,再丟失NH3形成m/z179.1439的離子碎片,脂肪酸部分經(jīng)過α裂解丟失C6H12后產(chǎn)生m/z168.1386[C10H17NO+H]+的碎片離子。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及比對(duì)結(jié)果,確認(rèn)化合物為N-isobutyl-(2E,4E)-dodecadienamide[8]。

        圖5 N-isobutyl-(2E,4E)-dodecadienamide的質(zhì)譜裂解途徑Fig 5 Fragmentation pathway of N-isobutyl-(2E,4E)-dodecadienamide

        圖6 N-isobutyl-(2E,4E)-dodecadienamide的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig 6 MS/MS spectrum of N-isobutyl-(2E,4E)-dodecadienamide

        3.2.4 Type D型 Type D型結(jié)構(gòu)為哌啶結(jié)合末端結(jié)構(gòu)為正戊基的不飽和脂肪酸,與Type C型結(jié)構(gòu)相比,其質(zhì)譜裂解特點(diǎn)為胺部分容易失去1個(gè)中性哌啶(C5H11N,85.0886 Da),有時(shí)會(huì)伴隨脫羰基(CO,27.9943 Da),結(jié)構(gòu)中有共軛雙鍵,則易發(fā)生α裂解脫烷基,共發(fā)現(xiàn)10個(gè)D型酰胺類生物堿。

        3.2.5 Type E型 Type E型結(jié)構(gòu)為吡咯烷結(jié)合末端帶有苯并二氧雜環(huán)的不飽和脂肪酸,與Type A型結(jié)構(gòu)相比,此類結(jié)構(gòu)中胺部分容易失去1個(gè)中性吡咯(C4H9N,71.0729 Da)或甲?;量–5H9NO,99.0678 Da),其末端結(jié)構(gòu)的裂解模式與Type A型相同,共發(fā)現(xiàn)3個(gè)E型酰胺類生物堿。

        3.2.6 Type O型 除Type A~E外的結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱為O型結(jié)構(gòu),共發(fā)現(xiàn)6個(gè)O型化合物(4個(gè)酰胺化合物、1個(gè)羧酸、1個(gè)酯類化合物)。O型化合物的裂解規(guī)律基本相似,易在碳碳單鍵與碳碳雙鍵間裂解,區(qū)別主要在官能團(tuán)上。酰胺類化合物易失去哌啶,后繼續(xù)丟失一分子CO;而環(huán)內(nèi)酰胺則易失去CO;羧酸易先失去一分子羥基,進(jìn)一步失去CO;酯類化合物先失去烷氧基后,又失去CO。此外,甲氧基也容易離去。O型化合物可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖7。

        圖7 O型化合物的質(zhì)譜裂解途徑Fig 7 Fragmentation pathway of type O compounds

        4 結(jié)論

        本試驗(yàn)以甲醇為提取溶劑,分別考察了蓽茇回流和超聲兩種提取方式對(duì)提取的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取的峰容量更大,提取更完全;本試驗(yàn)還考察了流動(dòng)相中甲酸的含量對(duì)提取的影響,當(dāng)不加入甲酸時(shí),以胡椒堿為代表的生物堿類成分出現(xiàn)峰分離度低及拖尾等現(xiàn)象,為避免此類現(xiàn)象發(fā)生,選用了甲醇-0.1%甲酸水為流動(dòng)相。

        本文建立了一種基于UPLC-Q-Exactive-MS技術(shù)的快速、靈敏、可靠的鑒定蓽茇化學(xué)成分的方法,目的是探求該中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ),為后續(xù)課題組進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)研究提供參考,從而更好地研究其作用機(jī)制。

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