拜禮文，焦興蘋，譚金華，肖華，海平*，張煒*（1. 青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810016；. 青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院/青海省中藏藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)試驗(yàn)室/國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥（藏藥）質(zhì)量控制重點(diǎn)試驗(yàn)室，西寧 810016）

石榴健胃制劑（包括石榴健胃丸、石榴健胃散、石榴健胃片，以下同）由石榴子、肉桂、豆蔻、蓽茇及紅花組成，處方源自《四部醫(yī)典》[1]，對(duì)于治療腸易激綜合征[2]、功能性消化不良[3]、炎癥性腸病[4]及小兒再發(fā)性腹痛[5]等疾病有較好的療效。處方中豆蔻、肉桂、蓽茇均含有揮發(fā)性成分[6-14]，其中桉油精具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、神經(jīng)保護(hù)等作用[15]；桂皮醛具有抗炎、抗腫瘤、抗菌等作用[16]；胡椒堿具有鎮(zhèn)痛、抗炎、解痙等作用[17]。

目前，全國(guó)生產(chǎn)石榴健胃丸（片、散）的藏藥生產(chǎn)廠家有8家，對(duì)于石榴健胃制劑的定性和定量分析，各現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)參差不齊，難以全面評(píng)價(jià)該制劑的質(zhì)量。本文將采用薄層色譜鑒別法（TLC）和氣相色譜法（GC）對(duì)方中豆蔻、肉桂、蓽茇進(jìn)行定性鑒別和定量研究，建立石榴健胃制劑的定性定量方法，以期完善和提升石榴健胃制劑標(biāo)準(zhǔn)，全面控制制劑質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器

薄層點(diǎn)樣和成像系統(tǒng)（瑞士CAMAG公司）；7890B型氣相色譜儀（Agilent科技有限公司）；AR5120型百分之一電子天平（上海OHAUS公司）；SQP型萬分之一電子天平、MSA225-ICEDI型十萬分之一電子天平（德國(guó)Sartrious公司）；DT1028CH型超聲波提取器（德國(guó)BANDELIN公司）；Milli-Q advantage A10超純水系統(tǒng)（Merck millipore）；硅膠板（青島海洋化工廠/默克公司）。

1.2 試藥

對(duì)照藥材肉桂（批號(hào)：121363-201703）、蓽茇（批號(hào)：121023-201103）；對(duì)照品桉油精（批號(hào)：110788-201105，純度：99.9%）、桂皮醛（批號(hào)：110710-202022，純度：99.5%）、胡椒堿（批號(hào)：110775-201706，純度：98.9%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。石榴健胃制劑中石榴子（安石榴科植物石榴Punica granntumL.）、紅花（菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.）、肉桂（樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl）、蓽茇（胡椒科植物蓽茇Piper longumL.）、豆蔻（姜科植物白豆蔻Amomum kravanhPierreex Gagnep.）等藥材飲片（四川荷花池藥材市場(chǎng)，經(jīng)青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院藏藥檢測(cè)中心楊鳳梅主任藥師鑒定）。石榴健胃制劑共26個(gè)批次，來自青海、甘肅、西藏自治區(qū)的5家生產(chǎn)企業(yè)，均為市售藥品（見表1）。

表1 石榴健胃制劑樣品信息Tab 1 Sample information of Shiliu Jianwei preparation

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜對(duì)肉桂、蓽茇的鑒別

2.1.1 豆蔻鑒別 取石榴健胃丸、片適量，研細(xì)，稱取5 g；石榴健胃散稱取5 g，加入300 mL的水，揮發(fā)油提取器加水至3 mL，加入2 mL正己烷，連接回流冷凝管，加熱至微沸繼續(xù)加熱3 h，放冷，取正己烷液，通過鋪有無水硫酸鈉約1 g的漏斗過濾，收集濾液，揮發(fā)油測(cè)定器內(nèi)壁用2 mL正己烷洗滌，洗液合并濾液，搖勻，濾過，濾液作為供試品溶液；取豆蔻對(duì)照藥材5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取桉油精對(duì)照品，加正己烷制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；按石榴健胃丸的處方和工藝制備缺豆蔻的陰性樣品5 g，并按供試品溶液方法制成陰性樣品溶液。按2020年版《中國(guó)藥典》四部TLC法，吸取供試品溶液10 μL，對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液各1 μL，陰性樣品溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯（15∶5∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下立即檢視。供試品色譜中，在與豆蔻對(duì)照藥材、桉油精對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾，結(jié)果見圖1。

圖1 豆蔻薄層色譜圖Fig 1 TLC chromatogram of Cardamom

2.1.2 肉桂鑒別 取石榴健胃丸、片適量，研細(xì)，稱取3 g；石榴健胃散稱取3 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液作為供試品溶液；取肉桂對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取桂皮醛對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對(duì)照品溶液；按石榴健胃丸的處方和工藝制備缺肉桂的陰性樣品3 g，并按供試品溶液方法制成陰性樣品溶液。按2020年版《中國(guó)藥典》四部TLC法，吸取供試品溶液10 μL，對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液各2 μL，陰性樣品溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（17∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴二硝基苯肼乙醇試液，置日光燈下檢視。供試品色譜中，在與肉桂對(duì)照藥材、桂皮醛對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾，結(jié)果見圖2。

圖2 肉桂薄層色譜圖Fig 2 TLC chromatogram of Cinnamon

2.1.3 蓽茇鑒別 取石榴健胃丸、片適量，研細(xì)，稱取3 g；石榴健胃散稱取3 g，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾液濃縮至2 mL，作為供試品溶液；取蓽茇對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取胡椒堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；按石榴健胃丸的處方和工藝制備缺蓽茇的陰性樣品3 g，并按供試品溶液方法制成陰性樣品溶液。按2020年版《中國(guó)藥典》四部TLC法，吸取上述4種溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（3∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與蓽茇對(duì)照藥材、胡椒堿對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾，結(jié)果見圖3。

圖3 蓽茇薄層色譜圖Fig 3 TLC chromatogram of Cubeb longum

2.2 制劑中桉油精、桂皮醛、胡椒堿的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent DB-5毛細(xì)管柱（30 m×0.250 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：230℃；分流比20∶1；檢測(cè)器（FID）溫度：250℃；流量控制模式：恒流模式；載氣（氮?dú)猓?0 mL·min-1；氫氣：40 mL·min-1；空氣：400 mL·min-1；流量：1.0 mL·min-1；柱溫為程序升溫，初始溫度：50℃，保持10 min；以5℃·min-1的速率升溫至180℃，保持30 min；再以5℃·min-1的速率升溫至240℃，保持30 min。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取桉油精59.13 mg、桂皮醛458.19 mg、胡椒堿31.34 mg分別置于25、50、10 mL棕色量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度，即得約含桉油精2.36 mg·mL-1、桂皮醛9.12 mg·mL-1和胡椒堿3.10 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取上述各對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、0.3、2.0 mL置于10 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，即得混合對(duì)照品溶液（含桉油精0.12 mg·mL-1，桂皮醛0.27 mg·mL-1，胡椒堿0.62 mg·mL-1）。

2.2.3 供試品溶液的制備 取石榴健胃丸適量，研細(xì)，稱取5.0 g；石榴健胃片20片，研細(xì)，稱取5.0 g；石榴健胃散稱取5.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入無水乙醇20 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用無水乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按石榴健胃制劑處方比，分別取缺豆蔻、缺肉桂、缺蓽茇陰性樣品，依照“2.2.3”項(xiàng)下方法，分別制備得缺豆蔻、缺肉桂、缺蓽茇的陰性樣品溶液，備用。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品、供試品及陰性樣品溶液進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中，在桉油精、桂皮醛、胡椒堿混合對(duì)照品色譜峰相應(yīng)位置上有相同保留時(shí)間色譜峰，且陰性樣品無干擾，見圖4。

圖4 石榴健胃制劑的氣相色譜圖Fig 4 Gas chromatogram of Shiliu Jianwei preparation

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取不同量的桉油精（2.36 mg·mL-1）、桂皮醛（9.12 mg·mL-1）、胡椒堿（3.10 mg·mL-1）對(duì)照品儲(chǔ)備液置10 mL棕色量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，搖勻，即得各系列濃度的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析，記錄對(duì)應(yīng)的峰面積。待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得到3種成分的線性關(guān)系，結(jié)果見表2。

2.2.7 檢測(cè)限與定量限 取混合對(duì)照溶液，按逐步稀釋法，按信噪比3∶1、10∶1分別測(cè)得各成分的檢測(cè)限和定量限，見表2。

表2 桉油精、桂皮醛和胡椒堿線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 2 Linearity of eucalyptol，cinnamaldehyde and piperine

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（S17），分別在0、2、4、10、18及24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明供試品中桉油精、胡椒堿在24 h內(nèi)均穩(wěn)定性良好，其峰面積RSD值分別為0.67%、0.95%；桂皮醛在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，峰面積RSD為0.62%。

2.2.9 精密度試驗(yàn) 精密吸取含桉油精（0.12 mg·mL-1）、桂皮醛（0.27 mg·mL-1）、胡椒堿（0.62 mg·mL-1）的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算桉油精、桂皮醛、胡椒堿峰面積的RSD值分別為1.4%、0.84%及0.61%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.10 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品（S17），精密稱取6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定桉油精、桂皮醛、胡椒堿的含量的平均值分別為0.24、0.39、1.51 mg·g-1，RSD值分別為1.4%、0.89%、0.20%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.2.11 回收試驗(yàn) 取已知含量樣品（S17）6份，精密加入無水乙醇配制的桉油精（120.126 μg·mL-1）、桂皮醛（195.09 μg·mL-1）、胡椒堿（740.07 μg·mL-1）的混合對(duì)照品溶液5 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算平均回收率分別為99.42%、100.03%、99.79%，RSD值分別為1.4%、0.82%、0.30%。

2.2.12 樣品含量測(cè)定 將26批樣品按照“2.2.2”方法制成供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，分別計(jì)算桉油精、桂皮醛、胡椒堿的含量，結(jié)果見表3。

2.3 限度確定

依據(jù)表3測(cè)定結(jié)果并參照《中國(guó)藥典》2020年版一部對(duì)豆蔻、肉桂、蓽茇中桉油精、桂皮醛、胡椒堿含量限度要求[規(guī)定桉油精（豆蔻）不得低于3.0%；桂皮醛（肉桂）不得低于1.5%；胡椒堿（蓽茇）不得低于2.5%]，同時(shí)考慮到3種成分均為揮發(fā)性成分，生產(chǎn)工藝中對(duì)溫度較為敏感。將桉油精的轉(zhuǎn)化率10%、桂皮醛的轉(zhuǎn)化率20%、胡椒堿的轉(zhuǎn)化率75%計(jì)算，則石榴健胃制劑中桉油精含量不得少于0.11 mg·g-1，桂皮醛含量不得少于0.20 mg·g-1，胡椒堿含量不得少于0.85 mg·g-1。

表3 石榴健胃制劑中桉油精、桂皮醛、胡椒堿含量測(cè)定結(jié)果(mg·g-1)Tab 3 Determination of eucalyptol，cinnamaldehyde and piperine in Shiliu Jianwei preparation (mg·g-1)

3 討論

3.1 定性鑒別方法的選擇

曾對(duì)各現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)薄層鑒別方法結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)各現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)存在著斑點(diǎn)Rf值過高、不清晰、專屬性不強(qiáng)等問題。為此課題組對(duì)展開劑、提取方法等進(jìn)行了考察，對(duì)肉桂、蓽茇分別選用了無水乙醇、乙醇及甲醇作為提取溶劑，選用超聲30 min、20 min，振搖20 min、30 min的提取方法進(jìn)行綜合交叉考察；豆蔻展開劑采用石油醚-乙酸乙酯（4∶1）、甲苯-乙酸乙酯（9∶1）等，肉桂展開劑采用石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（17∶3）及乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇（7∶2∶3∶0.4）進(jìn)行了考察；結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用本文方法可得到斑點(diǎn)清晰、分離度較好、專屬性較強(qiáng)的結(jié)果。

3.2 供試品溶液提取條件選擇

考察了超聲、加熱回流等不同提取方法進(jìn)行提取，結(jié)果超聲提取效果最好。同時(shí)對(duì)提取溶劑（正己烷、無水乙醇）、超聲時(shí)間（20、30、40 min）、取樣量（2、3、5 g）進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，取5 g樣品加無水乙醇超聲30 min效果最好。

3.3 樣品質(zhì)量評(píng)價(jià)

根據(jù)化學(xué)成分限度、檢測(cè)結(jié)果及前期對(duì)企業(yè)問卷調(diào)查和實(shí)地調(diào)研，對(duì)比各企業(yè)生產(chǎn)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)E企業(yè)產(chǎn)品干燥溫度為80℃，而其他企業(yè)產(chǎn)品干燥溫度均≤60℃，這表明部分生產(chǎn)企業(yè)在質(zhì)量控制方面存在一定差異。造成這種差異的原因是原藥材質(zhì)量參差不齊或生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定。為了加強(qiáng)石榴健胃制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，需加強(qiáng)對(duì)其中豆蔻、肉桂、蓽茇等藥材的質(zhì)量控制；還需考察生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，設(shè)置合理生產(chǎn)工藝參數(shù)。

3.4 小結(jié)

綜上，本研究在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，對(duì)豆蔻、肉桂、蓽茇的TLC鑒定方法進(jìn)行了提升，建立了可同時(shí)測(cè)定石榴健胃制劑中桉油精、桂皮醛、胡椒堿含量的新方法，以便提高對(duì)豆蔻、肉桂、蓽茇等揮發(fā)性藥味在制劑中的質(zhì)量均一性。本方法具有較好的精密度和準(zhǔn)確度，可以為藏成藥石榴健胃制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)及標(biāo)準(zhǔn)制訂提供依據(jù)。